引用本文： 陈颖, 王小燕, 赵光强, 雷玉洁, 叶联华, 黄秋博, 段万石, 黄云超. 聚氯乙烯材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(5): 609-614. doi: 10.7507/1002-1892.20150131 复制
病原菌生物膜是病原微生物在植入人体的生物材料表面黏附繁殖、分化并分泌胞外多聚基质形成的膜样物，是造成生物材料植入感染反复发生、难以控制的根本原因[1]。近年来由于抗生素滥用、癌症化疗和器官移植等新技术的应用，有免疫系统缺陷的人群数量逐渐增加[2]。此类人群除易受到细菌感染外，常合并以白色念珠菌为主的真菌感染[3-4]。研究提示，在27%～57%的白色念珠菌生物膜感染中可检出金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等细菌[5-7]。植入人体内的生物材料表面一旦形成混合生物膜，即便长期、联和使用抗生素与抗真菌药物，仍无法达到较好效果，其死亡率为单一病原微生物感染的2倍，对于免疫功能低下的患者甚至可达到80%，临床治疗极为困难[5, 8]。
目前对单一病原菌生物膜的研究较多，对于两种或多种病原微生物形成的混合生物膜结构、膜内菌种分布、菌种之间相互作用及其可能致病机制方面的研究较少。为此，本研究以聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）膜为载体，建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型，观察生物材料表面混合生物膜的形成与微观结构，为生物材料植入所致混合病原菌感染的防治研究提供实验模型。
1 材料与方法
1.1 实验菌种及主要试剂、仪器
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984（RP62A）、白色念珠菌标准株ATCC10231，均购自中国科学院微生物研究所。PVC膜（广东东莞科威医疗器械有限公司），用打孔器将PVC膜制成直径0.5 cm的圆片，甲醛熏蒸24 h灭菌备用。Live/Dead@ BacLightTM Bacterial Viability Kit 7017（Invitrogen公司，美国）；聚丙烯24孔细胞培养板（Corning公司，美国）；MH琼脂平板、沙保罗琼脂平板（郑州图安生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（杭州微生物试剂有限公司）。EYOLS10扫描电镜（Carl Zeiss公司，德国）；FV1000激光共聚焦显微镜、FV1000-ASW2.1软件（Olympus公司，日本）。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌悬液制备
将表皮葡萄球菌接种于MH琼脂平板，白色念珠菌接种于沙保罗琼脂平板，36℃恒温培养箱培养24 h。挑取单个菌落，分别接种至5 mL TSB培养基中，将试管放入恒温振荡器中，于36℃、180 r/min培养12～16 h，采用平板菌落计数法，用TSB培养基调整2种细菌悬液浓度为1×106 CFU/ mL，即配即用。
1.2.2 生物膜制备
实验分为两组，取聚丙烯24孔细胞培养板，实验组每孔依次加入TSB培养基1 600 µL、PVC膜、表皮葡萄球菌悬液与白色念珠菌悬液各200 μL（接种初始菌液量约为1×105 CFU），共计42孔；对照组每孔依次加入TSB培养基2 000 µL与PVC膜，共计12孔。于37℃恒温箱内培养，2、6、12、24、48、72 h时取PVC膜，实验组各时间点分别取出7片，其中5片用于激光共聚焦显微镜观测，另2片用于扫描电镜观察；对照组分别取2 片，各1片用于扫描电镜及激光共聚焦显微镜观测。
1.3 观测指标
1.3.1 激光共聚焦显微镜观测并三维图像重建
按照Live/Dead® BaclightTM Bacterial Viability Kit 7017说明书，配制活/死细菌荧光染色剂。将PVC膜用生理盐水冲洗3次，加入活/死细菌荧光染色剂，于常温下避光染色20 min。激光共聚焦显微镜观察条件为氩激光（514 nm/488 nm），镜下观察细菌菌落数并对生物膜厚度进行逐层扫描测量。实验组各PVC 膜随机取1个视野（×100倍），计数单位视野细菌菌落数；每个视野（×200倍）随机取1个菌落由内向外，按照层厚1 μm、分辨率1 024进行逐层扫描，测量生物膜厚度。计算培养48 h时生物膜各层活菌百分比：对获取的断层图像由内向外进行编号1、2、3……N，测量N×20%(生物膜内层）、N×50%(生物膜中间层）、N×80%(生物膜外层）处活菌绿色荧光与死菌红色荧光所占面积，按以下公式计算活菌百分比：活菌面积 /(活菌面积+死菌面积)×100%。
