引用本文： 郭宇鹏, 唐康来, 张吉强, 陈波, 施又兴. 不同浓度TGF-β3对体外肌腱干细胞分化的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(5): 620-625. doi: 10.7507/1002-1892.20150133 复制
肌腱病是常见的运动损伤性疾病，主要临床表现为疼痛和功能障碍，主要病理表现为肌腱细胞坏死、炎症、骨化、脂肪化等[1]。肌腱病发病机制不清，目前研究认为可能与反复机械负荷导致肌腱反复出现微小损伤有关[2]。自2007年Bi等[3]首次从肌腱中分离出肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），并证实其具有多向分化潜能以来，已有大量研究证实TSCs是肌腱细胞的前体细胞，也是肌腱细胞的唯一来源，自身分化能力强。之后学者从人和动物的肌腱组织中成功分离TSCs，进一步明确其具有多向分化潜能 [4-7]，为明确肌腱病中出现骨化和脂肪化的发生机制提供了实验依据。
TGF-β超家族能使正常成纤维细胞的表型发生转化。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，其中间充质起源的细胞主要产生TGF-β3。非活性状态的TGF-β3可被正在愈合或新生的组织周围酸性环境活化，进而行使功能。既往研究表明，TGF-β3可对MSCs、胚胎干细胞等细胞分化有不同作用[8-11]；同时，TGF-β的表达量可因机械刺激而变化[12-13]。那么在肌腱微损伤及修复过程中，其对TSCs不同方向的分化是否发挥作用以及发挥什么样的作用，目前尚未明确。本研究利用体外培养的大鼠跟腱来源TSCs，予以不同浓度TGF-β3处理，检测不同时间点TSCs分化情况，为明确TGF-β3在肌腱病发生过程中的角色提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶、重组人TGF-β3（R&D Systems公司，美国）；RNAiso Plus、PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Takara公司，日本）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；iCycler 荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 TSCs分离及培养
TSCs的分离培养和鉴定参照本课题组既往方法[6-7]。取3周龄SD雄性大鼠2只，体重约50 g（第三军医大学实验动物中心）。CO2处死后无菌条件下取双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，PBS清洗3次；将肌腱均匀剪碎成1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/mLⅠ型胶原酶和4 mg/ mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h，收集细胞悬液，加入含15%FBS的L-DMEM培养基2 mL中止消化，以170×g离心5 min，弃上清。加入含15%FBS的L-DMEM培养基4 mL重悬细胞，按50个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育，每3天换液1次。原代细胞为P0代，当细胞融合达90%时进行传代，取P3代用于实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4和诱导成骨、成软骨、成脂肪分化，鉴定培养细胞为TSCs。
1.3 实验分组及方法
实验分为4组，取P3代TSCs以2×103个/cm2密度接种于12个细胞培养皿中，每组3个培养皿，培养24 h观察细胞完全贴壁后，分别采用5.0、2.5、1.0、0 ng/mL TGF-β3培养，于1、3、5 d收集细胞进行实时荧光定量PCR检测。
1.4 实时荧光定量PCR检测
检测TSCs成肌腱分化标志性基因Ⅰ型胶原、肌腱蛋白C（tenascin C，TNC）、腱调蛋白（tenomodulin，TNMD）和Scx（scleraxis），成骨分化标志性基因Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）、ALP，成软骨分化标志性基因Sox9、Ⅱ型胶原，成脂肪分化标志性基因AP2、过氧化物酶增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）；以GAPDH作为内参。参照PrimeScript逆转录试剂盒产品说明书提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。PCR反应条件：95℃预变性8 min；95℃变性10 s、60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40个循环。采用2-ΔΔCt分析目的基因相对表达量，所有实验均重复3次。引物自行设计，由上海英骏生物公司合成，序列见表 1。
表1
实时荧光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time quantitative PCR
1.5 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度TGF-β3对TSCs成肌腱分化的影响
成肌腱分化4个标志基因表达与TGF-β3浓度、处理时间及二者交互作用均有相关性（P＜0.05）。见图 1。
图1
实时荧光定量PCR检测成肌腱分化标志性基因表达 ⓐ Ⅰ型胶原 ⓑ TNC ⓒ TNMD ⓓ Scx 图 2 实时荧光定量PCR检测成骨分化标志性基因表达 ⓐ Runx2 ⓑ ALP 图 3 实时荧光定量PCR检测成软骨分化标志性基因表达 ⓐ Sox9 ⓑ Ⅱ型胶原 图 4 实时荧光定量PCR检测成脂肪分化标志性基因表达 ⓐ AP2 ⓑPPARγ
Figure1.
