引用本文： 魏长征, 吕黄红, 张健, 朱彬, 蒋丽霞. 交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留量的检测方法研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(5): 615-619. doi: 10.7507/1002-1892.20150132 复制
透明质酸钠是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，它由(1-β-4) D-葡糖醛酸和(1-β-3) N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，广泛用于修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹[1-5]。透明质酸钠具有良好的理化性能及生物相容性[6]。然而，它在体内因受到透明质酸酶的酶解作用而降解迅速，存留时间较短，需重复注射才能达到疗效。交联透明质酸钠是透明质酸钠经交联剂交联修饰得到的高分子凝胶，可弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果[7-8]。
经过近几年的快速发展及市场整合，交联透明质酸钠凝胶技术已趋于平稳和雷同，市场中的产品竞争也异常激烈，仅在中国市场就有4～5家产品并存。从交联技术层面来讲，该技术类型主要包括两大类，即二乙烯基砜 [9-11]和1，4-丁二醇二缩水甘油醚（1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE）[12-13]作为交联剂，其中BDDE作为交联剂的产品占据绝大部分市场。众所周知，BDDE具有生物毒性或潜在的致癌性[14]，交联透明质酸钠凝胶为长期植入体内的三类医疗器械，虽然各生产厂家采取了严格的控制措施确保产品安全性，但临床尚缺乏大样本、长期跟踪数据来佐证该类产品的生物安全性；同时由于市场长效需求的趋势，生产厂家都在追求更长的体内残留时间，这势必提高产品的交联/修饰程度，加大交联剂的引入量，更加剧了人们对该类产品安全性的担忧。
在践行转化医学中，对拟转化产品的质量控制是保证临床应用安全性的重要措施。鉴于上述现状，有必要对BDDE交联透明质酸钠凝胶中的交联剂残留量进行严格监控。BDDE的检测方法主要包括气相色谱法和荧光检测法[15-17]，因BDDE的热不稳定性导致气相色谱法检测结果偏差大，所以荧光检测法成为主要检测法，但目前尚缺乏关于该方法的系统研究。本研究旨在探讨一种新的BDDE荧光检测方法，同时按照方法学验证的相关标准评价该方法科学性，为企业和监管部门提供一种科学的监控手段，保障交联透明质酸钠凝胶临床使用的安全性。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器
BDDE（含量95.0%）、苯乙酮（含量99.0%）、尼克酰胺（含量99.5%）、透明质酸酶（400～1 000 U/ mg）（Sigma公司，美国）；PBS缓冲液、氢氧化钾（含量 ＞85%）、甲酸（含量98.0%）、无水乙醇（含量 ＞99.7%），均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；透明质酸钠（山东华熙福瑞达生物医药有限公司）；注射用交联透明质酸钠凝胶（上海其胜生物制剂有限公司）。
CaryEclipse荧光分光光度计（VARIAN公司，美国）；Agilent 7890A气相色谱仪、电子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；恒温水浴锅、VXH漩涡混合器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
1.2 传统荧光检测法测定BDDE残留量
1.2.1 绘制BDDE标准曲线
称取0.08 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配置成80 μg/g储备液，然后梯度稀释，配制浓度分别为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 μg/g的BDDE标准溶液。取各浓度标准溶液0.2 mL，加入0.1 mL浓度为125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却；最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm，绘制BDDE标准曲线。
1.2.2 样品中BDDE残留量的检测