将获取的实验组各时间点混合生物膜连续断层荧光图像，以内层向外层方向为Z轴，使用FV1000-ASW2.1软件以Z轴方向叠加，获取重建的生物膜表面三维图像，按照图像中活菌与死菌面积，同上法计算各时间点三维重建生物膜表面活菌百分比。
1.3.2 扫描电镜观察
将PVC膜用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（pH7）冲洗3次，4%戊二醛固定于扫描电镜载物台上，PBS冲洗3次，CO2临界干燥，离子溅射表面固定镀膜致PVC膜表面成金黄色，扫描电镜观察混合生物膜表面结构。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.3统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 激光共聚焦显微镜观测
激光共聚焦显微镜观察示，各时间点对照组PVC膜表面均呈低强度黑绿色荧光，光感均一，无病原菌显色。见图 1。
图1
对照组培养48 h共聚焦激光显微镜观察（×200） 图 2 实验组各时间点PVC膜菌落计数 图 3 实验组各时间点生物膜厚度 图 4 实验组培养48 h生物膜连续断层荧光图像（激光共聚焦显微镜×200） 红色：死菌绿色：活菌橙色：死活菌叠加图像 ⓐ 内层 ⓑ 中间层 ⓒ 外层 图 5 实验组培养48 h时PVC膜表面生物膜三维重建图像红色：死菌绿色：活菌橙色：死活菌叠加图像箭头示三维重建图像叠加方向 图 6 对照组培养48 h扫描电镜观察PVC膜表面（×1 500）
Figure1.
CLSM image of control group at 48 hours after culture (×200) Fig. 2 The colony count on PVC material in experimental group at different time after culture Fig. 3 The biofilm thickness in experimental group at different time after culture Fig. 4 Scanning picture of biofilm at 48 hours after culture in experimental group (CLSM×200) Red for dead bacteria,green for living bacteria,orange for the overlapping image of living and dead bacteria ⓐ Inner layer ⓑ Middle layer ⓒ Outer layer Fig. 5 Three-dimensional reconstruction image of biofilm in experimental group at 48 hours after culture Red for dead bacteria,green for living bacteria,orange for the overlapping image of living and dead bacteria Arrow indicated the stack direction of three-dimensional reconstruction Fig. 6 SEM image of PVC material in control group at 48 hours after culture (×1 500)
实验组培养2 h后PVC膜表面出现病原菌黏附，6 h时可见菌落及生物膜形成；随时间延长菌落及生物膜厚度均逐渐增加，24 h时菌落达高峰，镜下呈明显丘状突起；48 h时生物膜厚度达峰值，之后生物膜变薄。实验组PVC膜表面菌落数2、6、24 h间以及2、6 h与48、72 h间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；24、48、72 h间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。生物膜厚度除48、72 h间比较差异无统计学意义外（P＞0.05），其余各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