The mRNA expressions of tendogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Collagen type Ⅰ ⓑ TNC ⓒ TNMD ⓓ Scx Fig. 2 The mRNA expressions of osteogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Runx2 ⓑ ALP Fig. 3 The mRNA expressions of chondrogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Sox9 ⓑ Collagen type ⅠI Fig. 4 The mRNA expressions of adipogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ AP2 ⓑ PPARγ
2.1.1 Ⅰ型胶原
Ⅰ型胶原中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=12.818，P=0.000）。
培养1 d时，5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d 时，0、2.5、5.0 ng/mL组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）； 2.5 ng/mL组中1、3 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.2 TNC
TNC中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=9.154，P=0.000）。
培养1 d时，1.0、2.5 ng/mL组与 5.0 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/mL组比较以及2.5、5.0 ng/ mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组与1.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.3 TNMD
TNMD中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=5.880，P=0.001）。
培养1 d时，0、1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/ mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5 ng/ mL与5.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/ mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1 d与3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.4 Scx
Scx中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=3.817，P=0.008）。
培养1 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/ mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养5 d时，0、1.0、5.0 ng/ mL组与2.5 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；2.5 ng/mL组中1、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、5 d与3 d比较，差异有统计学意义（P＞0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 不同浓度TGF-β3对TSCs成骨分化的影响
2.2.1 Runx2
TGF-β3低浓度、短时间处理对Runx2表达有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、时间均相关（P＜0.05），且浓度与时间存在交互作用（t=4.680，P=0.003）。见图 2 a。
培养1 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，0、1.0 ng/mL组间比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，0、1.0、2.5 ng/ mL组与5.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）； 2.5 ng/mL组中3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.2.2 ALP
ALP表达量与TGF-β3处理时间相关（P=0.000），与TGF-β3浓度无相关（P=0.176）。TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=5.117，P=0.002）。见图 2 b。
培养1、3 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养5 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、5.0 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；1、3 d比较差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 不同浓度TGF-β3对TSCs成软骨分化的影响
