引用本文： 笪琳萃, 王旻, 龚梅, 张利, 解慧琪. 软组织填充材料聚氨酯微球的制备及体外生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(5): 626-631. doi: 10.7507/1002-1892.20150134 复制
将可注射、可载药的生物医用材料应用于微创手术中，不仅可最大限度减轻患者痛苦与瘢痕形成，还能显著降低手术费用、缩短治疗时间[1-4]。微球因具有缓释、控释药物、维持较高血药浓度或靶器官浓度、疗效持久、安全等优点，常作为药物的缓释载体应用于医学领域[5-10]。近年来，由于微球可携载生长因子或药物进行组织修复或治疗，且可运用于微创手术领域，逐渐成为组织工程领域的研究热点[9, 11-13]。
聚氨酯微球的分子设计自由度大，其力学性能、降解性能、孔结构及其所带电荷均可通过反应条件控制，且具有良好的吸附、离子交换、螯合能力、高弹性和高强度等特点，因此有望作为一种新的医用填充材料[5, 14-19]。目前聚氨酯微球材料在软组织填充方面的研究罕有报道，本研究采用自乳化法制备了具有不同形貌结构的聚氨酯微球，通过体外与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothe lial cells，HUVECs）联合培养的方法，初步评价了聚氨酯微球对细胞存活、增殖的影响。此外，我们还对材料的浸提液做了溶血实验，初步观察了聚氨酯微球的血液相容性，为进一步体内实验及临床应用提供 参考依据，探讨其用于软组织填充材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔1只，雌雄不限，体重2.5 kg，由四川大学动物实验中心提供。HUVECs引自中科院上海细胞库。
异佛尔酮二异氰酸酯、聚四氢呋喃醚1000、2，2-二羟甲基丙酸、辛酸亚锡（上海晶纯生化科技股份有限公司）；三乙胺（成都市科龙化工试剂厂）；H-DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；钙黄绿素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式会社同仁化学研究所，日本）。
170SX型傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet公司，美国）；Model X-630型扫描电镜（Hitachi公司，日本）；CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本）；超净工作台（Thermo公司，美国）；E600型荧光显微镜、TE2000-U型光学显微镜（Nikon公司，日本）；连续光谱微孔板测读仪（Molecular Devices公司，美国）。
1.2 聚氨酯微球的制备及理化性能检测
1.2.1 聚氨酯微球制备
将0.144 mol异佛尔酮二异氰酸酯、0.054 mol聚四氢呋喃醚1000加入三颈瓶中，75℃反应3 h；然后降温至50℃，加入0.054 mol 2，2-二羟甲基丙酸和一定量催化剂辛酸亚锡，55℃反应3～4 h；最后在室温下将聚氨酯预聚物加入200 mL 0.54 mol/L三乙胺水溶液中，分别以乳化速率1 000、2 000、3 000、4 000 r/min乳化约2 h，得到各微球乳液样品。以离心半径5.7 cm、1 500 r/min离心10 min，所得样品用去离子水洗涤2次，-50℃真空冷冻干燥备用。
1.2.2 理化性能检测
① 傅里叶变换红外光谱分析：用傅里叶变换红外光谱仪测试乳化速率为2 000 r/min、乳化时间为2 h的干燥聚氨酯微球分子结构，扫描波数范围为400～4 000 cm-1。
1.2.3 微球形态学观察
取各乳化速率乳化2 h的微球样品，依次进行冷冻干燥、喷金，扫描电镜观察微球表面形貌。再将乳化速率为2 000 r/min，乳化时间为30、60、90、120 min制得的聚氨酯乳液分别滴于载玻片上，光镜观察微球形貌；将乳液涂膜后，室温下挥发成膜，扫描电镜观察其表面与横截面。根据扫描电镜结果，选择球形度较好的乳化速率制备的聚氨酯微球用于后续体外生物相容性实验研究。
1.3 聚氨酯微球浸提液制备及细胞培养
根据GB/T 16886.12标准[20]92-94规定的浸提比例（试样表面积/浸提液体积=6∶1），将材料分别浸泡于含10%FBS的H-DMEM培养基（用于HUVECs增殖活力检测）和生理盐水（用于溶血实验检测），于37℃、5%CO2隔水式恒温培养箱中浸提24 h，制得浸提原液。
取HUVECs置于含10%FBS的H-DMEM培养基中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养，每隔1 d换液1次；取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后以1 000 r/min离心3 min备用。
1.4 观测指标
1.4.1 Calcein-AM/PI双染观察