培养48 h连续断层荧光图像显示，实验组混合生物膜中存在一定比例死菌与活菌，且各层间活/死菌比例不同；生物膜中央较外周致密，团块间有基质，并被网状管道分隔（图 4）。生物膜由内向外活菌百分比逐渐升高，内层、中间层及外层活菌百分比分别为29.2%±2.1%、54.6%±3.1%、89.0%±2.6%，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
三维重建图像显示：PVC材料表面菌落数与生物膜厚度随培养时间延长而增加，共培养2～6 h时黏附的死、活菌比例相当；随培养时间延长，活菌比例上升明显，12 h时混合生物膜外层活菌比例超过90%；随时间推移，活菌比例逐渐下降，至72 h时活菌比例降至约50%。见图 5。培养2、6、12、24、48、72 h时生物膜表面活菌百分比分分别为52.0%±3.7%、50.0%±4.5%、94.0%±2.1%、84.0%±2.7%、76.0%±2.6%、53.0%±4.8%。2、6、72 h与12、24、48 h间比较生物膜表面活菌百分比，差异有统计学意义（P＜0.05）；12、24、48 h间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），2、6、72 h间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）
2.2 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，对照组各时间点PVC膜表面基本平整，部分位置存在不规则突起，未发现病原菌黏附。见图 6。
实验组随时间增加，PVC膜表面菌落由散在分布白色念珠菌孢子（椭圆形）与表皮葡萄球菌（小球形）菌落，逐渐聚集增厚，PVC表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状，呈3种形态混杂生长；表皮葡萄球菌黏附于白色念珠菌周围，呈团块状、层叠样混杂生长，形成多层次复杂的网状结构。48 h时形成成熟生物膜，生物膜外层以菌丝状白色念珠菌多见，其表面可见大量表皮葡萄球菌黏附，与主体生物膜连接不紧密，易脱落。72 h时可观察到生物膜表面部分菌体形态不完整，呈溶解状。见图 7。
图7
实验组各时间点扫描电镜观察PVC膜表面生物膜培养2 h（×1 000） ⓐ 培养2 h（×2 000） ⓑ 培养6 h（×1 000） ⓒ 培养6 h（×2 000） ⓓ 培养12 h（×1 000） ⓔ 培养12 h（×2 000） ⓕ 培养24 h（×1 000） ⓖ 培养24 h（×2 000） ⓗ 培养48 h（×1 000） ⓘ 培养48 h（×2 000） ⓙ 培养72 h（×1 000） ⓚ 培养72 h（×2 000）
Figure7.
SEM images on the surface of PVC material in experimental group at different time after culture At 2 hours (×1 000) ⓐ At 2 hours (×2 000) ⓑ At 6 hours (×1 000) ⓒ At 6 hours (×2 000) ⓓ At 12 hours (×1 000) ⓔ At 12 hours (×2 000) ⓕ At 24 hours (×1 000) ⓖ At 24 hours (×2 000) ⓗ At 48 hours (×1 000) ⓘ At 48 hours (×2 000) ⓙ At 72 hours (×1 000) ⓚ At 72 hours (×2 000)
3 讨论
3.1 混合生物膜形成过程
PVC材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成过程与单一病原菌生物膜形成过程相似[9]，主要分为初始黏附和聚集分泌细胞外黏质两个阶段。共培养早期（2～6 h），白色念珠菌与表皮葡萄球菌通过菌体表面多糖黏附素、甘露糖蛋白、疏水性蛋白等与生物材料表面发生界面效应，黏附于材料表面。一旦黏附完成，病原菌相互聚集形成菌落，随时间推移，病原菌厚度快速增加，大量黏液分泌包裹菌体，48 h时厚度达峰值，形成成熟生物膜。随着生物膜内微生物代谢及营养物质的消耗，生物膜主体开始收缩，并趋于稳定。48～72 h时，混合生物膜外层与主体连接不紧密，易出现脱落，生物膜主体中部分菌体可观察到固缩、崩解。但与单一菌种生物膜中病原菌呈单个浮游状态脱落方式[10]不同，本研究扫描电镜观察到混合生物膜外周与主体部分连接不紧密时，呈现以单个或数个菌丝形态白色念珠菌黏附多个表皮葡萄球菌的珠串形态，其脱离生物膜主体后可发生再次黏附，进入生物膜生长的下一周期循环。