使用透明质酸酶降解交联透明质酸钠凝胶注射剂制备降解液。具体操作如下：取1 g交联凝胶，加入1 mL 3 mg/ mL透明质酸酶PBS溶液，混匀，于37℃下酶降24 h即得降解液。后取降解液0.2 mL，加入0.1 mL 浓度为125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却，最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm，所得荧光值代入1.2.1中标准曲线即得BDDE浓度。
1.3 BDDE热稳定性研究
1.3.1 气相色谱法
称取0.02 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配置成浓度为20 μg/g的BDDE标准溶液。分别取2份样品，一份不作任何处理，另一份以121℃灭菌15 min。将2 份样品通过气相色谱仪进行峰型测定比较。
1.3.2 荧光检测法
分别称取0.01、0.02、0.03 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配制成浓度为10、20、30 μg/g的BDDE储备液。每个浓度分别取3份，其中一份不作处理，另两份分别以90℃灭菌30 min、121℃灭菌20 min，按照1.2.2中方法检测BDDE含量。
1.4 荧光法测定BDDE残留量的影响因素分析
1.4.1 样品制备过程中透明质酸酶的影响
分别配置浓度为1、3 mg/mL的透明质酸酶PBS溶液和凝胶浓度为2%（w/w）的交联透明质酸钠降解液（酶浓度为3 mg/mL），按照1.2.2中方法检测BDDE含量。
1.4.2 BDDE储备液稳定性的影响
称取0.032 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配制浓度为32 μg/g的BDDE储备液，4℃放置1、7、10 d后，分别取样梯度稀释至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g的BDDE标准溶液，按照1.2.1中方法比较1、7、10 d标准溶液的荧光值。
1.5 荧光法改良
参照1.2.1方法配制浓度分别为16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0 μg/g的BDDE标准溶液。取各浓度标准溶液0.1 mL，加入2%降解液（透明质酸酶浓度为3 mg/mL）0.1 mL，即对倍稀释标准溶液，使其浓度达到8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g；再加入0.1 mL 125 mmol/L尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却，最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm。另参照1.2.2中方法检测酶解后交联透明质酸钠凝胶样品的BDDE残留量。
1.6 统计学方法
实验均重复3次。采用Origin 9统计软件进行分析，同时对数据进行线性拟合并考察线性相关系数。数据以均数±标准差表示，组间比较使用Min it ab软件进行方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 传统荧光检测法测定BDDE残留量
BDDE标准溶液荧光值测定结果见图 1。对其进行线性拟合可得方程式为y=14.102x+1.103，R2=0.999 8。相关分析显示，BDDE残留量与荧光值呈较好线性相关性。
图1
传统荧光检测法得BDDE标准溶液浓度与荧光值的线性相关图 图 2 浓度为20 μg/g的BDDE标准液灭菌前后气相色谱响应 ⓐ 灭菌前 ⓑ 灭菌后 图 3 荧光法检测1、7、10 d各BDDE储备液荧光值与浓度的线性关系 图 4 添加透明质酸酶液前后荧光值与BDDE浓度的线性关系
Figure1.
The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value by the traditional fluorescence spectrophotometry method Fig. 2 The gas chromatographic response for BDDE before and after sterilization (20 μg/g) ⓐ Before sterilization ⓑ After sterilization Fig. 3 The linear relationship between the fluorescence value and standard curve of BDDE at different time by fluorescence spectrophotometry Fig. 4 The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value before and after the adding of hyaluronidase
