引用本文： 薛有地, 宋跃明, 刘立岷, 任春朋, 周忠杰, 周春光. 聚氨基酸/纳米羟基磷灰石/硫酸钙融合器在山羊腰椎椎间融合中的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(8): 972-977. doi: 10.7507/1002-1892.20150210 复制
自1988年Bagby及Kuslich 首次将Bagby篮作为融合器（Cage）进行椎间融合以来，腰椎椎间融合术已逐渐应用于治疗各种腰椎疾病，并取得了满意疗效[1-2]。然而随着手术病例的增多及随访时间延长，出现了一系列Cage相关并发症，包括Cage下沉移位、椎间植骨不愈合、终板塌陷等[3-4]。研究表明，制备Cage的材料对提高手术效果及降低术后并发症具有重要作用[4]。聚氨基酸/纳米羟基磷灰石/硫酸钙（poly-amino acid/nano-hydroxyapatite/calcium sulfate，PHC）是一种新型生物复合材料，具有良好的力学性能及生物活性[5-6]。本研究通过将PHC制备的Cage植入山羊腰椎，评价其在腰椎椎间融合方面的应用价值。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
2岁龄雌性山羊18只，体重29～33 kg，由四川大学动物实验中心提供，所有手术均在四川大学动物实验中心手术室进行；术前禁食24 h，禁水8 h。
PHC Cage、钛合金Cage、钛合金固定板（四川国纳科技有限公司）；螺钉（上海创生医疗器械有限公司）。生物力学试验仪（深圳瑞格尔仪器设备有限公司）；荧光显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（中国科学院成都分院科学仪器厂）；硬组织切片机、硬组织修块机（Leica公司，德国）；测量软件Canvas 11（ACDSystem公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将18只山羊随机分为3组，分别为PHC Cage组（A组）、钛合金Cage组（B组）及自体髂骨组（C组），每组6只。参考van Dijk等[7]及Kanayama 等[8]的手术方法，建立山羊腰椎椎间融合模型。山羊取右侧卧位，肌肉注射盐酸噻拉嗪（0.04 mL/kg）麻醉后，取腹膜外入路显露L3、4椎间隙，彻底清除椎间盘及软骨终板后取同侧髂骨松质骨。A、B组将其修剪成骨粒，填充于对应Cage腔内；C组修整成与Cage规格一致的三面皮质骨块。将Cage或髂骨块植入椎间隙，于L3、4椎体侧方使用钢板螺钉固定，逐层缝合切口，无菌敷料包扎。手术结束后静脉注射盐酸苯恶唑（0.04 mL/kg）催醒。术后8 h进水、24 h进食，3 d内每天肌肉注射青霉素240万U。术后24周采用安泰注射液深度麻醉后，心脏穿刺放血处死动物，完整切取L3、4节段进行观察。动物处死前3 d按每次0.25 g/kg、每天2次的剂量将四环素粉末混合于饲料中喂食动物。
1.3 评价指标
1.3.1 一般情况
术后观察各组山羊一般情况、四肢活动及步态，切口愈合情况、有无渗液及窦道形成 等。
1.3.2 影像学检查
术前及术后4、12、24周各组行X线片检查，明确手术节段、Cage或骨块及内固定物位置，采用测量软件Canvas 11测量椎间高度（disc space height，DSH），以椎间隙前缘和椎间隙后缘高度均值作为DSH。术后24周行CT三维重建检查，采用改良Brantigan融合评分[9]评定椎间融合程度，≥3分者视为骨性融合。
1.3.3 生物力学测试
术后24周各组取L3、4节段标本，使用生物力学试验仪施加非破坏性前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转6个模式载荷，力矩2 N·m，反复加载、卸载循环3次，第3次记录相应数据，以消除软组织黏弹性和蠕变对结果的影响，记录6种载荷下的运动范围（range of motion，ROM）。
1.3.4 组织学观察