3.2 混合生物膜结构
本研究激光共聚焦显微镜观察示，实验组培养48 h内生物膜厚度不一，差异有统计学意义。断层扫描荧光图像中可观察到成熟生物膜由死菌和活菌组成；生物膜中央较外周致密，团块间有基质，并被网状管道分隔；各层活菌比例不一，由内向外逐渐增高，外层明显高于内层。
三维重建图像可更直观地观察到：混合生物膜表面凹凸不平，突起部分以绿色活菌为主，突起间隙的低凹处红色死菌数量较多。在培养2～6 h时PVC材料表面黏附的死/活菌比例相当；随着培养时间增加，活菌比例上升明显；12 h时混合生物膜外层活菌比例超过90%；随时间推移，活菌比例逐渐下降，至72 h时活菌百分比降至53%。其原因可能是在混合生物膜形成早期，白色念珠菌与表皮葡萄球菌存在一定程度竞争作用，病原菌通过自身溶解、死亡，死亡菌体周围的DNA、蛋白质、多糖、脂质等物质有利于菌体自身在PVC材料表面的黏附和聚集，获得更有利于自身生长的微环境，在竞争生物材料表面黏附位点过程中获得相对有利的条件[11-12]。在黏附聚集完成后，菌体大量繁殖，生物膜中央区代谢产物相对较多，而通过管道系统得到的营养较少，中央区相对缺乏氧气的局部环境对内层细菌的生长也产生影响，造成部分区域细菌生长旺盛，PVC膜表面菌落呈丘状突起，而生物膜突起间的低凹间隙则成为混合生物膜内部病原菌获取自身营养、排除代谢物、维持自身稳定的重要通道。
对于生物膜的相关研究提示，培养环境（温度、湿度、酸碱度、营养物质等）、培养时间、病原菌种类以及黏附材料的类型表面特性等因素均能对生物膜的形成产生影响，特别是白色念珠菌对培养环境敏感，可由非致病的酵母型向致病的菌丝型转化[13]。本研究扫描电镜结果显示，随时间增加，PVC材料表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状，表皮葡萄球菌可黏附于各种形态的白色念珠菌周围，也可自身相互聚集与白色念珠菌的孢子、假菌丝和菌丝呈团块状层叠样混杂生长，白色念珠菌菌丝穿插于团块间形成多层次结构复杂的网状混合生物膜。生物膜外黏附表皮葡萄球菌的白色念珠菌菌丝易脱落，使内部存活病原菌得以解聚释放，继续播散，定植形成新的菌落。混合生物膜结构较单一病原菌生物膜复杂，对体内白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察发现[14-15]，混合生物膜结构与体外模型中相似，均为复杂的网状结构，但体内形成的混合生物膜更厚，且混合生物膜的网状结构可发现被白色念珠菌菌丝包绕的中性粒细胞与巨噬细胞，提示混合生物膜抵御机体免疫杀伤的能力更强。
3.3 混合生物膜结构观察方法
混合生物膜内部结构与胞外多聚基质较单一病原菌生物膜复杂。激光共聚焦显微镜可对完整自然水化状态的混合生物膜进行观察，无需对生物膜进行机械分离，不会对生物膜的胞外多聚基质及膜内病原菌造成破坏。生物膜的胞外多聚基质包括DNA、蛋白质、多糖、脂质等物质，它们相互凝集构成生物膜支架，对生物膜早期黏附、发展过程中物质的运输、抵御免疫杀伤及抗生素等起重要作用，这些多聚基质可使用相对应的荧光染料染色[16]，然后进行激光共聚焦显微镜观测。对于膜内不同种病原菌的区分，有学者通过荧光原位杂交技术，根据细菌16SrRNA或真菌18SrRNA的保守区，设计特异性荧光探针，对混合生物膜中不同菌种进行荧光标记[17]。结合连续断层扫描可获得生物膜不同层面菌种分布情况的断层图像，同时可测量生物膜的厚度、菌落数及菌体状态等情况。
虽然传统扫描电镜在制作生物膜标本过程中需对标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理，对生物膜结构和组分有一定影响，但扫描电镜分辨率高，可对生物膜表面单个病原微生物的形态与空间分布进行精细观察，在观察混合生物膜微观结构方面的优势明显 [18]。环境扫描电镜可对生活状态的细菌进行扫描，避免了对混合生物膜结构的破坏，可用于观察活化状态的混合生物膜，但因其样本检测时需非真空环境，其分辨率及敏感性较传统扫描电镜低[19]。在混合生物膜扫描电镜观察中，可根据需要选择不同的扫描电镜检测方式。同时结合图像三维重建技术，可将激光共聚焦显微镜或扫描电镜中对生物膜连续扫描的图像进行重建，以获得立体、直观的生物膜图像，便于生物膜的整体观察[20]。