将聚氨酯微球制成的薄膜制成直径大小为16 mm的圆片并黏在盖玻片上，环氧乙烷灭菌。将材料置于6孔板中，每组设3个复孔，于无血清的H-DMEM培养基中浸泡24 h。同1.3方法培养细胞，以1×105个/孔密度将细胞分别接种于聚氨酯材料上（材料组）和盖玻片上（对照组）。在3 mL含10%FBS的H-DMEM培养基中培养3 d后吸出培养基，PBS洗涤2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室温下避光染色30 min，PBS洗涤2遍，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞质绿染为活细胞，红染为死细胞。
1.4.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
同1.3方法制备浸提液及培养HUVECs，取对数生长期的HU VECs细胞悬液以2×103个/孔密度接种于96孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养24 h使细胞充分贴壁，弃原液。实验分为3 组：阳性对照组（A组）、聚氨酯微球组（B组）及空白对照组（C组），每组设4个复孔。A组每孔加入100 μL含1%苯酚、10%FBS的H-DMEM培养基培养，B组每孔加入100 μL聚氨酯微球浸提原液培养，C组每孔加入100 μL含10%FBS的H-DMEM培养基培养，隔天换液。分别于培养1、3、5 d后每孔加入110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中孵育3 h，采用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度（A）值，计算各组均值，并绘制细胞生长曲线。
1.4.3 溶血实验测定血液相容性
根据GB/T 16886.4标准[20]234-235，取兔耳缘静脉抗凝血，按新鲜抗凝血∶生理盐水= 4∶5 的比例稀释。同1.3方法制备浸提液作为实验组，生理盐水作为阴性对照组，蒸馏水作为阳性对照组。每组各加稀释兔血0.2 mL，于37℃水浴中保温60 min后，以5.7 cm、1 500 r/ min离心5 min。观察各组溶血情况，并测定上清在545 nm波长处的A值。按以下公式计算溶血率（hemolysis rate，HR）： （实验组A值－阴性对照组A值）/（阳性对照组A值－阴性对照组A值）×100%。根据GB/T 16886.4标准，阳性对照A值为0.8±0.3，阴性对照A值应≤0.03，当待测样本HR≥5%认为实验材料有溶血作用。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 聚氨酯微球理化性能检测
2.1.1 傅里叶变换红外光谱分析
聚氨酯微球的红外吸收光谱图显示，3 500 cm-1的宽峰为氨基甲酸酯结构中N-H的伸缩振动吸收峰，1 054 cm-1附近是典型的醚键特征峰。1 740 cm-1附近处的吸收峰为氨酯基中C=O的伸缩振动峰，1 385 cm-1处出现了较为明显的氨基甲酸酯的微区结晶峰。而且2 240～2 270 cm-1区域内异氰酸根基团特征吸收峰基本消失，说明聚氨酯体系中的异氰酸根已完全参与了反应。这些特征峰的出现或消失表明实验成功合成了聚氨酯。见图 1。
图1
聚氨酯微球的红外吸收光谱图
Figure1.
Fourier transform infrared spectrometer of polyurethane microsphere
2.1.2 微球形态学观察
不同乳化速率下所得微球的扫描电镜观察示，乳化速率为1 000 r/min时微球粒径较大，球形度不佳且团聚成块（图 2 a）；乳化速率为2 000 r/min时微球分散为球形度佳且粒径分布及大小均较理想的颗粒，仅有少量微球发生了团聚（图 2 b）；乳化速率为3 000 r/min时，聚氨酯乳液形成蛛网状和块状的不规则聚集体（图 2 c）；乳化速率为4 000 r/min时，乳液中的聚氨酯微球彻底变形，形成多孔疏松的丝状物（图 2 d）。光镜观察示，乳化速率为2 000 r/min乳化30 min时，聚氨酯预聚物聚集为粒径很小的微球（图 3 a）；小微球相互碰撞聚集形成粒径较大的微球，在乳化60 min时可见明显的大粒径微球包裹小粒径微球的结构（图 3 b）；乳化90 min时微球粒径变小（图 3 c）；乳化120 min时微球的大小和结构趋于稳定（图 3 d）。将乳液涂膜后，室温下挥发成膜的表面与横截面扫描电镜观察示，薄膜表面为粗糙的致密结构（图 4 a）；截面的孔径分布范围较宽，呈现不均匀的多孔结构（图 4 b）。综上，选择乳化速率为2 000 r/min制备的聚氨酯微球用于后续研究。
图2
不同乳化速率时微球形貌扫描电镜观察 ⓐ 1 000 r/min（×500） ⓑ 2 000 r/min （×2 000） ⓒ 3 000 r/ min（×1 000） ⓓ 4 000 r/ min（×200） 图 3 乳化速率2 000 r/min下不同乳化时间时微球形貌光镜观察 ⓐ 30 min（×400） ⓑ 60 min（×200） ⓒ 90 min（×200） ⓓ 120 min（×100） 图 4 微球成膜的扫描电镜观察 ⓐ 膜表面（×70） ⓑ 膜横截面（×60） 图 5 培养3 d Calcein-AM/PI双染观察（荧光显微镜×200） ⓐ 材料组 ⓑ 对照组 图 6 CCK-8法检测各组培养各时间点细胞增殖活力 图 7 各组溶血实验观察 ⓐ 实验组 ⓑ 阴性对照组 ⓒ 阳性对照组
Figure2.
