引用本文： 龚铭, 黄胜, 罗嘉全, 黄保丁, 周治宇, 代学俊, 高蔓蔓, 李亮平, 邹学农. 低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(7): 857-862. doi: 10.7507/1002-1892.20150186 复制
细胞外微环境包括氧浓度、酸碱度、渗透压及应力等，它们均可对细胞自身功能状态发挥调控作用[1]。其中，低氧因素在干细胞分化与代谢方面发挥着至关重要的作用，低氧状态可激活干细胞不同的分子机制，从而使细胞适应缺氧微环境[2]。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下（21%O2）也有表达，但合成的HIF蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下才可稳定表达[3]。已有相关研究证明，HIF可促进干细胞的成骨、成软骨分化[2, 4-6]。HIF具有不同亚型，目前研究较多的HIF-1α被认为是主要参与调节并维持低氧状态下细胞新陈代谢、促进干细胞分化的功能因子，HIF的其他亚型如2α、3α如何参与干细胞的代谢及分化调控作用仍不十分清楚[3, 7-9]。而且，HIF-1α主要在肝脏、胰腺、胃等脏器中表达，HIF-2α主要在肾、肺及血管内皮细胞中表达[3, 7]。对不同脏器的选择性表达也提示了HIF的不同亚型可能在功能调控上具有不同的侧重点。本研究中，我们利用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）诱导成软骨分化，探讨HIF-1α、2α在该过程中的表达，为进一步阐明其功能奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
H/L-DMEM （Thermo Fisher Scientific公司，美国）；Trizol、FBS（Invitrogen公司，美国）；Total RNA逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂（大连TaKaRa公司）；TGF-β3（Peprotech公司，美国）；细胞总蛋白裂解液及BCA试剂盒、ECL发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美国）；HIF-1α与HIF-2α抗体（Abcam公司，英国）；地塞米松（dexamethasone，Dex）、二磷酸抗坏血酸（ascorbic acid，AsAp）（Sigma公司，美国）；胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS；BD公司，英国）；（1.007±0.001）g/mL淋巴细胞分离液（GE Healthcare公司，瑞士）；胰蛋白酶粉（GIBCO公司，美国）；氯仿、异丙醇（广州化学试剂厂）。细胞培养瓶（Corn ing公司，美国）； BD53低氧培养箱（Binder公司，德国）；TS100倒置光学/荧光多功能显微镜（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度计（Thermo公司，美国）。
1.2 hBMSCs的分离、培养及传代
经中山大学附属第一医院伦理委员会批准并经患者同意后，选取2013年8月－2014年2月于中山大学附属第一医院进行脊柱手术的6例患者为研究对象，其中男3例，女3例；年龄41～59岁。术中用50 mL注射器抽取腰椎骨髓血15～25 mL，取15 mL离心管，按体积比4∶3先后加入淋巴细胞分离液及骨髓液，室温以离心半径16 cm、1 200 r/ min离心45 min。小心吸弃上层水相至中间絮状细胞层，将中间细胞层移至另一15 mL离心管，加入适量L-DMEM，混匀，同上法离心5 min；弃上清，再加入2～3 mL含10%FBS的L-DMEM，吹打悬浮细胞。将该细胞悬浮液转移至25 cm2细胞培养瓶中，加入5 mL含10%FBS的L-DMEM，混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养；2 d后首次换液，之后每3天全量换液；约14 d原代hBMSCs增长至80%～90%融合时，室温下以2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集细胞，以1∶3比例传代接种于75 cm2细胞培养瓶，每3天更换培养液，继续消化传代培养。
1.3 实验分组及方法