因此，将共聚焦激光显微镜、扫描电镜与三维图像重建技术结合是研究混合生物膜的理想方法，可为防治细菌-真菌引发的生物材料植入感染后续研究提供帮助。
病原菌生物膜是病原微生物在植入人体的生物材料表面黏附繁殖、分化并分泌胞外多聚基质形成的膜样物，是造成生物材料植入感染反复发生、难以控制的根本原因[1]。近年来由于抗生素滥用、癌症化疗和器官移植等新技术的应用，有免疫系统缺陷的人群数量逐渐增加[2]。此类人群除易受到细菌感染外，常合并以白色念珠菌为主的真菌感染[3-4]。研究提示，在27%～57%的白色念珠菌生物膜感染中可检出金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等细菌[5-7]。植入人体内的生物材料表面一旦形成混合生物膜，即便长期、联和使用抗生素与抗真菌药物，仍无法达到较好效果，其死亡率为单一病原微生物感染的2倍，对于免疫功能低下的患者甚至可达到80%，临床治疗极为困难[5, 8]。
目前对单一病原菌生物膜的研究较多，对于两种或多种病原微生物形成的混合生物膜结构、膜内菌种分布、菌种之间相互作用及其可能致病机制方面的研究较少。为此，本研究以聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）膜为载体，建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型，观察生物材料表面混合生物膜的形成与微观结构，为生物材料植入所致混合病原菌感染的防治研究提供实验模型。
1 材料与方法
1.1 实验菌种及主要试剂、仪器
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984（RP62A）、白色念珠菌标准株ATCC10231，均购自中国科学院微生物研究所。PVC膜（广东东莞科威医疗器械有限公司），用打孔器将PVC膜制成直径0.5 cm的圆片，甲醛熏蒸24 h灭菌备用。Live/Dead@ BacLightTM Bacterial Viability Kit 7017（Invitrogen公司，美国）；聚丙烯24孔细胞培养板（Corning公司，美国）；MH琼脂平板、沙保罗琼脂平板（郑州图安生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（杭州微生物试剂有限公司）。EYOLS10扫描电镜（Carl Zeiss公司，德国）；FV1000激光共聚焦显微镜、FV1000-ASW2.1软件（Olympus公司，日本）。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌悬液制备
将表皮葡萄球菌接种于MH琼脂平板，白色念珠菌接种于沙保罗琼脂平板，36℃恒温培养箱培养24 h。挑取单个菌落，分别接种至5 mL TSB培养基中，将试管放入恒温振荡器中，于36℃、180 r/min培养12～16 h，采用平板菌落计数法，用TSB培养基调整2种细菌悬液浓度为1×106 CFU/ mL，即配即用。
1.2.2 生物膜制备
实验分为两组，取聚丙烯24孔细胞培养板，实验组每孔依次加入TSB培养基1 600 µL、PVC膜、表皮葡萄球菌悬液与白色念珠菌悬液各200 μL（接种初始菌液量约为1×105 CFU），共计42孔；对照组每孔依次加入TSB培养基2 000 µL与PVC膜，共计12孔。于37℃恒温箱内培养，2、6、12、24、48、72 h时取PVC膜，实验组各时间点分别取出7片，其中5片用于激光共聚焦显微镜观测，另2片用于扫描电镜观察；对照组分别取2 片，各1片用于扫描电镜及激光共聚焦显微镜观测。
1.3 观测指标
1.3.1 激光共聚焦显微镜观测并三维图像重建
按照Live/Dead® BaclightTM Bacterial Viability Kit 7017说明书，配制活/死细菌荧光染色剂。将PVC膜用生理盐水冲洗3次，加入活/死细菌荧光染色剂，于常温下避光染色20 min。激光共聚焦显微镜观察条件为氩激光（514 nm/488 nm），镜下观察细菌菌落数并对生物膜厚度进行逐层扫描测量。实验组各PVC 膜随机取1个视野（×100倍），计数单位视野细菌菌落数；每个视野（×200倍）随机取1个菌落由内向外，按照层厚1 μm、分辨率1 024进行逐层扫描，测量生物膜厚度。计算培养48 h时生物膜各层活菌百分比：对获取的断层图像由内向外进行编号1、2、3……N，测量N×20%(生物膜内层）、N×50%(生物膜中间层）、N×80%(生物膜外层）处活菌绿色荧光与死菌红色荧光所占面积，按以下公式计算活菌百分比：活菌面积 /(活菌面积+死菌面积)×100%。