SEM observation of microspheres at different emulsification rates ⓐ 1 000 r/min (×500) ⓑ 2 000 r/min (×2 000) ⓒ 3 000 r/ min (×1 000) ⓓ 4 000 r/min (×200) Fig. 3 Light microscope observation of microspheres at different emulsification periods at 2 000 r/min ⓐ Thirty minutes (×400) ⓑ Sixty minutes (×200) ⓒ Ninety minutes (×200) ⓓ One hundred and twenty minutes (×100) Fig. 4 SEM observation of membranes consisting of microspheres ⓐ Surface (×70) ⓑ Section (×60) Fig. 5 Calcein-AM/PI staining of HUVECs on the surface of materials and cover slip (Fluorescence microscopy×200) ⓐ Material group ⓑ Control group Fig. 6 Cell viability of each group by CCK-8 assay at 1,3,and 5 days Fig. 7 Hemolysis observation of micropheres and controls ⓐ Polyurethane microspheres extracts group ⓑ Negative control group ⓒ Positive control group
2.2 聚氨酯微球生物相容性检测
2.2.1 Calcein-AM/PI双染观察
荧光显微镜观察示，培养3 d后材料组与对照组表面均以绿染的活细胞为主，细胞形态良好，轮廓清晰。其中材料组只有零星死细胞，表面细胞形态以铺路石状为主，细胞更为饱满，伸展性更好，细胞间通过伪足相互紧密连接（图 5 a）。对照组虽然死细胞较少，细胞形态也较为理想，但其表面细胞黏附较少，细胞间连接较为疏松（图 5 b）。
2.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
细胞生长曲线示，A组A值较低，细胞几乎不生长；B、C组A值呈时间依赖性，随培养时间延长而升高。各时间点B、C组A值均高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中培养1 d时，B、C组A值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3、5 d时B组A值高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 6。
2.2.3 溶血实验测定血液相容性
阴性对照组及实验组的上清液澄清透明，红细胞均完好沉淀于玻璃试管底部，无溶血发生；而阳性对照组红细胞全部破裂，溶液呈红色，底部未见红细胞沉淀；见图 7。阳性对照组A值为0.864±0.002，阴性对照组A值为0.015±0.001，实验组HR值为0.39%±0.07%（＜5%），表明材料无溶血作用。
3 讨论
自乳化法是将带有亲水性基团的小分子接到聚合物链上，使之可在剪切力作用下分散于水溶液中[21]。本研究先将亲水基接入聚氨酯链段，然后加入醋酸进行中和，得到了稳定的聚氨酯链段微球。乳化步骤中成盐剂、乳化方式、乳化温度、搅拌速度等一系列条件的选择对聚氨酯微球的粒径、形状有重要影响，甚至直接关系到制备实验的成败[22]。本研究通过一系列实验摸索，选择醋酸为成盐剂，自乳化法为乳化方式，室温为乳化温度，乳化速率分别为1 000、2 000、3 000和4 000 r/min，制备了一系列微球乳液样品，离心后得到聚氨酯微球。
材料表面的理化特性，如表面粗糙度、孔径、孔隙度、亲疏水性等，对细胞的行为尤其是细胞黏附影响较大[23-24]。而材料表面形态又与其制备条件密切相关，本研究对不同乳化速率下所得微球进行了表征。扫描电镜观察示，微球形貌因其在制备过程中的乳化速率而异，其中乳化速率为2 000 r/min时制得的微球球形度、粒径分布及大小均较为理想。光镜观察示，聚氨酯预聚物在水中分散成小的微球颗粒，其中亲水基团分布在微球的表面形成壳，疏水的链段向内卷曲形成核。随着乳化时间延长，微球相互碰撞长大，小粒径微球被包裹于大粒径微球内部。聚氨酯乳液经室温挥发后可得到聚氨酯薄膜，扫描电镜观察示其表面具有一定粗糙度，利于细胞黏附。