生物力学测试后，用硬组织修块机修整标本，制作L3椎体-Cage侧壁-L4椎体的矢状面切片，片厚2 mm，每组标本留取2块切片进行扫描电镜观察。其余切片用硬组织切片机切割标本，获得5 μm厚组织切片，使用荧光显微镜观察四环素荧光标记情况，其中沉积在骨表面的四环素荧光呈黄色。然后取切片行HE染色及甲苯胺蓝染 色，光镜下观察Cage周围有无炎性反应，Cage与 椎体骨界面结合情况，以及Cage内植骨融合情 况。
1.3.5 扫描电镜观察
各组取2块切片修剪至直径与高度均不超过10 mm的块状，2.5%戊二醛固定，50%～100%梯度乙醇逐级脱水，离子溅射法喷金，扫描电镜下观察Cage与宿主骨的界面整合情况以及PHC Cage表面降解情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey HSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
各组山羊均存活至实验完成，切口愈合良好，无神经损伤、渗液及窦道形成等并发症发生。
2.2 影像学检查
2.2.1 X线片
各组术后4周DSH均较术前增高，之后呈下降趋势。其中，A、B组手术前后各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；C组术后12、24周DSH显著低于术前及术后4周，差异有统计学意义（P＜0.05），术后12、24周以及术前、术后4 周间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
术前及术后4周，3组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。术后12、24周，A、B组DSH均显著高于C组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；A、B组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1及图 1。
表1
手术前后各时间点各组DSH比较(n=6，mm，
图1
术后各时间点各组X线片检查（从左至右依次为C、B、A组） ⓐ 4周 ⓑ 12周 ⓒ 24周 2.2.2 CT三维重建检查
术后24周，CT三维重建示A组椎间骨痂连续，Cage周围透亮线不明显，改良Brantigan融合评分为（3.67±0.52）分，均达骨性融合；C组椎间可见连续骨痂通过，评分为（3.50±0.55）分，均达骨性融合；B组部分标本椎间未见明显骨痂且Cage周围透亮线明显，评分为（2.00±1.10）分，其中3只评分达3分以上，达骨性融合。A、C组评分均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A、C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。
2.3 生物力学测试
术后24周各组前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转ROM均在4°以内。A、B组各方向ROM比较，差异均无统计学意义(P＞0.05）；但均小于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
术后24周各组生物力学测试结果比较（n=6，°，2.4 组织学观察
2.4.1 四环素荧光标记观察
荧光显微镜下，A组植骨区域及Cage宿主骨界面可见斑片状金黄色荧光带；B组仅在Cage植骨区域见斑片状金黄色荧光带；C组在上、下椎体边缘及植骨区域间出现金黄色荧光带。见图 3。
2.4.2 HE及甲苯胺蓝染色观察
光镜下，A组Cage内部大量新生骨形成，Cage与宿主骨界面结合紧密，Cage表面微降解，可见骨小梁及软骨细胞形成。B组Cage内部可见少量新生骨形成，大部分区域被纤维组织填充，Cage与宿主骨间隔大量纤维组织。C组植骨区域可见大量新生骨组织，植骨界面可见纤维组织及软骨细胞。见图 4、5。
图4