将获取的实验组各时间点混合生物膜连续断层荧光图像，以内层向外层方向为Z轴，使用FV1000-ASW2.1软件以Z轴方向叠加，获取重建的生物膜表面三维图像，按照图像中活菌与死菌面积，同上法计算各时间点三维重建生物膜表面活菌百分比。
1.3.2 扫描电镜观察
将PVC膜用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（pH7）冲洗3次，4%戊二醛固定于扫描电镜载物台上，PBS冲洗3次，CO2临界干燥，离子溅射表面固定镀膜致PVC膜表面成金黄色，扫描电镜观察混合生物膜表面结构。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.3统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 激光共聚焦显微镜观测
激光共聚焦显微镜观察示，各时间点对照组PVC膜表面均呈低强度黑绿色荧光，光感均一，无病原菌显色。见图 1。
图1
对照组培养48 h共聚焦激光显微镜观察（×200） 图 2 实验组各时间点PVC膜菌落计数 图 3 实验组各时间点生物膜厚度 图 4 实验组培养48 h生物膜连续断层荧光图像（激光共聚焦显微镜×200） 红色：死菌绿色：活菌橙色：死活菌叠加图像 ⓐ 内层 ⓑ 中间层 ⓒ 外层 图 5 实验组培养48 h时PVC膜表面生物膜三维重建图像红色：死菌绿色：活菌橙色：死活菌叠加图像箭头示三维重建图像叠加方向 图 6 对照组培养48 h扫描电镜观察PVC膜表面（×1 500）
Figure1.
CLSM image of control group at 48 hours after culture (×200) Fig. 2 The colony count on PVC material in experimental group at different time after culture Fig. 3 The biofilm thickness in experimental group at different time after culture Fig. 4 Scanning picture of biofilm at 48 hours after culture in experimental group (CLSM×200) Red for dead bacteria,green for living bacteria,orange for the overlapping image of living and dead bacteria ⓐ Inner layer ⓑ Middle layer ⓒ Outer layer Fig. 5 Three-dimensional reconstruction image of biofilm in experimental group at 48 hours after culture Red for dead bacteria,green for living bacteria,orange for the overlapping image of living and dead bacteria Arrow indicated the stack direction of three-dimensional reconstruction Fig. 6 SEM image of PVC material in control group at 48 hours after culture (×1 500)
实验组培养2 h后PVC膜表面出现病原菌黏附，6 h时可见菌落及生物膜形成；随时间延长菌落及生物膜厚度均逐渐增加，24 h时菌落达高峰，镜下呈明显丘状突起；48 h时生物膜厚度达峰值，之后生物膜变薄。实验组PVC膜表面菌落数2、6、24 h间以及2、6 h与48、72 h间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；24、48、72 h间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。生物膜厚度除48、72 h间比较差异无统计学意义外（P＞0.05），其余各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