聚氨酯微球为合成高分子材料，合成过程中使用了有机溶剂丙酮、催化剂辛酸亚锡，这些因素可能会对其生物相容性造成一定影响。本研究中我们采用材料体外生物相容性评价常用的HUVECs，用CCK-8法研究制备的聚氨酯微球细胞毒性。结果显示，各组A值随培养时间延长而升高，B、C组各时间点细胞增殖活力均高于C组，且3、5 d时B组细胞增殖活力高于C组，提示聚氨酯微球对细胞的毒性较小。此外，活死细胞染色结果也显示材料组HUVECs的形态较为理想，而且材料的粗糙表面对细胞黏附具有促进作用。上述研究结果表明材料无明显细胞毒性。
直接或间接接触血液的材料，可能与血液成分发生作用导致血栓形成、溶血、血液中有形成分改变等发生，血液相容性是材料生物学评价的重要组成部分。本研究采用评价血液相容性的经典方法--溶血实验，对聚氨酯微球进行生物学评价。结果显示，实验组的HR为0.39%±0.07%，表明溶血实验结果可靠，材料无溶血作用。
综上述，我们通过自乳化法制备了球形度较好的聚氨酯微球，其化学结构及相对分子质量可通过调节反应原料的投料比等方法进行控制，具有高度的可设计性。同时聚氨酯微球的细胞毒性低，细胞能够较好黏附于材料表面，细胞状态佳，且具备良好血液相容性，有望用作软组织缺损的填充材料。在后续研究中，我们将通过动物实验对聚氨酯微球的体内生物相容性进行评价，并根据组织缺损部位的类型复合功能性生物活性材料，拓宽其可能的应用范围。
将可注射、可载药的生物医用材料应用于微创手术中，不仅可最大限度减轻患者痛苦与瘢痕形成，还能显著降低手术费用、缩短治疗时间[1-4]。微球因具有缓释、控释药物、维持较高血药浓度或靶器官浓度、疗效持久、安全等优点，常作为药物的缓释载体应用于医学领域[5-10]。近年来，由于微球可携载生长因子或药物进行组织修复或治疗，且可运用于微创手术领域，逐渐成为组织工程领域的研究热点[9, 11-13]。
聚氨酯微球的分子设计自由度大，其力学性能、降解性能、孔结构及其所带电荷均可通过反应条件控制，且具有良好的吸附、离子交换、螯合能力、高弹性和高强度等特点，因此有望作为一种新的医用填充材料[5, 14-19]。目前聚氨酯微球材料在软组织填充方面的研究罕有报道，本研究采用自乳化法制备了具有不同形貌结构的聚氨酯微球，通过体外与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothe lial cells，HUVECs）联合培养的方法，初步评价了聚氨酯微球对细胞存活、增殖的影响。此外，我们还对材料的浸提液做了溶血实验，初步观察了聚氨酯微球的血液相容性，为进一步体内实验及临床应用提供 参考依据，探讨其用于软组织填充材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔1只，雌雄不限，体重2.5 kg，由四川大学动物实验中心提供。HUVECs引自中科院上海细胞库。
异佛尔酮二异氰酸酯、聚四氢呋喃醚1000、2，2-二羟甲基丙酸、辛酸亚锡（上海晶纯生化科技股份有限公司）；三乙胺（成都市科龙化工试剂厂）；H-DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；钙黄绿素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式会社同仁化学研究所，日本）。
170SX型傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet公司，美国）；Model X-630型扫描电镜（Hitachi公司，日本）；CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本）；超净工作台（Thermo公司，美国）；E600型荧光显微镜、TE2000-U型光学显微镜（Nikon公司，日本）；连续光谱微孔板测读仪（Molecular Devices公司，美国）。
1.2 聚氨酯微球的制备及理化性能检测
1.2.1 聚氨酯微球制备
将0.144 mol异佛尔酮二异氰酸酯、0.054 mol聚四氢呋喃醚1000加入三颈瓶中，75℃反应3 h；然后降温至50℃，加入0.054 mol 2，2-二羟甲基丙酸和一定量催化剂辛酸亚锡，55℃反应3～4 h；最后在室温下将聚氨酯预聚物加入200 mL 0.54 mol/L三乙胺水溶液中，分别以乳化速率1 000、2 000、3 000、4 000 r/min乳化约2 h，得到各微球乳液样品。以离心半径5.7 cm、1 500 r/min离心10 min，所得样品用去离子水洗涤2次，-50℃真空冷冻干燥备用。
1.2.2 理化性能检测
① 傅里叶变换红外光谱分析：用傅里叶变换红外光谱仪测试乳化速率为2 000 r/min、乳化时间为2 h的干燥聚氨酯微球分子结构，扫描波数范围为400～4 000 cm-1。