2.3.1 Sox9
TGF-β3低浓度、短时间处理对Sox9表达有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、时间均相关（P＜0.05），且浓度与时间存在交互作用（t=3.482，P=0.013）。见图 3 a。
培养1 d时，1.0、2.5 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组与1.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，0、1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/ mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1 d与3、5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；3、5 d比较差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.3.2 Ⅱ型胶原
Ⅱ型胶原表达量仅与TGF-β3浓度相关（P=0.008），与TGF-β3处理时间或两者共同作用无相关（P＞0.05）。见图 3 b。
培养1、3 d时，各组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养5 d时，0、5.0 ng/ mL组间以及1.0、2.5 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.4 不同浓度TGF-β3对TSCs成脂肪分化的影响
2.4.1 AP2
经TGF-β3高浓度、长时间刺激对AP2表达具有促进作用，其表达量与处理时间相关（P=0.000），未见与浓度显著相关（P=0.153）；浓度与时间存在交互作用（t=6.857，P=0.000）。见图 4 a。
培养1、3 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、5.0 ng/mL组与2.5 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；1、3 d比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.4.2 PPARγ
经TGF-β3低浓度、长时间刺激对PPARγ表达具有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、处理时间均相关（P＜0.05）。浓度与时间存在交互作用（t=3.036，P=0.024）。见图 4 b。
培养1、3 d时，1.0、2.5 ng/mL组与0、5.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；2.5 ng/mL组中3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
TGF-β超家族是一类结构相关性的生长因子，包括TGF-β、激活素、BMP等。这一家族在胚胎发生和组织自稳态中起着相当广泛的作用[14-15]，其能调控细胞的生长、黏附、迁移、分化、凋亡等。TGF-β超家族的经典信号转导途径为配体与跨膜受体结合，激活下游的SMAD蛋白，直接调控基因转录[16]。TGF-β作用的特异性不仅取决于配体与受体的特异性结合，也取决于不同种类受体的特异性结合[17]，从而下游形成不同种类的SMAD复合物，通过各自对DNA不同序列的选择性结合来调控基因转录，最终调节细胞的生理功能[18-20]。除此之外，TGF-β还可激活包括ERK、p38和JNK的分裂素，来激活蛋白激酶MAPKs、PI3K/Akt和小GTP酶信号通路[21-22]。
本研究探讨了不同浓度TGF-β3对TSCs分化的影响。结果表明，外源性TGF-β3对细胞分化的影响与刺激浓度、时间均有关，且单纯浓度或时间的改变即可导致细胞向不同方向分化：在低浓度、短时间刺激下，TSCs更倾向于向成肌腱方向分化，高浓度、长时间刺激在促进成肌腱分化的同时，启动了成软骨、成骨等异常分化途径。既往研究发现了TGF-β的成肌腱[23]、成软骨[24]及促进骨基质生长[25]等作用，Maeda 等[13]研究发现TGF-β可激活Scx促进成肌腱分化，但过量TGF-β释放则会导致肌腱细胞死亡。在胚胎形成期，组织中TGF-β的浓度梯度差决定了细胞分化方向[26]。TGF-β信号的复杂性可能原因在于其信号传导是一复杂的网络，研究发现TGF-β的受体与配体结合并非严格专一，受体表达不同可导致下游不同的事件[9]，每种TGF-β配体下游所产生的SMAD是特异的，但其DNA结合位点同为富含GTCT的SMAD结合位点[20]，使得TGF-β信号通路可有多种不同功能。TGF-β除了通过SMAD通路传导以外，另一条常见途径是ERK通路，这一途径不但有明显的信号放大作用[27]，其动力学也与SMAD通路不同，ERK通路启动更迅速，消退也更快，这一动力学特性可能导致了TGF-β3效应的时间相关性。除此之外，有研究表明TGF-β可通过调控microRNA的合成而调控细胞分化方向[28]。本研究仅观察了TGF-β3对TSCs分化影响的结果，其分子机制有待于从受体结合层面、细胞内信号转导层面及转录激活层面进一步研究，寻找TGF-β超家族信号网络中的关键性节点。
TGF-β信号的作用十分精密，在胚胎期的轻微改变即可导致严重后果[29]。本研究结果也证实了该结论，TGF-β3低浓度、短时间处理可诱导TSCs向成肌腱方向分化，这在体内可以促进肌腱损伤的修复，但高浓度、长时间刺激则在促进TSCs正常分化的同时启动了异常分化机制。这一现象与肌腱病组织中的细胞增多、钙化及脂肪化一致，可能是导致肌腱病的原因之一。由于TGF-β信号的多效性和精密性，其可能在肌腱微损伤修复的分化过程中起着“开关”作用，决定细胞的分化命运。TGF-β在肌腱病发生中所扮演的角色，有待进一步动物实验证实。