培养48 h连续断层荧光图像显示，实验组混合生物膜中存在一定比例死菌与活菌，且各层间活/死菌比例不同；生物膜中央较外周致密，团块间有基质，并被网状管道分隔（图 4）。生物膜由内向外活菌百分比逐渐升高，内层、中间层及外层活菌百分比分别为29.2%±2.1%、54.6%±3.1%、89.0%±2.6%，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
三维重建图像显示：PVC材料表面菌落数与生物膜厚度随培养时间延长而增加，共培养2～6 h时黏附的死、活菌比例相当；随培养时间延长，活菌比例上升明显，12 h时混合生物膜外层活菌比例超过90%；随时间推移，活菌比例逐渐下降，至72 h时活菌比例降至约50%。见图 5。培养2、6、12、24、48、72 h时生物膜表面活菌百分比分分别为52.0%±3.7%、50.0%±4.5%、94.0%±2.1%、84.0%±2.7%、76.0%±2.6%、53.0%±4.8%。2、6、72 h与12、24、48 h间比较生物膜表面活菌百分比，差异有统计学意义（P＜0.05）；12、24、48 h间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），2、6、72 h间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）
2.2 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，对照组各时间点PVC膜表面基本平整，部分位置存在不规则突起，未发现病原菌黏附。见图 6。
实验组随时间增加，PVC膜表面菌落由散在分布白色念珠菌孢子（椭圆形）与表皮葡萄球菌（小球形）菌落，逐渐聚集增厚，PVC表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状，呈3种形态混杂生长；表皮葡萄球菌黏附于白色念珠菌周围，呈团块状、层叠样混杂生长，形成多层次复杂的网状结构。48 h时形成成熟生物膜，生物膜外层以菌丝状白色念珠菌多见，其表面可见大量表皮葡萄球菌黏附，与主体生物膜连接不紧密，易脱落。72 h时可观察到生物膜表面部分菌体形态不完整，呈溶解状。见图 7。
图7
实验组各时间点扫描电镜观察PVC膜表面生物膜培养2 h（×1 000） ⓐ 培养2 h（×2 000） ⓑ 培养6 h（×1 000） ⓒ 培养6 h（×2 000） ⓓ 培养12 h（×1 000） ⓔ 培养12 h（×2 000） ⓕ 培养24 h（×1 000） ⓖ 培养24 h（×2 000） ⓗ 培养48 h（×1 000） ⓘ 培养48 h（×2 000） ⓙ 培养72 h（×1 000） ⓚ 培养72 h（×2 000）
Figure7.
SEM images on the surface of PVC material in experimental group at different time after culture At 2 hours (×1 000) ⓐ At 2 hours (×2 000) ⓑ At 6 hours (×1 000) ⓒ At 6 hours (×2 000) ⓓ At 12 hours (×1 000) ⓔ At 12 hours (×2 000) ⓕ At 24 hours (×1 000) ⓖ At 24 hours (×2 000) ⓗ At 48 hours (×1 000) ⓘ At 48 hours (×2 000) ⓙ At 72 hours (×1 000) ⓚ At 72 hours (×2 000)
3 讨论
3.1 混合生物膜形成过程
PVC材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成过程与单一病原菌生物膜形成过程相似[9]，主要分为初始黏附和聚集分泌细胞外黏质两个阶段。共培养早期（2～6 h），白色念珠菌与表皮葡萄球菌通过菌体表面多糖黏附素、甘露糖蛋白、疏水性蛋白等与生物材料表面发生界面效应，黏附于材料表面。一旦黏附完成，病原菌相互聚集形成菌落，随时间推移，病原菌厚度快速增加，大量黏液分泌包裹菌体，48 h时厚度达峰值，形成成熟生物膜。随着生物膜内微生物代谢及营养物质的消耗，生物膜主体开始收缩，并趋于稳定。48～72 h时，混合生物膜外层与主体连接不紧密，易出现脱落，生物膜主体中部分菌体可观察到固缩、崩解。但与单一菌种生物膜中病原菌呈单个浮游状态脱落方式[10]不同，本研究扫描电镜观察到混合生物膜外周与主体部分连接不紧密时，呈现以单个或数个菌丝形态白色念珠菌黏附多个表皮葡萄球菌的珠串形态，其脱离生物膜主体后可发生再次黏附，进入生物膜生长的下一周期循环。