2.2 BDDE热稳定性研究
气相色谱法测定显示，浓度为20 μg/g的BDDE标准液在灭菌前后峰面积发生变化，即灭菌后含量急剧下降。表明BDDE具有弱热稳定性，高温下发生降解。见图 2。
荧光法检测示，未受高温灭菌处理的样品BDDE含量与起始定量配置的BDDE含量相似，表明该方法在检测过程中不对BDDE造成分解破坏。经过不同高温处理后，BDDE均发生不同程度分解，灭菌前后BDDE含量比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
荧光法检测各浓度BDDE储备液灭菌前后BDDE含量（n=3，2.3 荧光法测量影响因素分析
2.3.1 透明质酸酶的影响
浓度为1、3 mg/mL的透明质酸酶和2%降解液的荧光值分别为3.923±0.431、9.423±0.971、9.564±0.864，显示透明质酸酶会产生相应荧光值。根据2.1中BDDE标准曲线，可得上述荧光值分别对应的BDDE浓度为（0.20±0.03）、（0.59±0.07）、（0.60±0.06）μg/g。
2.3.2 BDDE储备液稳定性的影响
同一浓度储备液放置不同时间后荧光值发生显著变化，不同时间点间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中浓度为8.0 μg/g时荧光值下降最显著。对BDDE浓度与对应荧光值进行线性拟合可得方程式：1 d后BDDE储备液的线性方程式为y=13.442x－0.298，3 d为y=9.646x+0.16，7 d为y=7.564x+0.071；可见其线性关系也发生变化，直线斜率从初始状态下的14.102下降至7 d后的7.564。表明BDDE的不稳定性也是影响荧光法检测结果的重要因素。见表 2、图 3。
表2
荧光法检测不同时间点各浓度BDDE标准溶液的荧光值比较（n=3，2.4 荧光法的改良
检测显示，添加酶液前后的标准曲线大体一致，均保持线性相关，说明添加与检测样品酶浓度相同的透明质酸酶液后，不影响BDDE含量与荧光值的线性关系。改良后的BDDE标准曲线拟合方程式为：y=14.027x+7.062，R2=0.999 9。此外，改良后（即在BDDE标准溶液中添加了样品相应浓度的酶溶液后），检测样品的荧光值对应的BDDE含量更低，这是因为此时扣除了样品中透明质酸酶对检测结果的影响，得到的数据更真实。见图 4。
3 讨论
二乙烯基砜 [18-20]和BDDE[21]被广泛应用于高分子的化学交联反应中，特别是透明质酸钠凝胶，它们利用分子中的双官能团将透明质酸钠分子相互连接形成立体的三维网状结构，提高了透明质酸钠凝胶的体内残留时间。因分子结构的不同，采用两种交联剂制备的凝胶性质也发生较大变化以适应不同的临床需求，其中BDDE交联产品逐渐成为市场的主流。2003年瑞典Q-Med公司生产的瑞蓝（Restylane）玻尿酸产品在国际上首次被美国食品药品监督管理局（FDA）批准，随后2008年在中国获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准，进而大大带动了我国交联透明质酸钠凝胶产品的开发，特别是BDDE交联产品的开发。即将于2015年7月1日实施的YY/T0962-2014（整形手术用交联透明质酸钠凝胶）是目前国内唯一专门针对交联透明质酸钠凝胶的行业标准，在这项标准中提供了两种BDDE残留量的检测方法，即气相色谱法和荧光分光光度法。本文通过系列研究发现这两种方法在BDDE残留量的检测方面均存在一定局限性，为了科学监控BDDE交联产品的安全性，急需对现有的检测方法加以研究，为企业质量内控提供技术手段。
Q-Med公司注册提供的检测方法是采用气相色谱法测定BDDE残留量，即与2 μg/g的标准液进行气相色谱比对，进而判定残留量＜2 μg/g，因此该方法为半定量，存在较大误差。本研究通过气相色谱法检测BDDE残留量，检测结果存在较大误差，BDDE发生了分解，其主要原因是在检测过程中有升温程序，破坏了BDDE结构，进而对检测结果造成影响。造成这种结果的分子结构基础是BDDE结构中含有2个三元环，每个三元环刚性较大，极易发生开环，水、醇等物质发生加成反应，生成相应的醇或醚。荧光法检测结果显示，经过不同温度处理的BDDE样品含量发生明显偏差，表明BDDE的热稳定性较差，会对检测造成极大误差，这也验证了上述论述。
相比气相色谱法，荧光法则具有很强特异性，即尼克酰胺特异性地与环氧化合物中的三元环发生反应生成具有荧光吸收的有色物质，而该物质颜色的深浅与环氧化合物的含量呈线性关系，因此有效规避了检测过程中高温对残留量检测的影响，能更准确地测定成品中的残留量，更好控制产品的生物安全性。