肌腱病是常见的运动损伤性疾病，主要临床表现为疼痛和功能障碍，主要病理表现为肌腱细胞坏死、炎症、骨化、脂肪化等[1]。肌腱病发病机制不清，目前研究认为可能与反复机械负荷导致肌腱反复出现微小损伤有关[2]。自2007年Bi等[3]首次从肌腱中分离出肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），并证实其具有多向分化潜能以来，已有大量研究证实TSCs是肌腱细胞的前体细胞，也是肌腱细胞的唯一来源，自身分化能力强。之后学者从人和动物的肌腱组织中成功分离TSCs，进一步明确其具有多向分化潜能 [4-7]，为明确肌腱病中出现骨化和脂肪化的发生机制提供了实验依据。
TGF-β超家族能使正常成纤维细胞的表型发生转化。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，其中间充质起源的细胞主要产生TGF-β3。非活性状态的TGF-β3可被正在愈合或新生的组织周围酸性环境活化，进而行使功能。既往研究表明，TGF-β3可对MSCs、胚胎干细胞等细胞分化有不同作用[8-11]；同时，TGF-β的表达量可因机械刺激而变化[12-13]。那么在肌腱微损伤及修复过程中，其对TSCs不同方向的分化是否发挥作用以及发挥什么样的作用，目前尚未明确。本研究利用体外培养的大鼠跟腱来源TSCs，予以不同浓度TGF-β3处理，检测不同时间点TSCs分化情况，为明确TGF-β3在肌腱病发生过程中的角色提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶、重组人TGF-β3（R&D Systems公司，美国）；RNAiso Plus、PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Takara公司，日本）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；iCycler 荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 TSCs分离及培养
TSCs的分离培养和鉴定参照本课题组既往方法[6-7]。取3周龄SD雄性大鼠2只，体重约50 g（第三军医大学实验动物中心）。CO2处死后无菌条件下取双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，PBS清洗3次；将肌腱均匀剪碎成1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/mLⅠ型胶原酶和4 mg/ mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h，收集细胞悬液，加入含15%FBS的L-DMEM培养基2 mL中止消化，以170×g离心5 min，弃上清。加入含15%FBS的L-DMEM培养基4 mL重悬细胞，按50个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育，每3天换液1次。原代细胞为P0代，当细胞融合达90%时进行传代，取P3代用于实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4和诱导成骨、成软骨、成脂肪分化，鉴定培养细胞为TSCs。
1.3 实验分组及方法
实验分为4组，取P3代TSCs以2×103个/cm2密度接种于12个细胞培养皿中，每组3个培养皿，培养24 h观察细胞完全贴壁后，分别采用5.0、2.5、1.0、0 ng/mL TGF-β3培养，于1、3、5 d收集细胞进行实时荧光定量PCR检测。
1.4 实时荧光定量PCR检测
检测TSCs成肌腱分化标志性基因Ⅰ型胶原、肌腱蛋白C（tenascin C，TNC）、腱调蛋白（tenomodulin，TNMD）和Scx（scleraxis），成骨分化标志性基因Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）、ALP，成软骨分化标志性基因Sox9、Ⅱ型胶原，成脂肪分化标志性基因AP2、过氧化物酶增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）；以GAPDH作为内参。参照PrimeScript逆转录试剂盒产品说明书提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。PCR反应条件：95℃预变性8 min；95℃变性10 s、60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40个循环。采用2-ΔΔCt分析目的基因相对表达量，所有实验均重复3次。引物自行设计，由上海英骏生物公司合成，序列见表 1。
表1
实时荧光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time quantitative PCR
1.5 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度TGF-β3对TSCs成肌腱分化的影响
成肌腱分化4个标志基因表达与TGF-β3浓度、处理时间及二者交互作用均有相关性（P＜0.05）。见图 1。
图1
实时荧光定量PCR检测成肌腱分化标志性基因表达 ⓐ Ⅰ型胶原 ⓑ TNC ⓒ TNMD ⓓ Scx 图 2 实时荧光定量PCR检测成骨分化标志性基因表达 ⓐ Runx2 ⓑ ALP 图 3 实时荧光定量PCR检测成软骨分化标志性基因表达 ⓐ Sox9 ⓑ Ⅱ型胶原 图 4 实时荧光定量PCR检测成脂肪分化标志性基因表达 ⓐ AP2 ⓑPPARγ
Figure1.