术后24周各组HE染色观察（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 2.5 扫描电镜观察
扫描电镜下，A组Cage与宿主骨连接紧密，界面未见明显缝隙，部分区域呈骨性结合，Cage表面可见微降解。B组Cage与宿主骨界面连接欠紧密，部分区域可见明显缝隙，部分区域由纤维组织填充。C组见髂骨植入区域与宿主骨连接紧密，界面未见明显缝隙。见图 6。
3 讨论
脊柱动物模型主要用于研究脊柱的生物力学特点和脊柱内固定器械及植入物的应用。研究表明，四足动物的脊柱生物力学及形态学与人一致，其脊柱承受负荷方向与脊柱长轴一致，且骨小梁方向也是平行的[8, 10-12]。为此，本研究选择山羊作为研究对象。但四足动物椎体承受轴向负荷较大，椎体骨小梁密度高于人类，这一点在力学测试时需注意[10]。
术后DSH变化与术中椎间隙撑开、终板准备，Cage或髂骨块力学性能及Cage降解性能等有关[7]。本研究结果显示，术后4周3组间比较差异均无统计学意义；12、24周时A、B组DSH均显著高于C组，但A、B组间差异无统计学意义。其原因可能为PHC Cage支撑强度大、弹性模量低，体内仅产生微降解，且与宿主骨结合紧密，因而能够有效维持椎间高度；钛合金Cage力学性能优异，虽然应力遮挡明显但仍能维持椎间高度；而山羊三面皮质髂骨皮质较薄，支撑强度差、吸收快，故维持椎间高度的能力较差[13]。加之山羊脊柱轴向应力高[10]，因而髂骨吸收速度可能会远高于新生骨形成速度，进而出现DSH降低。
生物力学测试ROM可评价融合节段稳定性，从而间接衡量椎间融合效果（＜4°视为融合） [14-15]。本研究结果表明，术后24周各组前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转ROM均在4°以内，A、B组各方向ROM差异无统计学意义，且均优于C组。A组使用PHC Cage椎间融合良好，且Cage支撑强度高，与宿主骨结合紧密，故稳定性良好。虽然B组钛合金Cage椎间融合较A组欠佳，但其力学强度大、支撑作用好，加上周围组织包裹及纤维连接，也保证了融合节段稳定性。而C组自体髂骨虽椎间融合良好，但因山羊髂骨本身强度较差，且新生骨未完成改建、塑形，因此虽已达到融合标准，但稳定性较A、B组差。
CT检测植骨融合的敏感性及特异性均优于X线片检查，而且可对骨痂形成体积进行量化[16]。本研究采用CT改良Brantigan融合评分[9]观察椎间骨痂形成、Cage周围有无透亮线判断椎间融合情况。结果提示A、C组评分均达3分以上，获骨性融合，而B组仅3例获骨性融合。组织学观察可直接、客观评价椎间融合 [17]。组织学观察示A组植骨区域可见大量新生骨形成，部分区域连续骨小梁通过，Cage表面微降解伴新生骨形成；C组植骨区域见大量新生骨；B组新生骨范围较小，界面大量纤维组织形成。其原因可能是PHC Cage 弹性模量低，应力遮挡小，适当应力能够刺激Cage内新生骨的形成，同时材料中Ca2+释放及表面磷灰石结晶的沉积利于新生骨的形成并与纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，n-HA）直接键性结合[9, 18-19]。钛合金Cage弹性模量大，应力遮挡明显，Cage内部新生骨缺少应力刺激，骨生成缓慢[8, 20]。三面皮质髂骨具有骨诱导、骨传导和骨生成的作用，故植骨融合较 快。
四环素在荧光显微镜下自发金黄色荧光，与成骨细胞有特殊亲和力，能够反映新生骨合成情况[21]。A组植骨区域出现大量斑片状金黄色荧光带，范围与C组类似，明显大于B组，说明PHC Cage 椎间植骨融合能力优于钛合金Cage，与髂骨类似；另外PHC Cage与骨界面荧光带的出现提示界面结合处亦有新生骨形成。
扫描电镜结果显示PHC Cage与椎体结合较钛合金Cage紧密，且Cage表面可见微降解伴界面新生骨形成。PHC Cage中硫酸钙降解后Ca2+释放，表面新生骨与n-HA直接键性结合，故Cage与宿主骨能够形成紧密的骨性结合[13]。而钛合金Cage植入体内后，Cage骨-界面靠纤维组织连接，故界面结合欠紧密。
