引用本文： 刘雨微, 成亮, 朱剑熹, 杨程, 肖凯, 罗伟, 高曙光, 李康华. ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达及临床病理意义. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(5): 590-594. doi: 10.7507/1002-1892.20150128 复制
ErbB3属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶的ErbB受体家族，是在肿瘤发生发展中最重要的受体家族之一[1]。研究已证实ErbB2与肿瘤患者不良预后有关，而ErbB2过表达的细胞中ErbB3表达升高[2]。此外，在乳腺癌的研究中亦发现Flotillin与ErbB2成正相关 [3]。Flotillin包括Flotillin-1和Flotillin-2[4]，其不仅参与各种细胞进程[5]，也与一些肿瘤的形成过程密切相关[6]。Asp等[7]研究发现在乳腺癌细胞系中，Flotillin消耗会引起ErbB3蛋白水平下调。而且，Flotillin缺失会导致ErbB2-ErbB3信号复合物减少，这在人类癌细胞信号通路中具有关键作用。
Jullien等[8]报道在体外骨肉瘤细胞系中ErbB3表达缺失可以降低骨肉瘤细胞增殖和肿瘤生长，但该研究未进一步探究其与临床指标的相关性。在骨肉瘤组织中Flotillin-2是否异常表达，以及ErbB3和Flotillin-2间有无关联，尚缺少相关研究。因此，本研究通过观测骨肉瘤与骨软骨瘤患者病理组织中ErbB3和Flotillin-2的表达差异，分析二者在骨肉瘤中的标志性意义及相关性，同时明确其与骨肉瘤临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 实验标本
将2009年9月－2014年3月中南大学湘雅医院收治的38例骨肉瘤患者纳入研究。男24例，女14例；年龄9～60岁，中位年龄17岁。根据肿瘤侵袭的侵向性，以14岁为界[9]，＞14岁27例、≤14岁11例。肿瘤部位：股骨24例，胫腓骨9例，其他5例。肿瘤大小以8 cm为界[9]，＞8 cm 17例、≤8 cm 21例。根据美国国立综合癌症网络（NCCN）指南骨肉瘤外科分期标准，Ⅰ/ⅡA期18例，ⅡB/Ⅲ期20例。伴肺转移18例。患者获随访6～60个月，中位时间34个月。随访期间22例患者因骨肉瘤死亡。全组患者总生存期（overall survival，OS）6～40个月，平均14.26个月。取样本组织切片（中南大学湘雅医院病理科）用于ErbB3和Flotillin-2的染色。以同时间段收治的13例骨软骨瘤患者作为对照。本研究通过中南大学湘雅医院伦理委员会审查批准。
1.2 实验方法
取肿瘤细胞特征明显且包埋较好的蜡块行2.5 μm厚连续切片。使用SABC法进行免疫组织化学染色。病理切片经脱蜡复水，在柠檬酸钠水浴（95℃）中抗原修复20 min，冷却至室温后H2O2孵育10 min，用10%山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司）封闭30 min。骨肉瘤组织滴加兔抗人单克隆抗ErbB3抗体（1∶100；CST公司，美国）或兔抗人多克隆抗Flotillin-2抗体（1∶100；Abcam公司，英国），37℃恒温箱孵育80 min；骨软骨瘤组织滴加PBS代替一抗，PBS漂洗后加二抗孵育。经化学染色后，脱水封片。所有标本由2位病理医生独立诊断染色在细胞核或细胞质/细胞膜。每张切片上随机观察5个高倍视野（×400），根据以下标准评分[10]：① 阳性肿瘤细胞百分比：1分，1%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。② 细胞质染色强度：0分，无色；1分，淡黄色；2分，棕色；3 分，褐色。③ 细胞膜染色存在或缺失：0分，缺失；1分，存在。3项总分≥5分为免疫染色阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达比较采用Fisher确切概率法。分类变量（性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、临床分期、肺转移）与ErbB3和Flotillin-2表达的相关性分析采用成组χ2检验，ErbB3和Flotillin-2之间的关联性采用配对χ2检验，生存分析使用log-rank检验和Cox回归分析法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达
镜下观察示，ErbB3、Flotillin-2蛋白均在骨肉瘤组织细胞质中高表达，在骨软骨瘤组织中低表达（图 1）。骨肉瘤中ErbB3和Flotillin-2阳性率分别为68.4%（26/38）和73.7%（28/38），均显著高于骨软骨瘤中[分别为15.4%（2/13）和23.1%（3/13）]，比较差异均有统计学意义（P=0.001；P=0.002）。
图1
ErbB3和Flotillin-2免疫组织化学染色观察（SABC×400） ⓐ 骨肉瘤中ErbB3过表达（箭头） ⓑ 骨软骨瘤中ErbB3阴性表达 ⓒ 骨肉瘤中Flotillin-2过表达（箭头） ⓓ 骨软骨瘤中Flotillin-2阴性表达
Figure1.