由于市售的BDDE交联透明质酸钠凝胶均为颗粒化，残留的BDDE会相应地包裹在颗粒中，对残留量的测定产生较大影响，因此在采用荧光法测定时首先需要对颗粒化产品进行酶解。而透明质酸酶是一种高分子蛋白质，不可避免地会引入一定环状结构，对检测造成潜在影响。透明质酸酶本身存在一定荧光值，由于现有的产品标准中BDDE的限定值多为2 μg/g，3 mg/mL的透明质酸酶折合BDDE的残留量为0.6 μg/g，极大地影响BDDE残留量的检测，因此在检验方法的制定中必须考虑透明质酸酶的影响；同时BDDE本身又具有热不稳定性，且储备液放置时间过长其荧光值也会发生较大改变，因此我们对荧光法进行了改良，即将透明质酸酶添加到标准曲线中，进而排除了透明质酸酶对检测的影响；同时还考察了储备液不同放置时间其荧光值的变化，进而确定在测定BDDE残留量时应用的储备液采用临用新配，排除了储备液对检测的影响。
如今市面上BDDE交联透明质酸钠凝胶均为无菌注射产品，灭菌方式均为高压蒸汽灭菌，该制备工艺造成了成品中的BDDE残留量下降，因此采用上述经改进的荧光分光光度法进行BDDE交联剂残留量检测，其得到的结果只能表示高温灭菌后产品的BDDE残留量。这是因为BDDE具有热不稳定性，故产品自生产制造完成后，凝胶残留的BDDE就会发生一系列分解变化，其含量也会逐渐下降，分解后的产物毒性及其安全性还需作进一步研究，以确保产品在整个寿命周期内的安全性。对于生产企业也要提出新的命题，即产品灭菌前与灭菌后BDDE残留量的变化及其分解产物，以新生产未灭菌产品中的残留量作为参考值来进行系统性的安全性研究。
透明质酸钠是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，它由(1-β-4) D-葡糖醛酸和(1-β-3) N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，广泛用于修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹[1-5]。透明质酸钠具有良好的理化性能及生物相容性[6]。然而，它在体内因受到透明质酸酶的酶解作用而降解迅速，存留时间较短，需重复注射才能达到疗效。交联透明质酸钠是透明质酸钠经交联剂交联修饰得到的高分子凝胶，可弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果[7-8]。
经过近几年的快速发展及市场整合，交联透明质酸钠凝胶技术已趋于平稳和雷同，市场中的产品竞争也异常激烈，仅在中国市场就有4～5家产品并存。从交联技术层面来讲，该技术类型主要包括两大类，即二乙烯基砜 [9-11]和1，4-丁二醇二缩水甘油醚（1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE）[12-13]作为交联剂，其中BDDE作为交联剂的产品占据绝大部分市场。众所周知，BDDE具有生物毒性或潜在的致癌性[14]，交联透明质酸钠凝胶为长期植入体内的三类医疗器械，虽然各生产厂家采取了严格的控制措施确保产品安全性，但临床尚缺乏大样本、长期跟踪数据来佐证该类产品的生物安全性；同时由于市场长效需求的趋势，生产厂家都在追求更长的体内残留时间，这势必提高产品的交联/修饰程度，加大交联剂的引入量，更加剧了人们对该类产品安全性的担忧。
在践行转化医学中，对拟转化产品的质量控制是保证临床应用安全性的重要措施。鉴于上述现状，有必要对BDDE交联透明质酸钠凝胶中的交联剂残留量进行严格监控。BDDE的检测方法主要包括气相色谱法和荧光检测法[15-17]，因BDDE的热不稳定性导致气相色谱法检测结果偏差大，所以荧光检测法成为主要检测法，但目前尚缺乏关于该方法的系统研究。本研究旨在探讨一种新的BDDE荧光检测方法，同时按照方法学验证的相关标准评价该方法科学性，为企业和监管部门提供一种科学的监控手段，保障交联透明质酸钠凝胶临床使用的安全性。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器
BDDE（含量95.0%）、苯乙酮（含量99.0%）、尼克酰胺（含量99.5%）、透明质酸酶（400～1 000 U/ mg）（Sigma公司，美国）；PBS缓冲液、氢氧化钾（含量 ＞85%）、甲酸（含量98.0%）、无水乙醇（含量 ＞99.7%），均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；透明质酸钠（山东华熙福瑞达生物医药有限公司）；注射用交联透明质酸钠凝胶（上海其胜生物制剂有限公司）。
CaryEclipse荧光分光光度计（VARIAN公司，美国）；Agilent 7890A气相色谱仪、电子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；恒温水浴锅、VXH漩涡混合器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