根据文献[8, 10]方法采用离心成球法诱导hBMSCs成软骨分化。将第5～7代hBMSCs以5×105个/mL细胞密度转移至15 mL离心管中，以离心半径16 cm、1 300 r/min离心5 min，于离心管底部形成一细胞微团。弃上清后，将细胞分为对照组与成软骨诱导组，对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基，成软骨诱导组加入软骨诱导液（含2%FBS、10 ng/ mL TGF-β3、100 nmol/L Dex、50 μg/mL AsAp、40 μg/ mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1∶100稀释的ITS+Premix的H-DMEM培养基）。将两组细胞置于低氧（2%O2）培养箱中，每3天换液1次，分别于各时间点收集细胞微球进行以下观测。
1.4 观测指标
1.4.1 组织学及免疫组织化学染色观察
培养3周后收集两组细胞微球，经PBS清洗、固定、包埋、脱蜡后，行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。
1.4.2 Western
blot检测培养1周后收集两组细胞微球，加入约100 μL总蛋白裂解液，用枪头反复吹打形成均质的悬浊液，BCA法测定蛋白浓度；蛋白煮沸变性后取20 μg等量样本行SDS-PAGE分离，然后将蛋白转至PVDF膜上，1%牛血清白蛋白封闭后，分别加入抗HIF-1α与HIF-2α抗体，内参抗体为β-actin，4℃过夜，TBST洗膜10 min；加入二抗洗膜后用ECL发光试剂显影，X线片曝光后将胶片显影及定影。釆用Image J软件测量目的条带的吸光度（A）值，以β-actin条带为内参照进行蛋白上样量校正（校正值=目的条带A值/β-actin条带A值），以校正值对HIF-1α和HIF-2α蛋白表达水平进行半定量分析。
1.4.3 实时定量PCR检测
采用实时定量PCR法检测成软骨分化过程关键启动基因Sox-9，软骨标志基因Ⅱ型胶原、多聚蛋白聚糖（Aggrecan），软骨终末分化阶段标志基因Ⅹ型胶原的基因表达，以及HIF-1α、HIF-2α基因表达。培养1、2、3周分别收集两组细胞微球，按照Trizol说明书方法提取细胞总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测总RNA纯度及含量，逆转录总RNA，cDNA置于- 20℃保存。根据实时定量PCR试剂盒说明书进行反应，反应总体系10 μL；反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40个循环；内参为18 s。基因扩增引物序列见表 1。采用2-ΔΔCt公式计算各基因mRNA相对表达量。
表1
各基因引物序列及产物大小
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.5 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 组织学及免疫组织化学染色观察
甲苯胺蓝染色示，两组软骨细胞基质呈浅蓝色，细胞核呈深蓝色。对照组染色细胞核整体分布稀疏，细胞基质染色较浅；而成软骨诱导组染色细胞液分布致密，细胞基质染色明显较对照组深。见图 1。
图1
培养3周两组甲苯胺蓝染色观察（×40） ⓐ 对照组 ⓑ 成软骨诱导组 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，两组细胞可见被染成棕黄色的Ⅱ型胶原蛋白，阳性表达主要位于细胞质内，细胞质与细胞外基质连成片状；细胞核呈蓝色；在部分细胞周围可观察到陷窝样空隙。与成软骨诱导组相比，对照组细胞核分布较稀疏且着色浅（图 2），Ⅱ型胶原表达含量少。
2.2 Western blot检测
培养1周时，成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量分别为0.386±0.015、0.118±0.002，均显著低于对照组的0.525±0.024和0.163±0.010，差异有统计学意义（t=8.345，P=0.001；t=7.683，P=0.002）。见图 3。
2.3 实时定量PCR检测