1.2.3 微球形态学观察
取各乳化速率乳化2 h的微球样品，依次进行冷冻干燥、喷金，扫描电镜观察微球表面形貌。再将乳化速率为2 000 r/min，乳化时间为30、60、90、120 min制得的聚氨酯乳液分别滴于载玻片上，光镜观察微球形貌；将乳液涂膜后，室温下挥发成膜，扫描电镜观察其表面与横截面。根据扫描电镜结果，选择球形度较好的乳化速率制备的聚氨酯微球用于后续体外生物相容性实验研究。
1.3 聚氨酯微球浸提液制备及细胞培养
根据GB/T 16886.12标准[20]92-94规定的浸提比例（试样表面积/浸提液体积=6∶1），将材料分别浸泡于含10%FBS的H-DMEM培养基（用于HUVECs增殖活力检测）和生理盐水（用于溶血实验检测），于37℃、5%CO2隔水式恒温培养箱中浸提24 h，制得浸提原液。
取HUVECs置于含10%FBS的H-DMEM培养基中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养，每隔1 d换液1次；取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后以1 000 r/min离心3 min备用。
1.4 观测指标
1.4.1 Calcein-AM/PI双染观察
将聚氨酯微球制成的薄膜制成直径大小为16 mm的圆片并黏在盖玻片上，环氧乙烷灭菌。将材料置于6孔板中，每组设3个复孔，于无血清的H-DMEM培养基中浸泡24 h。同1.3方法培养细胞，以1×105个/孔密度将细胞分别接种于聚氨酯材料上（材料组）和盖玻片上（对照组）。在3 mL含10%FBS的H-DMEM培养基中培养3 d后吸出培养基，PBS洗涤2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室温下避光染色30 min，PBS洗涤2遍，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞质绿染为活细胞，红染为死细胞。
1.4.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
同1.3方法制备浸提液及培养HUVECs，取对数生长期的HU VECs细胞悬液以2×103个/孔密度接种于96孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养24 h使细胞充分贴壁，弃原液。实验分为3 组：阳性对照组（A组）、聚氨酯微球组（B组）及空白对照组（C组），每组设4个复孔。A组每孔加入100 μL含1%苯酚、10%FBS的H-DMEM培养基培养，B组每孔加入100 μL聚氨酯微球浸提原液培养，C组每孔加入100 μL含10%FBS的H-DMEM培养基培养，隔天换液。分别于培养1、3、5 d后每孔加入110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中孵育3 h，采用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度（A）值，计算各组均值，并绘制细胞生长曲线。
1.4.3 溶血实验测定血液相容性
根据GB/T 16886.4标准[20]234-235，取兔耳缘静脉抗凝血，按新鲜抗凝血∶生理盐水= 4∶5 的比例稀释。同1.3方法制备浸提液作为实验组，生理盐水作为阴性对照组，蒸馏水作为阳性对照组。每组各加稀释兔血0.2 mL，于37℃水浴中保温60 min后，以5.7 cm、1 500 r/ min离心5 min。观察各组溶血情况，并测定上清在545 nm波长处的A值。按以下公式计算溶血率（hemolysis rate，HR）： （实验组A值－阴性对照组A值）/（阳性对照组A值－阴性对照组A值）×100%。根据GB/T 16886.4标准，阳性对照A值为0.8±0.3，阴性对照A值应≤0.03，当待测样本HR≥5%认为实验材料有溶血作用。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 聚氨酯微球理化性能检测
2.1.1 傅里叶变换红外光谱分析
聚氨酯微球的红外吸收光谱图显示，3 500 cm-1的宽峰为氨基甲酸酯结构中N-H的伸缩振动吸收峰，1 054 cm-1附近是典型的醚键特征峰。1 740 cm-1附近处的吸收峰为氨酯基中C=O的伸缩振动峰，1 385 cm-1处出现了较为明显的氨基甲酸酯的微区结晶峰。而且2 240～2 270 cm-1区域内异氰酸根基团特征吸收峰基本消失，说明聚氨酯体系中的异氰酸根已完全参与了反应。这些特征峰的出现或消失表明实验成功合成了聚氨酯。见图 1。
图1
聚氨酯微球的红外吸收光谱图
Figure1.