1.2 传统荧光检测法测定BDDE残留量
1.2.1 绘制BDDE标准曲线
称取0.08 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配置成80 μg/g储备液，然后梯度稀释，配制浓度分别为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 μg/g的BDDE标准溶液。取各浓度标准溶液0.2 mL，加入0.1 mL浓度为125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却；最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm，绘制BDDE标准曲线。
1.2.2 样品中BDDE残留量的检测
使用透明质酸酶降解交联透明质酸钠凝胶注射剂制备降解液。具体操作如下：取1 g交联凝胶，加入1 mL 3 mg/ mL透明质酸酶PBS溶液，混匀，于37℃下酶降24 h即得降解液。后取降解液0.2 mL，加入0.1 mL 浓度为125 mmol/L的尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却，最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm，所得荧光值代入1.2.1中标准曲线即得BDDE浓度。
1.3 BDDE热稳定性研究
1.3.1 气相色谱法
称取0.02 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配置成浓度为20 μg/g的BDDE标准溶液。分别取2份样品，一份不作任何处理，另一份以121℃灭菌15 min。将2 份样品通过气相色谱仪进行峰型测定比较。
1.3.2 荧光检测法
分别称取0.01、0.02、0.03 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配制成浓度为10、20、30 μg/g的BDDE储备液。每个浓度分别取3份，其中一份不作处理，另两份分别以90℃灭菌30 min、121℃灭菌20 min，按照1.2.2中方法检测BDDE含量。
1.4 荧光法测定BDDE残留量的影响因素分析
1.4.1 样品制备过程中透明质酸酶的影响
分别配置浓度为1、3 mg/mL的透明质酸酶PBS溶液和凝胶浓度为2%（w/w）的交联透明质酸钠降解液（酶浓度为3 mg/mL），按照1.2.2中方法检测BDDE含量。
1.4.2 BDDE储备液稳定性的影响
称取0.032 g BDDE置于1 000 mL容量瓶中，加PBS缓冲液混匀，配制浓度为32 μg/g的BDDE储备液，4℃放置1、7、10 d后，分别取样梯度稀释至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g的BDDE标准溶液，按照1.2.1中方法比较1、7、10 d标准溶液的荧光值。
1.5 荧光法改良
参照1.2.1方法配制浓度分别为16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0 μg/g的BDDE标准溶液。取各浓度标准溶液0.1 mL，加入2%降解液（透明质酸酶浓度为3 mg/mL）0.1 mL，即对倍稀释标准溶液，使其浓度达到8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/g；再加入0.1 mL 125 mmol/L尼克酰胺溶液，混匀，37℃水浴2 h；然后依次加入15%苯乙酮溶液和1 mol/L氢氧化钾溶液各1 mL，混匀后置于冰浴中10 min，并加入5 mL甲酸，60℃水浴5 min，冰浴中冷却，最后用荧光分光光度计测定其荧光值，激发和发射波长分别为380 nm和435 nm。另参照1.2.2中方法检测酶解后交联透明质酸钠凝胶样品的BDDE残留量。
1.6 统计学方法
实验均重复3次。采用Origin 9统计软件进行分析，同时对数据进行线性拟合并考察线性相关系数。数据以均数±标准差表示，组间比较使用Min it ab软件进行方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 传统荧光检测法测定BDDE残留量
BDDE标准溶液荧光值测定结果见图 1。对其进行线性拟合可得方程式为y=14.102x+1.103，R2=0.999 8。相关分析显示，BDDE残留量与荧光值呈较好线性相关性。
图1
传统荧光检测法得BDDE标准溶液浓度与荧光值的线性相关图 图 2 浓度为20 μg/g的BDDE标准液灭菌前后气相色谱响应 ⓐ 灭菌前 ⓑ 灭菌后 图 3 荧光法检测1、7、10 d各BDDE储备液荧光值与浓度的线性关系 图 4 添加透明质酸酶液前后荧光值与BDDE浓度的线性关系
Figure1.