与对照组比较，成软骨诱导组HIF-1α mRNA相对表达量在培养1周时降低，而在2周时显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养3周时两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。成软骨诱导组HIF-2α的表达在分化过程中均受抑制，培养各时间点HIF-2α mRNA相对表达量均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。成软骨诱导组Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），以2周时表达最高。培养过程中Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原呈逐渐增加趋势，2、3周时其mRNA相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而成软骨诱导组Aggrecan mRNA相对表达量在培养各时间点均有升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
3 讨论
人正常软骨组织中含有软骨细胞、基质及纤维成分，其中软骨基质内胶原约占软骨有机成分的40%[11]；而软骨细胞能不断产生新的软骨基质，其主要组成成分是酸性糖胺多糖。由于软骨组织的营养物质主要是通过渗透作用进入组织内部，仅在软骨的边缘及浅表位置含有少量血管来营养细胞。因此，软骨组织这种生理特点决定其一旦损伤后则难以通过自身方式得到修复。目前临床上关节软骨损伤的治疗效果均不令人满意。而随着对干细胞领域的深入研究，干细胞治疗关节软骨损伤为临床提供了一种可能的途径。
目前，运用离心沉淀法将干细胞聚集，使细胞与细胞之间形成空间上的紧密接触，从而在体外模拟三维培养，可满足诱导干细胞成软骨分化的要求[12]。有文献指出，三维立体培养是诱导干细胞成软骨分化的必要条件之一[12]。干细胞在体外分化成软骨的过程中，早期由于关键转录因子Sox-9的启动，从而使Ⅱ型胶原与Aggrecan表达增加，分泌的胶原纤维与蛋白多糖不断被修饰并改造；晚期软骨细胞体积增大，Ⅱ型胶原逐渐改造形成特定空间结构排列的Ⅹ型胶原，该过程为软骨分化的成熟阶段，表明干细胞最终向软骨分化[1]。本实验中，实时定量PCR结果表明，与透明软骨相关的Ⅱ型胶原和Aggrecan表达升高，提示干细胞分泌细胞外基质成分增加，为最终向软骨成熟作准备；终末分化Ⅹ型胶原表达增多提示软骨肥大成熟。目前认为Sox-9可启动Aggre can及Ⅱ型胶原的转录，从而最终分化为软骨组织，且低氧下能促进Sox-9的表达而有利于软骨分化[13-14]。本实验中Sox-9的表达与Ⅱ型胶原、Aggre can表达趋势基本一致。在本实验低氧培养下，甲苯胺蓝染色显示成软骨诱导组的细胞基质分泌明显多于对照组，Ⅱ型胶原表达也较对照组着色明显。
目前研究认为，HIF在常氧微环境下通过细胞质内泛素化途径降解；在低氧微环境下降解减少并由细胞质转运入细胞核内，与HIF-1β亚基结合后启动下游基因的转录与表达，调控细胞在缺血、缺氧等条件下的生理活动[9, 15]。通过三维培养模拟了细胞外低氧微环境，可为干细胞分化提供必要条件；而且，HIF参与了MSCs的成骨、成软骨、成脂分化调控[16-17]，有利于细胞的干性维持[18]。本实验结果显示，HIF-1α在诱导分化早期（1周），基因及蛋白表达水平稍有降低，我们认为这可能是由于早期短时间的低氧微环境有利于细胞的干性维持，而在持续的低氧环境下可促进HIF-1α表达。而且，实验结果显示，HIF-1α表达在2周时明显升高后再降低，而HIF-2α的表达在分化过程中受抑制，提示在hBM SCs成软骨分化过程中，HIF-1α促进软骨分化，而HIF-2α可能会发挥负调控作用。
关于HIF对MSCs向软骨分化的作用，目前研究报道结果并不一致。原因在于HIF在不同脏器内表达不同的异构体，其功能也有不同。HIF-1α主要在骨髓及肝脏内表达，而HIF-2α主要在肺、心及肾脏内表达[19]；HIF-1α主要参与调控细胞的干性维持、糖代谢及能量代谢途径的基因表达，而HIF-2α多被认为参与的是血管形成[15]。Malladi等[20]在体外用三维培养模型添加诱导因子诱导MSCs向软骨分化，结果发现置于2%O2比置于21%O2细胞培养微环境下向软骨分化率低。有文献报道[10]，HIF-2α在人关节软骨退变过程中是一个重要的病理始动因子，其功能在于诱导血管的侵入，因此可导致钙盐的沉积与软骨内成骨分化，最终发展为骨性关节炎[15]。因HIF-1α与2α在结构上差别较小，在总体表达水平维持不变的情况下，HIF-1α与2α存在mRNA水平的剪切竞争调控。所以，我们认为在干细胞成软骨分化过程中，抑制HIF-2α将有利于HIF-1α基因水平的表达；而HIF本身存在不同的异构体也提示机体针对于细胞生存与分化的微环境已发展出更加精细的调控方式，这有利于适应机体不同器官功能侧重的需要。
综上述，HIF-1α在诱导干细胞成软骨分化过程中表达上调，而HIF-2α表达持续抑制，提示HIF-1α可促进干细胞成软骨分化，而HIF-2α可能会抑制该分化。但HIF在干细胞分化，过程中的具体作用仍未完全阐明，本文为揭示HIF-2α在成软骨分化过程中的作用进行了初步探索，其具体生物功能还有待进一步研究。