The mRNA expressions of tendogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Collagen type Ⅰ ⓑ TNC ⓒ TNMD ⓓ Scx Fig. 2 The mRNA expressions of osteogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Runx2 ⓑ ALP Fig. 3 The mRNA expressions of chondrogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ Sox9 ⓑ Collagen type ⅠI Fig. 4 The mRNA expressions of adipogenic differentiation related genes by real-time quantitative PCR ⓐ AP2 ⓑ PPARγ
2.1.1 Ⅰ型胶原
Ⅰ型胶原中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=12.818，P=0.000）。
培养1 d时，5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d 时，0、2.5、5.0 ng/mL组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）； 2.5 ng/mL组中1、3 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.2 TNC
TNC中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=9.154，P=0.000）。
培养1 d时，1.0、2.5 ng/mL组与 5.0 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/mL组比较以及2.5、5.0 ng/ mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组与1.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.3 TNMD
TNMD中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=5.880，P=0.001）。
培养1 d时，0、1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/ mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5 ng/ mL与5.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/ mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中1 d与3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；以上实验组其余各时间点间比较以及0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.4 Scx
Scx中TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=3.817，P=0.008）。
培养1 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养3 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0、1.0 ng/ mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养5 d时，0、1.0、5.0 ng/ mL组与2.5 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；2.5 ng/mL组中1、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、5 d与3 d比较，差异有统计学意义（P＞0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 不同浓度TGF-β3对TSCs成骨分化的影响
2.2.1 Runx2
TGF-β3低浓度、短时间处理对Runx2表达有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、时间均相关（P＜0.05），且浓度与时间存在交互作用（t=4.680，P=0.003）。见图 2 a。
培养1 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，0、1.0 ng/mL组间比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，0、1.0、2.5 ng/ mL组与5.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）； 2.5 ng/mL组中3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.2.2 ALP
ALP表达量与TGF-β3处理时间相关（P=0.000），与TGF-β3浓度无相关（P=0.176）。TGF-β3浓度与时间存在交互作用（t=5.117，P=0.002）。见图 2 b。
培养1、3 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养5 d时，2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、5.0 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；1、3 d比较差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 不同浓度TGF-β3对TSCs成软骨分化的影响
2.3.1 Sox9
TGF-β3低浓度、短时间处理对Sox9表达有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、时间均相关（P＜0.05），且浓度与时间存在交互作用（t=3.482，P=0.013）。见图 3 a。