The immunohistochemical staining of ErbB3 and Flotillin-2 (SABC×400) ⓐ High expression of ErbB3 in osteosarcoma (arrow) ⓑ No expression of ErbB3 in osteochondroma ⓒ High expression of Flotillin-2 in osteosarcoma (arrow) ⓓ No expression of Flotillin-2 in osteochondroma
2.2 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表达的相关性
χ2检验显示，ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达具有较好的一致性（Kappa值=0.434），有统计学意义（P=0.000）。见表 1。
表1
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表达的关系
Table1.
The correlation between ErbB3 and Flotillin-2 expression in osteosarcoma
2.3 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达影响因素分析
ErbB3在骨肉瘤中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无相关（P＞0.05），与临床分期及肺转移相关（P＜0.05）。而Flotillin-2在骨肉瘤中的表达与以上因素均无相关（P＞0.05）。见表 2。
表2
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达与临床病理因素的关系
Table2.
The expressions of ErbB3 and Flotillin-2 in osteosarcoma and its relationship with clinical pathological characteristics
2.4 骨肉瘤患者OS影响因素分析
影响骨肉瘤患者OS的因素包括骨肉瘤临床分期、肺转移、ErbB3表达阳性及肿瘤大小（P＜0.05），其他临床特征对骨肉瘤患者OS的影响均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。将单因素分析中对骨肉瘤患者OS的影响有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归分析，结果表明OS的独立影响因素是肺转移和ErbB3表达阳性（P＜0.05）。见表 4。
表3
OS的单因素回归分析
Table3.
Single factor regression analysis of overall survival
表4
OS的多因素回归分析
Table4.
Cox regression analysis of overall survival
3 讨论
本研究结果显示，骨肉瘤组织中ErbB3蛋白表达阳性率显著高于骨软骨瘤中，骨肉瘤组织中ErbB3在ⅡB/Ⅲ期患者中表达较高；ErbB3的过表达伴随骨肉瘤肺转移升高；ErbB3过表达的患者OS较低。这些数据进一步证实ErbB3在骨肉瘤患者中过表达，同时提示ErbB3过表达与患者、肿瘤恶性程度、侵袭及患者预后有关。
文献报道，骨肉瘤细胞的产生是机体对细胞生长和分化调节失控的结果[11]。骨肉瘤细胞侵袭力会导致预后不良和患者生存率降低[12-13]。因此，减少骨肉瘤细胞对正常组织的侵袭力对降低肿瘤侵扰尤为重要。明确骨肉瘤细胞生长调节异常的分子机制能为研究靶向治疗方法奠定基础。关于ErbB2在骨肉瘤的表达已有报道[11]，但关于ErbB3表达的报道较少。研究表明ErbB3能够通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞运动和侵袭[14-15]。另一细胞通路机制可能涉及分泌ErbB3亚型，增强癌细胞对软组织的侵袭力[16-17]。值得注意的是，ErbB3的活性和功能依赖于其与ErbB2的相互作用[18]。ErbB3与ErbB2结合后，激活PI3K/Akt信号通路和肿瘤形成[19]。
ErbB3除了与ErbB2相互作用外，还可被其他信号分子激活。研究表明，Flotillins缺失干扰表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）聚集[20]和EGFR磷酸化[21]，从而影响下游信号级联反应。Zhu等[22]报道在胃癌组织中Flotillin-2与ErbB2表达成正相关性。Asp等[7]在一系列乳腺癌细胞中发现Flotillin缺失会引发ErbB2和ErbB3受体的降解。本研究结果与该发现一致，提示Flotillins可能是ErbB在多种癌症类型中表达水平的关键调节阀。ErbB2-ErbB3受体复合物的激活导致了多种效应器的磷酸化，主要激活MAPK和Akt通路[23-24]。Flotillin-2的缺失导致了Akt和MAPK磷酸化水平显著降低，而Flotillin-1缺失则无此效果[7]。因此，Flotillin-2对Akt和MAPK信号通路是否具有附加调节作用，仍需进一步实验证实。