细胞外微环境包括氧浓度、酸碱度、渗透压及应力等，它们均可对细胞自身功能状态发挥调控作用[1]。其中，低氧因素在干细胞分化与代谢方面发挥着至关重要的作用，低氧状态可激活干细胞不同的分子机制，从而使细胞适应缺氧微环境[2]。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下（21%O2）也有表达，但合成的HIF蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下才可稳定表达[3]。已有相关研究证明，HIF可促进干细胞的成骨、成软骨分化[2, 4-6]。HIF具有不同亚型，目前研究较多的HIF-1α被认为是主要参与调节并维持低氧状态下细胞新陈代谢、促进干细胞分化的功能因子，HIF的其他亚型如2α、3α如何参与干细胞的代谢及分化调控作用仍不十分清楚[3, 7-9]。而且，HIF-1α主要在肝脏、胰腺、胃等脏器中表达，HIF-2α主要在肾、肺及血管内皮细胞中表达[3, 7]。对不同脏器的选择性表达也提示了HIF的不同亚型可能在功能调控上具有不同的侧重点。本研究中，我们利用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）诱导成软骨分化，探讨HIF-1α、2α在该过程中的表达，为进一步阐明其功能奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
H/L-DMEM （Thermo Fisher Scientific公司，美国）；Trizol、FBS（Invitrogen公司，美国）；Total RNA逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂（大连TaKaRa公司）；TGF-β3（Peprotech公司，美国）；细胞总蛋白裂解液及BCA试剂盒、ECL发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美国）；HIF-1α与HIF-2α抗体（Abcam公司，英国）；地塞米松（dexamethasone，Dex）、二磷酸抗坏血酸（ascorbic acid，AsAp）（Sigma公司，美国）；胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS；BD公司，英国）；（1.007±0.001）g/mL淋巴细胞分离液（GE Healthcare公司，瑞士）；胰蛋白酶粉（GIBCO公司，美国）；氯仿、异丙醇（广州化学试剂厂）。细胞培养瓶（Corn ing公司，美国）； BD53低氧培养箱（Binder公司，德国）；TS100倒置光学/荧光多功能显微镜（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度计（Thermo公司，美国）。
1.2 hBMSCs的分离、培养及传代
经中山大学附属第一医院伦理委员会批准并经患者同意后，选取2013年8月－2014年2月于中山大学附属第一医院进行脊柱手术的6例患者为研究对象，其中男3例，女3例；年龄41～59岁。术中用50 mL注射器抽取腰椎骨髓血15～25 mL，取15 mL离心管，按体积比4∶3先后加入淋巴细胞分离液及骨髓液，室温以离心半径16 cm、1 200 r/ min离心45 min。小心吸弃上层水相至中间絮状细胞层，将中间细胞层移至另一15 mL离心管，加入适量L-DMEM，混匀，同上法离心5 min；弃上清，再加入2～3 mL含10%FBS的L-DMEM，吹打悬浮细胞。将该细胞悬浮液转移至25 cm2细胞培养瓶中，加入5 mL含10%FBS的L-DMEM，混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养；2 d后首次换液，之后每3天全量换液；约14 d原代hBMSCs增长至80%～90%融合时，室温下以2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集细胞，以1∶3比例传代接种于75 cm2细胞培养瓶，每3天更换培养液，继续消化传代培养。
1.3 实验分组及方法