3.2 混合生物膜结构
本研究激光共聚焦显微镜观察示，实验组培养48 h内生物膜厚度不一，差异有统计学意义。断层扫描荧光图像中可观察到成熟生物膜由死菌和活菌组成；生物膜中央较外周致密，团块间有基质，并被网状管道分隔；各层活菌比例不一，由内向外逐渐增高，外层明显高于内层。
三维重建图像可更直观地观察到：混合生物膜表面凹凸不平，突起部分以绿色活菌为主，突起间隙的低凹处红色死菌数量较多。在培养2～6 h时PVC材料表面黏附的死/活菌比例相当；随着培养时间增加，活菌比例上升明显；12 h时混合生物膜外层活菌比例超过90%；随时间推移，活菌比例逐渐下降，至72 h时活菌百分比降至53%。其原因可能是在混合生物膜形成早期，白色念珠菌与表皮葡萄球菌存在一定程度竞争作用，病原菌通过自身溶解、死亡，死亡菌体周围的DNA、蛋白质、多糖、脂质等物质有利于菌体自身在PVC材料表面的黏附和聚集，获得更有利于自身生长的微环境，在竞争生物材料表面黏附位点过程中获得相对有利的条件[11-12]。在黏附聚集完成后，菌体大量繁殖，生物膜中央区代谢产物相对较多，而通过管道系统得到的营养较少，中央区相对缺乏氧气的局部环境对内层细菌的生长也产生影响，造成部分区域细菌生长旺盛，PVC膜表面菌落呈丘状突起，而生物膜突起间的低凹间隙则成为混合生物膜内部病原菌获取自身营养、排除代谢物、维持自身稳定的重要通道。
对于生物膜的相关研究提示，培养环境（温度、湿度、酸碱度、营养物质等）、培养时间、病原菌种类以及黏附材料的类型表面特性等因素均能对生物膜的形成产生影响，特别是白色念珠菌对培养环境敏感，可由非致病的酵母型向致病的菌丝型转化[13]。本研究扫描电镜结果显示，随时间增加，PVC材料表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状，表皮葡萄球菌可黏附于各种形态的白色念珠菌周围，也可自身相互聚集与白色念珠菌的孢子、假菌丝和菌丝呈团块状层叠样混杂生长，白色念珠菌菌丝穿插于团块间形成多层次结构复杂的网状混合生物膜。生物膜外黏附表皮葡萄球菌的白色念珠菌菌丝易脱落，使内部存活病原菌得以解聚释放，继续播散，定植形成新的菌落。混合生物膜结构较单一病原菌生物膜复杂，对体内白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察发现[14-15]，混合生物膜结构与体外模型中相似，均为复杂的网状结构，但体内形成的混合生物膜更厚，且混合生物膜的网状结构可发现被白色念珠菌菌丝包绕的中性粒细胞与巨噬细胞，提示混合生物膜抵御机体免疫杀伤的能力更强。
3.3 混合生物膜结构观察方法
混合生物膜内部结构与胞外多聚基质较单一病原菌生物膜复杂。激光共聚焦显微镜可对完整自然水化状态的混合生物膜进行观察，无需对生物膜进行机械分离，不会对生物膜的胞外多聚基质及膜内病原菌造成破坏。生物膜的胞外多聚基质包括DNA、蛋白质、多糖、脂质等物质，它们相互凝集构成生物膜支架，对生物膜早期黏附、发展过程中物质的运输、抵御免疫杀伤及抗生素等起重要作用，这些多聚基质可使用相对应的荧光染料染色[16]，然后进行激光共聚焦显微镜观测。对于膜内不同种病原菌的区分，有学者通过荧光原位杂交技术，根据细菌16SrRNA或真菌18SrRNA的保守区，设计特异性荧光探针，对混合生物膜中不同菌种进行荧光标记[17]。结合连续断层扫描可获得生物膜不同层面菌种分布情况的断层图像，同时可测量生物膜的厚度、菌落数及菌体状态等情况。
虽然传统扫描电镜在制作生物膜标本过程中需对标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理，对生物膜结构和组分有一定影响，但扫描电镜分辨率高，可对生物膜表面单个病原微生物的形态与空间分布进行精细观察，在观察混合生物膜微观结构方面的优势明显 [18]。环境扫描电镜可对生活状态的细菌进行扫描，避免了对混合生物膜结构的破坏，可用于观察活化状态的混合生物膜，但因其样本检测时需非真空环境，其分辨率及敏感性较传统扫描电镜低[19]。在混合生物膜扫描电镜观察中，可根据需要选择不同的扫描电镜检测方式。同时结合图像三维重建技术，可将激光共聚焦显微镜或扫描电镜中对生物膜连续扫描的图像进行重建，以获得立体、直观的生物膜图像，便于生物膜的整体观察[20]。
因此，将共聚焦激光显微镜、扫描电镜与三维图像重建技术结合是研究混合生物膜的理想方法，可为防治细菌-真菌引发的生物材料植入感染后续研究提供帮助。