综上述，本研究初步证明了Flotillin-2在骨肉瘤组织中过表达，且与ErbB3的表达成正相关，其具体作用机制需进一步实验。提示Flotillins可能作为降低ErbB3的靶向蛋白，为治疗肿瘤生长和转移提供新的治疗策略。
ErbB3属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶的ErbB受体家族，是在肿瘤发生发展中最重要的受体家族之一[1]。研究已证实ErbB2与肿瘤患者不良预后有关，而ErbB2过表达的细胞中ErbB3表达升高[2]。此外，在乳腺癌的研究中亦发现Flotillin与ErbB2成正相关 [3]。Flotillin包括Flotillin-1和Flotillin-2[4]，其不仅参与各种细胞进程[5]，也与一些肿瘤的形成过程密切相关[6]。Asp等[7]研究发现在乳腺癌细胞系中，Flotillin消耗会引起ErbB3蛋白水平下调。而且，Flotillin缺失会导致ErbB2-ErbB3信号复合物减少，这在人类癌细胞信号通路中具有关键作用。
Jullien等[8]报道在体外骨肉瘤细胞系中ErbB3表达缺失可以降低骨肉瘤细胞增殖和肿瘤生长，但该研究未进一步探究其与临床指标的相关性。在骨肉瘤组织中Flotillin-2是否异常表达，以及ErbB3和Flotillin-2间有无关联，尚缺少相关研究。因此，本研究通过观测骨肉瘤与骨软骨瘤患者病理组织中ErbB3和Flotillin-2的表达差异，分析二者在骨肉瘤中的标志性意义及相关性，同时明确其与骨肉瘤临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 实验标本
将2009年9月－2014年3月中南大学湘雅医院收治的38例骨肉瘤患者纳入研究。男24例，女14例；年龄9～60岁，中位年龄17岁。根据肿瘤侵袭的侵向性，以14岁为界[9]，＞14岁27例、≤14岁11例。肿瘤部位：股骨24例，胫腓骨9例，其他5例。肿瘤大小以8 cm为界[9]，＞8 cm 17例、≤8 cm 21例。根据美国国立综合癌症网络（NCCN）指南骨肉瘤外科分期标准，Ⅰ/ⅡA期18例，ⅡB/Ⅲ期20例。伴肺转移18例。患者获随访6～60个月，中位时间34个月。随访期间22例患者因骨肉瘤死亡。全组患者总生存期（overall survival，OS）6～40个月，平均14.26个月。取样本组织切片（中南大学湘雅医院病理科）用于ErbB3和Flotillin-2的染色。以同时间段收治的13例骨软骨瘤患者作为对照。本研究通过中南大学湘雅医院伦理委员会审查批准。
1.2 实验方法
取肿瘤细胞特征明显且包埋较好的蜡块行2.5 μm厚连续切片。使用SABC法进行免疫组织化学染色。病理切片经脱蜡复水，在柠檬酸钠水浴（95℃）中抗原修复20 min，冷却至室温后H2O2孵育10 min，用10%山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司）封闭30 min。骨肉瘤组织滴加兔抗人单克隆抗ErbB3抗体（1∶100；CST公司，美国）或兔抗人多克隆抗Flotillin-2抗体（1∶100；Abcam公司，英国），37℃恒温箱孵育80 min；骨软骨瘤组织滴加PBS代替一抗，PBS漂洗后加二抗孵育。经化学染色后，脱水封片。所有标本由2位病理医生独立诊断染色在细胞核或细胞质/细胞膜。每张切片上随机观察5个高倍视野（×400），根据以下标准评分[10]：① 阳性肿瘤细胞百分比：1分，1%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。② 细胞质染色强度：0分，无色；1分，淡黄色；2分，棕色；3 分，褐色。③ 细胞膜染色存在或缺失：0分，缺失；1分，存在。3项总分≥5分为免疫染色阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达比较采用Fisher确切概率法。分类变量（性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、临床分期、肺转移）与ErbB3和Flotillin-2表达的相关性分析采用成组χ2检验，ErbB3和Flotillin-2之间的关联性采用配对χ2检验，生存分析使用log-rank检验和Cox回归分析法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达
镜下观察示，ErbB3、Flotillin-2蛋白均在骨肉瘤组织细胞质中高表达，在骨软骨瘤组织中低表达（图 1）。骨肉瘤中ErbB3和Flotillin-2阳性率分别为68.4%（26/38）和73.7%（28/38），均显著高于骨软骨瘤中[分别为15.4%（2/13）和23.1%（3/13）]，比较差异均有统计学意义（P=0.001；P=0.002）。
图1
ErbB3和Flotillin-2免疫组织化学染色观察（SABC×400） ⓐ 骨肉瘤中ErbB3过表达（箭头） ⓑ 骨软骨瘤中ErbB3阴性表达 ⓒ 骨肉瘤中Flotillin-2过表达（箭头） ⓓ 骨软骨瘤中Flotillin-2阴性表达
Figure1.