根据文献[8, 10]方法采用离心成球法诱导hBMSCs成软骨分化。将第5～7代hBMSCs以5×105个/mL细胞密度转移至15 mL离心管中，以离心半径16 cm、1 300 r/min离心5 min，于离心管底部形成一细胞微团。弃上清后，将细胞分为对照组与成软骨诱导组，对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基，成软骨诱导组加入软骨诱导液（含2%FBS、10 ng/ mL TGF-β3、100 nmol/L Dex、50 μg/mL AsAp、40 μg/ mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1∶100稀释的ITS+Premix的H-DMEM培养基）。将两组细胞置于低氧（2%O2）培养箱中，每3天换液1次，分别于各时间点收集细胞微球进行以下观测。
1.4 观测指标
1.4.1 组织学及免疫组织化学染色观察
培养3周后收集两组细胞微球，经PBS清洗、固定、包埋、脱蜡后，行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。
1.4.2 Western
blot检测培养1周后收集两组细胞微球，加入约100 μL总蛋白裂解液，用枪头反复吹打形成均质的悬浊液，BCA法测定蛋白浓度；蛋白煮沸变性后取20 μg等量样本行SDS-PAGE分离，然后将蛋白转至PVDF膜上，1%牛血清白蛋白封闭后，分别加入抗HIF-1α与HIF-2α抗体，内参抗体为β-actin，4℃过夜，TBST洗膜10 min；加入二抗洗膜后用ECL发光试剂显影，X线片曝光后将胶片显影及定影。釆用Image J软件测量目的条带的吸光度（A）值，以β-actin条带为内参照进行蛋白上样量校正（校正值=目的条带A值/β-actin条带A值），以校正值对HIF-1α和HIF-2α蛋白表达水平进行半定量分析。
1.4.3 实时定量PCR检测
采用实时定量PCR法检测成软骨分化过程关键启动基因Sox-9，软骨标志基因Ⅱ型胶原、多聚蛋白聚糖（Aggrecan），软骨终末分化阶段标志基因Ⅹ型胶原的基因表达，以及HIF-1α、HIF-2α基因表达。培养1、2、3周分别收集两组细胞微球，按照Trizol说明书方法提取细胞总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测总RNA纯度及含量，逆转录总RNA，cDNA置于- 20℃保存。根据实时定量PCR试剂盒说明书进行反应，反应总体系10 μL；反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40个循环；内参为18 s。基因扩增引物序列见表 1。采用2-ΔΔCt公式计算各基因mRNA相对表达量。
表1
各基因引物序列及产物大小
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.5 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 组织学及免疫组织化学染色观察
甲苯胺蓝染色示，两组软骨细胞基质呈浅蓝色，细胞核呈深蓝色。对照组染色细胞核整体分布稀疏，细胞基质染色较浅；而成软骨诱导组染色细胞液分布致密，细胞基质染色明显较对照组深。见图 1。
图1
培养3周两组甲苯胺蓝染色观察（×40） ⓐ 对照组 ⓑ 成软骨诱导组 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，两组细胞可见被染成棕黄色的Ⅱ型胶原蛋白，阳性表达主要位于细胞质内，细胞质与细胞外基质连成片状；细胞核呈蓝色；在部分细胞周围可观察到陷窝样空隙。与成软骨诱导组相比，对照组细胞核分布较稀疏且着色浅（图 2），Ⅱ型胶原表达含量少。
2.2 Western blot检测
培养1周时，成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量分别为0.386±0.015、0.118±0.002，均显著低于对照组的0.525±0.024和0.163±0.010，差异有统计学意义（t=8.345，P=0.001；t=7.683，P=0.002）。见图 3。
2.3 实时定量PCR检测
与对照组比较，成软骨诱导组HIF-1α mRNA相对表达量在培养1周时降低，而在2周时显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养3周时两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。成软骨诱导组HIF-2α的表达在分化过程中均受抑制，培养各时间点HIF-2α mRNA相对表达量均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。成软骨诱导组Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），以2周时表达最高。培养过程中Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原呈逐渐增加趋势，2、3周时其mRNA相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而成软骨诱导组Aggrecan mRNA相对表达量在培养各时间点均有升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