综上述，动物实验表明PHC复合材料制备的腰椎Cage植入体内后可促进腰椎椎间融合，植入体内24周表面微降解并与宿主骨紧密结合，但长期降解情况仍需进一步观察。
自1988年Bagby及Kuslich 首次将Bagby篮作为融合器（Cage）进行椎间融合以来，腰椎椎间融合术已逐渐应用于治疗各种腰椎疾病，并取得了满意疗效[1-2]。然而随着手术病例的增多及随访时间延长，出现了一系列Cage相关并发症，包括Cage下沉移位、椎间植骨不愈合、终板塌陷等[3-4]。研究表明，制备Cage的材料对提高手术效果及降低术后并发症具有重要作用[4]。聚氨基酸/纳米羟基磷灰石/硫酸钙（poly-amino acid/nano-hydroxyapatite/calcium sulfate，PHC）是一种新型生物复合材料，具有良好的力学性能及生物活性[5-6]。本研究通过将PHC制备的Cage植入山羊腰椎，评价其在腰椎椎间融合方面的应用价值。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
2岁龄雌性山羊18只，体重29～33 kg，由四川大学动物实验中心提供，所有手术均在四川大学动物实验中心手术室进行；术前禁食24 h，禁水8 h。
PHC Cage、钛合金Cage、钛合金固定板（四川国纳科技有限公司）；螺钉（上海创生医疗器械有限公司）。生物力学试验仪（深圳瑞格尔仪器设备有限公司）；荧光显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（中国科学院成都分院科学仪器厂）；硬组织切片机、硬组织修块机（Leica公司，德国）；测量软件Canvas 11（ACDSystem公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将18只山羊随机分为3组，分别为PHC Cage组（A组）、钛合金Cage组（B组）及自体髂骨组（C组），每组6只。参考van Dijk等[7]及Kanayama 等[8]的手术方法，建立山羊腰椎椎间融合模型。山羊取右侧卧位，肌肉注射盐酸噻拉嗪（0.04 mL/kg）麻醉后，取腹膜外入路显露L3、4椎间隙，彻底清除椎间盘及软骨终板后取同侧髂骨松质骨。A、B组将其修剪成骨粒，填充于对应Cage腔内；C组修整成与Cage规格一致的三面皮质骨块。将Cage或髂骨块植入椎间隙，于L3、4椎体侧方使用钢板螺钉固定，逐层缝合切口，无菌敷料包扎。手术结束后静脉注射盐酸苯恶唑（0.04 mL/kg）催醒。术后8 h进水、24 h进食，3 d内每天肌肉注射青霉素240万U。术后24周采用安泰注射液深度麻醉后，心脏穿刺放血处死动物，完整切取L3、4节段进行观察。动物处死前3 d按每次0.25 g/kg、每天2次的剂量将四环素粉末混合于饲料中喂食动物。
1.3 评价指标
1.3.1 一般情况
术后观察各组山羊一般情况、四肢活动及步态，切口愈合情况、有无渗液及窦道形成 等。
1.3.2 影像学检查
术前及术后4、12、24周各组行X线片检查，明确手术节段、Cage或骨块及内固定物位置，采用测量软件Canvas 11测量椎间高度（disc space height，DSH），以椎间隙前缘和椎间隙后缘高度均值作为DSH。术后24周行CT三维重建检查，采用改良Brantigan融合评分[9]评定椎间融合程度，≥3分者视为骨性融合。
1.3.3 生物力学测试
术后24周各组取L3、4节段标本，使用生物力学试验仪施加非破坏性前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转6个模式载荷，力矩2 N·m，反复加载、卸载循环3次，第3次记录相应数据，以消除软组织黏弹性和蠕变对结果的影响，记录6种载荷下的运动范围（range of motion，ROM）。
1.3.4 组织学观察