The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value by the traditional fluorescence spectrophotometry method Fig. 2 The gas chromatographic response for BDDE before and after sterilization (20 μg/g) ⓐ Before sterilization ⓑ After sterilization Fig. 3 The linear relationship between the fluorescence value and standard curve of BDDE at different time by fluorescence spectrophotometry Fig. 4 The linear relationship between the content of BDDE and fluorescence value before and after the adding of hyaluronidase
2.2 BDDE热稳定性研究
气相色谱法测定显示，浓度为20 μg/g的BDDE标准液在灭菌前后峰面积发生变化，即灭菌后含量急剧下降。表明BDDE具有弱热稳定性，高温下发生降解。见图 2。
荧光法检测示，未受高温灭菌处理的样品BDDE含量与起始定量配置的BDDE含量相似，表明该方法在检测过程中不对BDDE造成分解破坏。经过不同高温处理后，BDDE均发生不同程度分解，灭菌前后BDDE含量比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
荧光法检测各浓度BDDE储备液灭菌前后BDDE含量（n=3，2.3 荧光法测量影响因素分析
2.3.1 透明质酸酶的影响
浓度为1、3 mg/mL的透明质酸酶和2%降解液的荧光值分别为3.923±0.431、9.423±0.971、9.564±0.864，显示透明质酸酶会产生相应荧光值。根据2.1中BDDE标准曲线，可得上述荧光值分别对应的BDDE浓度为（0.20±0.03）、（0.59±0.07）、（0.60±0.06）μg/g。
2.3.2 BDDE储备液稳定性的影响
同一浓度储备液放置不同时间后荧光值发生显著变化，不同时间点间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中浓度为8.0 μg/g时荧光值下降最显著。对BDDE浓度与对应荧光值进行线性拟合可得方程式：1 d后BDDE储备液的线性方程式为y=13.442x－0.298，3 d为y=9.646x+0.16，7 d为y=7.564x+0.071；可见其线性关系也发生变化，直线斜率从初始状态下的14.102下降至7 d后的7.564。表明BDDE的不稳定性也是影响荧光法检测结果的重要因素。见表 2、图 3。
表2
荧光法检测不同时间点各浓度BDDE标准溶液的荧光值比较（n=3，2.4 荧光法的改良
检测显示，添加酶液前后的标准曲线大体一致，均保持线性相关，说明添加与检测样品酶浓度相同的透明质酸酶液后，不影响BDDE含量与荧光值的线性关系。改良后的BDDE标准曲线拟合方程式为：y=14.027x+7.062，R2=0.999 9。此外，改良后（即在BDDE标准溶液中添加了样品相应浓度的酶溶液后），检测样品的荧光值对应的BDDE含量更低，这是因为此时扣除了样品中透明质酸酶对检测结果的影响，得到的数据更真实。见图 4。
3 讨论