The immunohistochemical staining of ErbB3 and Flotillin-2 (SABC×400) ⓐ High expression of ErbB3 in osteosarcoma (arrow) ⓑ No expression of ErbB3 in osteochondroma ⓒ High expression of Flotillin-2 in osteosarcoma (arrow) ⓓ No expression of Flotillin-2 in osteochondroma
2.2 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表达的相关性
χ2检验显示，ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达具有较好的一致性（Kappa值=0.434），有统计学意义（P=0.000）。见表 1。
表1
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中表达的关系
Table1.
The correlation between ErbB3 and Flotillin-2 expression in osteosarcoma
2.3 ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达影响因素分析
ErbB3在骨肉瘤中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无相关（P＞0.05），与临床分期及肺转移相关（P＜0.05）。而Flotillin-2在骨肉瘤中的表达与以上因素均无相关（P＞0.05）。见表 2。
表2
ErbB3和Flotillin-2在骨肉瘤中的表达与临床病理因素的关系
Table2.
The expressions of ErbB3 and Flotillin-2 in osteosarcoma and its relationship with clinical pathological characteristics
2.4 骨肉瘤患者OS影响因素分析
影响骨肉瘤患者OS的因素包括骨肉瘤临床分期、肺转移、ErbB3表达阳性及肿瘤大小（P＜0.05），其他临床特征对骨肉瘤患者OS的影响均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。将单因素分析中对骨肉瘤患者OS的影响有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归分析，结果表明OS的独立影响因素是肺转移和ErbB3表达阳性（P＜0.05）。见表 4。
表3
OS的单因素回归分析
Table3.
Single factor regression analysis of overall survival
表4
OS的多因素回归分析
Table4.
Cox regression analysis of overall survival
3 讨论
本研究结果显示，骨肉瘤组织中ErbB3蛋白表达阳性率显著高于骨软骨瘤中，骨肉瘤组织中ErbB3在ⅡB/Ⅲ期患者中表达较高；ErbB3的过表达伴随骨肉瘤肺转移升高；ErbB3过表达的患者OS较低。这些数据进一步证实ErbB3在骨肉瘤患者中过表达，同时提示ErbB3过表达与患者、肿瘤恶性程度、侵袭及患者预后有关。
文献报道，骨肉瘤细胞的产生是机体对细胞生长和分化调节失控的结果[11]。骨肉瘤细胞侵袭力会导致预后不良和患者生存率降低[12-13]。因此，减少骨肉瘤细胞对正常组织的侵袭力对降低肿瘤侵扰尤为重要。明确骨肉瘤细胞生长调节异常的分子机制能为研究靶向治疗方法奠定基础。关于ErbB2在骨肉瘤的表达已有报道[11]，但关于ErbB3表达的报道较少。研究表明ErbB3能够通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞运动和侵袭[14-15]。另一细胞通路机制可能涉及分泌ErbB3亚型，增强癌细胞对软组织的侵袭力[16-17]。值得注意的是，ErbB3的活性和功能依赖于其与ErbB2的相互作用[18]。ErbB3与ErbB2结合后，激活PI3K/Akt信号通路和肿瘤形成[19]。
ErbB3除了与ErbB2相互作用外，还可被其他信号分子激活。研究表明，Flotillins缺失干扰表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）聚集[20]和EGFR磷酸化[21]，从而影响下游信号级联反应。Zhu等[22]报道在胃癌组织中Flotillin-2与ErbB2表达成正相关性。Asp等[7]在一系列乳腺癌细胞中发现Flotillin缺失会引发ErbB2和ErbB3受体的降解。本研究结果与该发现一致，提示Flotillins可能是ErbB在多种癌症类型中表达水平的关键调节阀。ErbB2-ErbB3受体复合物的激活导致了多种效应器的磷酸化，主要激活MAPK和Akt通路[23-24]。Flotillin-2的缺失导致了Akt和MAPK磷酸化水平显著降低，而Flotillin-1缺失则无此效果[7]。因此，Flotillin-2对Akt和MAPK信号通路是否具有附加调节作用，仍需进一步实验证实。
综上述，本研究初步证明了Flotillin-2在骨肉瘤组织中过表达，且与ErbB3的表达成正相关，其具体作用机制需进一步实验。提示Flotillins可能作为降低ErbB3的靶向蛋白，为治疗肿瘤生长和转移提供新的治疗策略。