Fourier transform infrared spectrometer of polyurethane microsphere
2.1.2 微球形态学观察
不同乳化速率下所得微球的扫描电镜观察示，乳化速率为1 000 r/min时微球粒径较大，球形度不佳且团聚成块（图 2 a）；乳化速率为2 000 r/min时微球分散为球形度佳且粒径分布及大小均较理想的颗粒，仅有少量微球发生了团聚（图 2 b）；乳化速率为3 000 r/min时，聚氨酯乳液形成蛛网状和块状的不规则聚集体（图 2 c）；乳化速率为4 000 r/min时，乳液中的聚氨酯微球彻底变形，形成多孔疏松的丝状物（图 2 d）。光镜观察示，乳化速率为2 000 r/min乳化30 min时，聚氨酯预聚物聚集为粒径很小的微球（图 3 a）；小微球相互碰撞聚集形成粒径较大的微球，在乳化60 min时可见明显的大粒径微球包裹小粒径微球的结构（图 3 b）；乳化90 min时微球粒径变小（图 3 c）；乳化120 min时微球的大小和结构趋于稳定（图 3 d）。将乳液涂膜后，室温下挥发成膜的表面与横截面扫描电镜观察示，薄膜表面为粗糙的致密结构（图 4 a）；截面的孔径分布范围较宽，呈现不均匀的多孔结构（图 4 b）。综上，选择乳化速率为2 000 r/min制备的聚氨酯微球用于后续研究。
图2
不同乳化速率时微球形貌扫描电镜观察 ⓐ 1 000 r/min（×500） ⓑ 2 000 r/min （×2 000） ⓒ 3 000 r/ min（×1 000） ⓓ 4 000 r/ min（×200） 图 3 乳化速率2 000 r/min下不同乳化时间时微球形貌光镜观察 ⓐ 30 min（×400） ⓑ 60 min（×200） ⓒ 90 min（×200） ⓓ 120 min（×100） 图 4 微球成膜的扫描电镜观察 ⓐ 膜表面（×70） ⓑ 膜横截面（×60） 图 5 培养3 d Calcein-AM/PI双染观察（荧光显微镜×200） ⓐ 材料组 ⓑ 对照组 图 6 CCK-8法检测各组培养各时间点细胞增殖活力 图 7 各组溶血实验观察 ⓐ 实验组 ⓑ 阴性对照组 ⓒ 阳性对照组
Figure2.