生物力学测试后，用硬组织修块机修整标本，制作L3椎体-Cage侧壁-L4椎体的矢状面切片，片厚2 mm，每组标本留取2块切片进行扫描电镜观察。其余切片用硬组织切片机切割标本，获得5 μm厚组织切片，使用荧光显微镜观察四环素荧光标记情况，其中沉积在骨表面的四环素荧光呈黄色。然后取切片行HE染色及甲苯胺蓝染 色，光镜下观察Cage周围有无炎性反应，Cage与 椎体骨界面结合情况，以及Cage内植骨融合情 况。
1.3.5 扫描电镜观察
各组取2块切片修剪至直径与高度均不超过10 mm的块状，2.5%戊二醛固定，50%～100%梯度乙醇逐级脱水，离子溅射法喷金，扫描电镜下观察Cage与宿主骨的界面整合情况以及PHC Cage表面降解情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey HSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
各组山羊均存活至实验完成，切口愈合良好，无神经损伤、渗液及窦道形成等并发症发生。
2.2 影像学检查
2.2.1 X线片
各组术后4周DSH均较术前增高，之后呈下降趋势。其中，A、B组手术前后各时间点间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；C组术后12、24周DSH显著低于术前及术后4周，差异有统计学意义（P＜0.05），术后12、24周以及术前、术后4 周间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
术前及术后4周，3组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。术后12、24周，A、B组DSH均显著高于C组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；A、B组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1及图 1。
表1
手术前后各时间点各组DSH比较(n=6，mm，
图1
术后各时间点各组X线片检查（从左至右依次为C、B、A组） ⓐ 4周 ⓑ 12周 ⓒ 24周 2.2.2 CT三维重建检查
术后24周，CT三维重建示A组椎间骨痂连续，Cage周围透亮线不明显，改良Brantigan融合评分为（3.67±0.52）分，均达骨性融合；C组椎间可见连续骨痂通过，评分为（3.50±0.55）分，均达骨性融合；B组部分标本椎间未见明显骨痂且Cage周围透亮线明显，评分为（2.00±1.10）分，其中3只评分达3分以上，达骨性融合。A、C组评分均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A、C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。
2.3 生物力学测试
术后24周各组前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转ROM均在4°以内。A、B组各方向ROM比较，差异均无统计学意义(P＞0.05）；但均小于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
术后24周各组生物力学测试结果比较（n=6，°，2.4 组织学观察
2.4.1 四环素荧光标记观察
荧光显微镜下，A组植骨区域及Cage宿主骨界面可见斑片状金黄色荧光带；B组仅在Cage植骨区域见斑片状金黄色荧光带；C组在上、下椎体边缘及植骨区域间出现金黄色荧光带。见图 3。
2.4.2 HE及甲苯胺蓝染色观察
光镜下，A组Cage内部大量新生骨形成，Cage与宿主骨界面结合紧密，Cage表面微降解，可见骨小梁及软骨细胞形成。B组Cage内部可见少量新生骨形成，大部分区域被纤维组织填充，Cage与宿主骨间隔大量纤维组织。C组植骨区域可见大量新生骨组织，植骨界面可见纤维组织及软骨细胞。见图 4、5。
图4
术后24周各组HE染色观察（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 2.5 扫描电镜观察