培养1 d时，1.0、2.5 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及2.5、5.0 ng/mL组与1.0 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养3 d时，1.0、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、2.5、5.0 ng/mL组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，0、1.0、2.5 ng/mL组与5.0 ng/ mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1 d与3、5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；3、5 d比较差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.3.2 Ⅱ型胶原
Ⅱ型胶原表达量仅与TGF-β3浓度相关（P=0.008），与TGF-β3处理时间或两者共同作用无相关（P＞0.05）。见图 3 b。
培养1、3 d时，各组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养5 d时，0、5.0 ng/ mL组间以及1.0、2.5 ng/mL组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.4 不同浓度TGF-β3对TSCs成脂肪分化的影响
2.4.1 AP2
经TGF-β3高浓度、长时间刺激对AP2表达具有促进作用，其表达量与处理时间相关（P=0.000），未见与浓度显著相关（P=0.153）；浓度与时间存在交互作用（t=6.857，P=0.000）。见图 4 a。
培养1、3 d时，各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，以及1.0、5.0 ng/mL组与2.5 ng/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.0、2.5、5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；1、3 d比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。0 ng/mL组各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
2.4.2 PPARγ
经TGF-β3低浓度、长时间刺激对PPARγ表达具有抑制作用，其表达量与TGF-β3浓度、处理时间均相关（P＜0.05）。浓度与时间存在交互作用（t=3.036，P=0.024）。见图 4 b。
培养1、3 d时，1.0、2.5 ng/mL组与0、5.0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养5 d时，1.0、2.5、5.0 ng/mL组与0 ng/mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间点其余组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
0、1.0 ng/mL组中各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；2.5 ng/mL组中3、5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5.0 ng/mL组中1、3 d与5 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
TGF-β超家族是一类结构相关性的生长因子，包括TGF-β、激活素、BMP等。这一家族在胚胎发生和组织自稳态中起着相当广泛的作用[14-15]，其能调控细胞的生长、黏附、迁移、分化、凋亡等。TGF-β超家族的经典信号转导途径为配体与跨膜受体结合，激活下游的SMAD蛋白，直接调控基因转录[16]。TGF-β作用的特异性不仅取决于配体与受体的特异性结合，也取决于不同种类受体的特异性结合[17]，从而下游形成不同种类的SMAD复合物，通过各自对DNA不同序列的选择性结合来调控基因转录，最终调节细胞的生理功能[18-20]。除此之外，TGF-β还可激活包括ERK、p38和JNK的分裂素，来激活蛋白激酶MAPKs、PI3K/Akt和小GTP酶信号通路[21-22]。
本研究探讨了不同浓度TGF-β3对TSCs分化的影响。结果表明，外源性TGF-β3对细胞分化的影响与刺激浓度、时间均有关，且单纯浓度或时间的改变即可导致细胞向不同方向分化：在低浓度、短时间刺激下，TSCs更倾向于向成肌腱方向分化，高浓度、长时间刺激在促进成肌腱分化的同时，启动了成软骨、成骨等异常分化途径。既往研究发现了TGF-β的成肌腱[23]、成软骨[24]及促进骨基质生长[25]等作用，Maeda 等[13]研究发现TGF-β可激活Scx促进成肌腱分化，但过量TGF-β释放则会导致肌腱细胞死亡。在胚胎形成期，组织中TGF-β的浓度梯度差决定了细胞分化方向[26]。TGF-β信号的复杂性可能原因在于其信号传导是一复杂的网络，研究发现TGF-β的受体与配体结合并非严格专一，受体表达不同可导致下游不同的事件[9]，每种TGF-β配体下游所产生的SMAD是特异的，但其DNA结合位点同为富含GTCT的SMAD结合位点[20]，使得TGF-β信号通路可有多种不同功能。TGF-β除了通过SMAD通路传导以外，另一条常见途径是ERK通路，这一途径不但有明显的信号放大作用[27]，其动力学也与SMAD通路不同，ERK通路启动更迅速，消退也更快，这一动力学特性可能导致了TGF-β3效应的时间相关性。除此之外，有研究表明TGF-β可通过调控microRNA的合成而调控细胞分化方向[28]。本研究仅观察了TGF-β3对TSCs分化影响的结果，其分子机制有待于从受体结合层面、细胞内信号转导层面及转录激活层面进一步研究，寻找TGF-β超家族信号网络中的关键性节点。
TGF-β信号的作用十分精密，在胚胎期的轻微改变即可导致严重后果[29]。本研究结果也证实了该结论，TGF-β3低浓度、短时间处理可诱导TSCs向成肌腱方向分化，这在体内可以促进肌腱损伤的修复，但高浓度、长时间刺激则在促进TSCs正常分化的同时启动了异常分化机制。这一现象与肌腱病组织中的细胞增多、钙化及脂肪化一致，可能是导致肌腱病的原因之一。由于TGF-β信号的多效性和精密性，其可能在肌腱微损伤修复的分化过程中起着“开关”作用，决定细胞的分化命运。TGF-β在肌腱病发生中所扮演的角色，有待进一步动物实验证实。