SEM observation of microspheres at different emulsification rates ⓐ 1 000 r/min (×500) ⓑ 2 000 r/min (×2 000) ⓒ 3 000 r/ min (×1 000) ⓓ 4 000 r/min (×200) Fig. 3 Light microscope observation of microspheres at different emulsification periods at 2 000 r/min ⓐ Thirty minutes (×400) ⓑ Sixty minutes (×200) ⓒ Ninety minutes (×200) ⓓ One hundred and twenty minutes (×100) Fig. 4 SEM observation of membranes consisting of microspheres ⓐ Surface (×70) ⓑ Section (×60) Fig. 5 Calcein-AM/PI staining of HUVECs on the surface of materials and cover slip (Fluorescence microscopy×200) ⓐ Material group ⓑ Control group Fig. 6 Cell viability of each group by CCK-8 assay at 1,3,and 5 days Fig. 7 Hemolysis observation of micropheres and controls ⓐ Polyurethane microspheres extracts group ⓑ Negative control group ⓒ Positive control group
2.2 聚氨酯微球生物相容性检测
2.2.1 Calcein-AM/PI双染观察
荧光显微镜观察示，培养3 d后材料组与对照组表面均以绿染的活细胞为主，细胞形态良好，轮廓清晰。其中材料组只有零星死细胞，表面细胞形态以铺路石状为主，细胞更为饱满，伸展性更好，细胞间通过伪足相互紧密连接（图 5 a）。对照组虽然死细胞较少，细胞形态也较为理想，但其表面细胞黏附较少，细胞间连接较为疏松（图 5 b）。
2.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
细胞生长曲线示，A组A值较低，细胞几乎不生长；B、C组A值呈时间依赖性，随培养时间延长而升高。各时间点B、C组A值均高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中培养1 d时，B、C组A值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3、5 d时B组A值高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 6。
2.2.3 溶血实验测定血液相容性
阴性对照组及实验组的上清液澄清透明，红细胞均完好沉淀于玻璃试管底部，无溶血发生；而阳性对照组红细胞全部破裂，溶液呈红色，底部未见红细胞沉淀；见图 7。阳性对照组A值为0.864±0.002，阴性对照组A值为0.015±0.001，实验组HR值为0.39%±0.07%（＜5%），表明材料无溶血作用。
3 讨论
自乳化法是将带有亲水性基团的小分子接到聚合物链上，使之可在剪切力作用下分散于水溶液中[21]。本研究先将亲水基接入聚氨酯链段，然后加入醋酸进行中和，得到了稳定的聚氨酯链段微球。乳化步骤中成盐剂、乳化方式、乳化温度、搅拌速度等一系列条件的选择对聚氨酯微球的粒径、形状有重要影响，甚至直接关系到制备实验的成败[22]。本研究通过一系列实验摸索，选择醋酸为成盐剂，自乳化法为乳化方式，室温为乳化温度，乳化速率分别为1 000、2 000、3 000和4 000 r/min，制备了一系列微球乳液样品，离心后得到聚氨酯微球。
材料表面的理化特性，如表面粗糙度、孔径、孔隙度、亲疏水性等，对细胞的行为尤其是细胞黏附影响较大[23-24]。而材料表面形态又与其制备条件密切相关，本研究对不同乳化速率下所得微球进行了表征。扫描电镜观察示，微球形貌因其在制备过程中的乳化速率而异，其中乳化速率为2 000 r/min时制得的微球球形度、粒径分布及大小均较为理想。光镜观察示，聚氨酯预聚物在水中分散成小的微球颗粒，其中亲水基团分布在微球的表面形成壳，疏水的链段向内卷曲形成核。随着乳化时间延长，微球相互碰撞长大，小粒径微球被包裹于大粒径微球内部。聚氨酯乳液经室温挥发后可得到聚氨酯薄膜，扫描电镜观察示其表面具有一定粗糙度，利于细胞黏附。
聚氨酯微球为合成高分子材料，合成过程中使用了有机溶剂丙酮、催化剂辛酸亚锡，这些因素可能会对其生物相容性造成一定影响。本研究中我们采用材料体外生物相容性评价常用的HUVECs，用CCK-8法研究制备的聚氨酯微球细胞毒性。结果显示，各组A值随培养时间延长而升高，B、C组各时间点细胞增殖活力均高于C组，且3、5 d时B组细胞增殖活力高于C组，提示聚氨酯微球对细胞的毒性较小。此外，活死细胞染色结果也显示材料组HUVECs的形态较为理想，而且材料的粗糙表面对细胞黏附具有促进作用。上述研究结果表明材料无明显细胞毒性。
直接或间接接触血液的材料，可能与血液成分发生作用导致血栓形成、溶血、血液中有形成分改变等发生，血液相容性是材料生物学评价的重要组成部分。本研究采用评价血液相容性的经典方法--溶血实验，对聚氨酯微球进行生物学评价。结果显示，实验组的HR为0.39%±0.07%，表明溶血实验结果可靠，材料无溶血作用。
综上述，我们通过自乳化法制备了球形度较好的聚氨酯微球，其化学结构及相对分子质量可通过调节反应原料的投料比等方法进行控制，具有高度的可设计性。同时聚氨酯微球的细胞毒性低，细胞能够较好黏附于材料表面，细胞状态佳，且具备良好血液相容性，有望用作软组织缺损的填充材料。在后续研究中，我们将通过动物实验对聚氨酯微球的体内生物相容性进行评价，并根据组织缺损部位的类型复合功能性生物活性材料，拓宽其可能的应用范围。