扫描电镜下，A组Cage与宿主骨连接紧密，界面未见明显缝隙，部分区域呈骨性结合，Cage表面可见微降解。B组Cage与宿主骨界面连接欠紧密，部分区域可见明显缝隙，部分区域由纤维组织填充。C组见髂骨植入区域与宿主骨连接紧密，界面未见明显缝隙。见图 6。
3 讨论
脊柱动物模型主要用于研究脊柱的生物力学特点和脊柱内固定器械及植入物的应用。研究表明，四足动物的脊柱生物力学及形态学与人一致，其脊柱承受负荷方向与脊柱长轴一致，且骨小梁方向也是平行的[8, 10-12]。为此，本研究选择山羊作为研究对象。但四足动物椎体承受轴向负荷较大，椎体骨小梁密度高于人类，这一点在力学测试时需注意[10]。
术后DSH变化与术中椎间隙撑开、终板准备，Cage或髂骨块力学性能及Cage降解性能等有关[7]。本研究结果显示，术后4周3组间比较差异均无统计学意义；12、24周时A、B组DSH均显著高于C组，但A、B组间差异无统计学意义。其原因可能为PHC Cage支撑强度大、弹性模量低，体内仅产生微降解，且与宿主骨结合紧密，因而能够有效维持椎间高度；钛合金Cage力学性能优异，虽然应力遮挡明显但仍能维持椎间高度；而山羊三面皮质髂骨皮质较薄，支撑强度差、吸收快，故维持椎间高度的能力较差[13]。加之山羊脊柱轴向应力高[10]，因而髂骨吸收速度可能会远高于新生骨形成速度，进而出现DSH降低。
生物力学测试ROM可评价融合节段稳定性，从而间接衡量椎间融合效果（＜4°视为融合） [14-15]。本研究结果表明，术后24周各组前屈、后伸、左右侧屈、左右旋转ROM均在4°以内，A、B组各方向ROM差异无统计学意义，且均优于C组。A组使用PHC Cage椎间融合良好，且Cage支撑强度高，与宿主骨结合紧密，故稳定性良好。虽然B组钛合金Cage椎间融合较A组欠佳，但其力学强度大、支撑作用好，加上周围组织包裹及纤维连接，也保证了融合节段稳定性。而C组自体髂骨虽椎间融合良好，但因山羊髂骨本身强度较差，且新生骨未完成改建、塑形，因此虽已达到融合标准，但稳定性较A、B组差。
CT检测植骨融合的敏感性及特异性均优于X线片检查，而且可对骨痂形成体积进行量化[16]。本研究采用CT改良Brantigan融合评分[9]观察椎间骨痂形成、Cage周围有无透亮线判断椎间融合情况。结果提示A、C组评分均达3分以上，获骨性融合，而B组仅3例获骨性融合。组织学观察可直接、客观评价椎间融合 [17]。组织学观察示A组植骨区域可见大量新生骨形成，部分区域连续骨小梁通过，Cage表面微降解伴新生骨形成；C组植骨区域见大量新生骨；B组新生骨范围较小，界面大量纤维组织形成。其原因可能是PHC Cage 弹性模量低，应力遮挡小，适当应力能够刺激Cage内新生骨的形成，同时材料中Ca2+释放及表面磷灰石结晶的沉积利于新生骨的形成并与纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，n-HA）直接键性结合[9, 18-19]。钛合金Cage弹性模量大，应力遮挡明显，Cage内部新生骨缺少应力刺激，骨生成缓慢[8, 20]。三面皮质髂骨具有骨诱导、骨传导和骨生成的作用，故植骨融合较 快。
四环素在荧光显微镜下自发金黄色荧光，与成骨细胞有特殊亲和力，能够反映新生骨合成情况[21]。A组植骨区域出现大量斑片状金黄色荧光带，范围与C组类似，明显大于B组，说明PHC Cage 椎间植骨融合能力优于钛合金Cage，与髂骨类似；另外PHC Cage与骨界面荧光带的出现提示界面结合处亦有新生骨形成。
扫描电镜结果显示PHC Cage与椎体结合较钛合金Cage紧密，且Cage表面可见微降解伴界面新生骨形成。PHC Cage中硫酸钙降解后Ca2+释放，表面新生骨与n-HA直接键性结合，故Cage与宿主骨能够形成紧密的骨性结合[13]。而钛合金Cage植入体内后，Cage骨-界面靠纤维组织连接，故界面结合欠紧密。
综上述，动物实验表明PHC复合材料制备的腰椎Cage植入体内后可促进腰椎椎间融合，植入体内24周表面微降解并与宿主骨紧密结合，但长期降解情况仍需进一步观察。