3 讨论
人正常软骨组织中含有软骨细胞、基质及纤维成分，其中软骨基质内胶原约占软骨有机成分的40%[11]；而软骨细胞能不断产生新的软骨基质，其主要组成成分是酸性糖胺多糖。由于软骨组织的营养物质主要是通过渗透作用进入组织内部，仅在软骨的边缘及浅表位置含有少量血管来营养细胞。因此，软骨组织这种生理特点决定其一旦损伤后则难以通过自身方式得到修复。目前临床上关节软骨损伤的治疗效果均不令人满意。而随着对干细胞领域的深入研究，干细胞治疗关节软骨损伤为临床提供了一种可能的途径。
目前，运用离心沉淀法将干细胞聚集，使细胞与细胞之间形成空间上的紧密接触，从而在体外模拟三维培养，可满足诱导干细胞成软骨分化的要求[12]。有文献指出，三维立体培养是诱导干细胞成软骨分化的必要条件之一[12]。干细胞在体外分化成软骨的过程中，早期由于关键转录因子Sox-9的启动，从而使Ⅱ型胶原与Aggrecan表达增加，分泌的胶原纤维与蛋白多糖不断被修饰并改造；晚期软骨细胞体积增大，Ⅱ型胶原逐渐改造形成特定空间结构排列的Ⅹ型胶原，该过程为软骨分化的成熟阶段，表明干细胞最终向软骨分化[1]。本实验中，实时定量PCR结果表明，与透明软骨相关的Ⅱ型胶原和Aggrecan表达升高，提示干细胞分泌细胞外基质成分增加，为最终向软骨成熟作准备；终末分化Ⅹ型胶原表达增多提示软骨肥大成熟。目前认为Sox-9可启动Aggre can及Ⅱ型胶原的转录，从而最终分化为软骨组织，且低氧下能促进Sox-9的表达而有利于软骨分化[13-14]。本实验中Sox-9的表达与Ⅱ型胶原、Aggre can表达趋势基本一致。在本实验低氧培养下，甲苯胺蓝染色显示成软骨诱导组的细胞基质分泌明显多于对照组，Ⅱ型胶原表达也较对照组着色明显。
目前研究认为，HIF在常氧微环境下通过细胞质内泛素化途径降解；在低氧微环境下降解减少并由细胞质转运入细胞核内，与HIF-1β亚基结合后启动下游基因的转录与表达，调控细胞在缺血、缺氧等条件下的生理活动[9, 15]。通过三维培养模拟了细胞外低氧微环境，可为干细胞分化提供必要条件；而且，HIF参与了MSCs的成骨、成软骨、成脂分化调控[16-17]，有利于细胞的干性维持[18]。本实验结果显示，HIF-1α在诱导分化早期（1周），基因及蛋白表达水平稍有降低，我们认为这可能是由于早期短时间的低氧微环境有利于细胞的干性维持，而在持续的低氧环境下可促进HIF-1α表达。而且，实验结果显示，HIF-1α表达在2周时明显升高后再降低，而HIF-2α的表达在分化过程中受抑制，提示在hBM SCs成软骨分化过程中，HIF-1α促进软骨分化，而HIF-2α可能会发挥负调控作用。
关于HIF对MSCs向软骨分化的作用，目前研究报道结果并不一致。原因在于HIF在不同脏器内表达不同的异构体，其功能也有不同。HIF-1α主要在骨髓及肝脏内表达，而HIF-2α主要在肺、心及肾脏内表达[19]；HIF-1α主要参与调控细胞的干性维持、糖代谢及能量代谢途径的基因表达，而HIF-2α多被认为参与的是血管形成[15]。Malladi等[20]在体外用三维培养模型添加诱导因子诱导MSCs向软骨分化，结果发现置于2%O2比置于21%O2细胞培养微环境下向软骨分化率低。有文献报道[10]，HIF-2α在人关节软骨退变过程中是一个重要的病理始动因子，其功能在于诱导血管的侵入，因此可导致钙盐的沉积与软骨内成骨分化，最终发展为骨性关节炎[15]。因HIF-1α与2α在结构上差别较小，在总体表达水平维持不变的情况下，HIF-1α与2α存在mRNA水平的剪切竞争调控。所以，我们认为在干细胞成软骨分化过程中，抑制HIF-2α将有利于HIF-1α基因水平的表达；而HIF本身存在不同的异构体也提示机体针对于细胞生存与分化的微环境已发展出更加精细的调控方式，这有利于适应机体不同器官功能侧重的需要。
综上述，HIF-1α在诱导干细胞成软骨分化过程中表达上调，而HIF-2α表达持续抑制，提示HIF-1α可促进干细胞成软骨分化，而HIF-2α可能会抑制该分化。但HIF在干细胞分化，过程中的具体作用仍未完全阐明，本文为揭示HIF-2α在成软骨分化过程中的作用进行了初步探索，其具体生物功能还有待进一步研究。