二乙烯基砜 [18-20]和BDDE[21]被广泛应用于高分子的化学交联反应中，特别是透明质酸钠凝胶，它们利用分子中的双官能团将透明质酸钠分子相互连接形成立体的三维网状结构，提高了透明质酸钠凝胶的体内残留时间。因分子结构的不同，采用两种交联剂制备的凝胶性质也发生较大变化以适应不同的临床需求，其中BDDE交联产品逐渐成为市场的主流。2003年瑞典Q-Med公司生产的瑞蓝（Restylane）玻尿酸产品在国际上首次被美国食品药品监督管理局（FDA）批准，随后2008年在中国获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准，进而大大带动了我国交联透明质酸钠凝胶产品的开发，特别是BDDE交联产品的开发。即将于2015年7月1日实施的YY/T0962-2014（整形手术用交联透明质酸钠凝胶）是目前国内唯一专门针对交联透明质酸钠凝胶的行业标准，在这项标准中提供了两种BDDE残留量的检测方法，即气相色谱法和荧光分光光度法。本文通过系列研究发现这两种方法在BDDE残留量的检测方面均存在一定局限性，为了科学监控BDDE交联产品的安全性，急需对现有的检测方法加以研究，为企业质量内控提供技术手段。
Q-Med公司注册提供的检测方法是采用气相色谱法测定BDDE残留量，即与2 μg/g的标准液进行气相色谱比对，进而判定残留量＜2 μg/g，因此该方法为半定量，存在较大误差。本研究通过气相色谱法检测BDDE残留量，检测结果存在较大误差，BDDE发生了分解，其主要原因是在检测过程中有升温程序，破坏了BDDE结构，进而对检测结果造成影响。造成这种结果的分子结构基础是BDDE结构中含有2个三元环，每个三元环刚性较大，极易发生开环，水、醇等物质发生加成反应，生成相应的醇或醚。荧光法检测结果显示，经过不同温度处理的BDDE样品含量发生明显偏差，表明BDDE的热稳定性较差，会对检测造成极大误差，这也验证了上述论述。
相比气相色谱法，荧光法则具有很强特异性，即尼克酰胺特异性地与环氧化合物中的三元环发生反应生成具有荧光吸收的有色物质，而该物质颜色的深浅与环氧化合物的含量呈线性关系，因此有效规避了检测过程中高温对残留量检测的影响，能更准确地测定成品中的残留量，更好控制产品的生物安全性。
由于市售的BDDE交联透明质酸钠凝胶均为颗粒化，残留的BDDE会相应地包裹在颗粒中，对残留量的测定产生较大影响，因此在采用荧光法测定时首先需要对颗粒化产品进行酶解。而透明质酸酶是一种高分子蛋白质，不可避免地会引入一定环状结构，对检测造成潜在影响。透明质酸酶本身存在一定荧光值，由于现有的产品标准中BDDE的限定值多为2 μg/g，3 mg/mL的透明质酸酶折合BDDE的残留量为0.6 μg/g，极大地影响BDDE残留量的检测，因此在检验方法的制定中必须考虑透明质酸酶的影响；同时BDDE本身又具有热不稳定性，且储备液放置时间过长其荧光值也会发生较大改变，因此我们对荧光法进行了改良，即将透明质酸酶添加到标准曲线中，进而排除了透明质酸酶对检测的影响；同时还考察了储备液不同放置时间其荧光值的变化，进而确定在测定BDDE残留量时应用的储备液采用临用新配，排除了储备液对检测的影响。
如今市面上BDDE交联透明质酸钠凝胶均为无菌注射产品，灭菌方式均为高压蒸汽灭菌，该制备工艺造成了成品中的BDDE残留量下降，因此采用上述经改进的荧光分光光度法进行BDDE交联剂残留量检测，其得到的结果只能表示高温灭菌后产品的BDDE残留量。这是因为BDDE具有热不稳定性，故产品自生产制造完成后，凝胶残留的BDDE就会发生一系列分解变化，其含量也会逐渐下降，分解后的产物毒性及其安全性还需作进一步研究，以确保产品在整个寿命周期内的安全性。对于生产企业也要提出新的命题，即产品灭菌前与灭菌后BDDE残留量的变化及其分解产物，以新生产未灭菌产品中的残留量作为参考值来进行系统性的安全性研究。
