引用本文： 苏春燕, 苏鸿君, 王鹏, 冯佩, 吴燕峰. 人BMSCs分化过程中免疫能力的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(8): 1003-1008. doi: 10.7507/1002-1892.20150215 复制
MSCs是一种多能干细胞，存在于机体多种组织中，成人体内以BMSCs数量较为丰富[1-2]。近年研究发现，BMSCs除了支持造血干细胞外，还具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化的功能和低免疫原性、高免疫抑制能力等特点[3-5]，可广泛应用于同种异体干细胞治疗、组织工程修复与再生医学领域[6-8]。然而，同种异体BMSCs作为干细胞移植治疗与组织工程再生医学的种子细胞，其在种植、分化过程中是否仍保持原有的低免疫原性和高免疫抑制能力的特点，目前尚缺乏这方面的研究。因此，本研究拟通过体外分离、培养BMSCs，并观察其在成骨、成软骨及成脂分化过程中人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ、Ⅱ类分子表达和对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）增殖的抑制能力变化，阐明BMSCs分化过程中免疫原性和免疫抑制能力变化规律，为同种异体BMSCs的临床应用提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
H-DMEM培养基、RPMI1640培养基、青-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS缓冲液、4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司）；石蜡、二甲苯（广州化学试剂厂）；Percoll分离液（Pharmacia Biotech公司，瑞典）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、丙酮酸钠、脯氨酸、羧基荧光素二醋酸盐琥珀亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE）、茜素红、甲苯胺蓝、油红O（Sigma公司，美国）；抗CD3微球、抗CD28微球（BD公司，美国）；胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂（insulin-transferrin-selenium，ITS；Corning公司，美国）；重组人TGF-β3（Peprotech公司，美国）；抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗体（Meltenyi公司，德国）；离心管（15、50 mL）、6孔板、24孔板、25 cm2培养瓶（Corning公司，美国）；移液器（Eppendorf公司，德国）。
生物安全柜、CO2恒温培养箱、低温高速离心机（Thermo Fisher公司，美国）； FACSCalibur流式细胞仪（BD公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；石蜡切片机（Leica公司，德国）。
1.2 BMSCs体外分离、培养及鉴定
1.2.1 BMSCs体外分离、培养
9份骨髓样本分别来自9名25～30岁健康志愿者，经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准并经志愿者知情同意。骨髓样本加入PBS缓冲液按1∶1比例混匀，用注射器缓慢加入等量1.073 g/mL Percoll分离液，以900×g离心30 min。吸取中间白膜层并用PBS缓冲液洗涤3次，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基重悬后，以2×106个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。72 h后洗去未贴壁细胞，此后每3天换液1次。于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，当细胞达80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代，取第2～3代细胞用于后续实验。
1.2.2 BMSCs三向分化鉴定
① 成骨分化：将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后换为成骨诱导培养基（含10%FBS、50 mg/ L抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后行茜素红染色，倒置相差显微镜下观察钙结节形成情况。② 成软骨分化：调整BMSCs密度为1×106 个 /μL，吸取20 μL接种于24孔板，2 h后加入成软骨诱导培养基（含10%FBS、50 mg/L抗坏血酸、1%ITS-Premix、1 mmol/ L丙酮酸钠、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后收获软骨球，多聚甲醛固定、石蜡包埋切片后行甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜下观察软骨形成情况。③ 成脂分化：将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后换为成脂诱导培养基（含10%FBS、10 μg/mL胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后行油红O染色，倒置相差显微镜下观察脂肪滴形成情况。
1.2.3 流式细胞仪鉴定
取第2～3代未分化BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以450×g离心5 min后PBS缓冲液重悬计数，调整浓度为1×107个/mL。吸取90 μL细胞悬液分至各流式检测管中，分别加入抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗体10 μL，阴性对照管加入10 μL PBS缓冲液，充分混匀后室温避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次后重悬，于FACSCalibur流式细胞仪上机检测。
1.3 BMSCs分化过程中HLA分子表达检测
将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，分别加入成骨、成软骨、成脂诱导培养基诱导分化7、14、21 d，同时将未诱导分化的BMSCs（0 d）作为对照。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g离心5 min，用PBS缓冲液重悬并调整浓度为1×107 个 / mL。每个样本吸取90 μL细胞悬液，分别加入抗人HLA-Ⅰ-PE和HLA-Ⅱ-FITC抗体10 μL，于4℃避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次后重悬，通过FACSCalibur流式细胞仪检测未分化及成骨、成软骨、成脂分化过程中BMSCs的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类分子表达水平。
1.4 BMSCs分化过程中免疫抑制能力检测
1.4.1 PBMC制备
20份外周血样本分别来自20名25～35岁健康志愿者，经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准并经志愿者知情同意。外周血样本用PBS缓冲液1∶1稀释，用注射器缓慢加入等量1.073 g/mL Percoll分离液，以900×g离心30 min。吸取中间白膜层并用PBS缓冲液洗涤3次，用PBS缓冲液调整密度为1×107个/mL。吸取1 mL细胞悬液并加入1 μL CFSE，于37℃避光孵育30 min，加入4℃预冷的FBS终止反应，并用PBS缓冲液洗涤3次，用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬，计数备用。
1.4.2 分化BMSCs免疫抑制能力检测
将BMSCs按1.3方法分别成骨、成软骨、成脂诱导分化7、14、21 d后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g离心5 min，以3.3×104个/mL密度接种于6 孔板，将未诱导分化的BMSCs（0 d）作为对照，于培养箱中静置12 h贴壁。吸去培养基，按3.3×105个 / mL密度将PBMC接种于上述6孔板，按10∶1比例将PBMC与BMSCs共培养5 d，同时加入抗CD3（0.2 μg/ mL）、CD28（1 μg/mL）微球刺激PBMC增殖，分别以未加入抗CD3、CD28微球为阴性对照，以加入抗CD3、CD28微球但未加入BMSCs作为阳性对照。刺激增殖5 d后收集共培养体系中的PBMC，用PBS缓冲液洗涤、重悬后通过FACSCalibur流式细胞仪检测其CFSE荧光强弱水平作为PBMC的增殖能力指标，以检测未分化及成骨、成软骨、成脂分化过程中BMSCs的免疫抑制能力。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs的形态、分化与表型鉴定
原代及传代后BMSCs均呈梭形、成纤维细胞样生长（图 1）。成骨诱导14 d后茜素红染色呈阳性，镜下可见多个大小不等的红色钙结节；成软骨诱导14 d后甲苯胺蓝染色呈阳性，镜下可见软骨球切片呈蓝紫色；成脂诱导14 d后油红O染色呈阳性，镜下可见细胞内多个红色脂肪滴形成（图 2）。流式细胞仪检测示，BMSCs表型CD14、CD45、HLA-DR表达为阴性，CD29、CD44、CD105表达为阳性，符合MSCs表型特征（图 3）。
图1
第3代BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×40） 2.2 BMSCs分化过程中HLA分子表达检测
未分化BMSCs表达HLA-Ⅰ类分子，基本不表达HLA-Ⅱ类分子。成骨、成软骨分化过程中HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达无明显改变，各时间点间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），且HLA-Ⅱ类分子表达水平均较低。成脂分化14、21 d HLA-Ⅰ类分子表达升高，与0、7 d比较差异有统计学意义（P＜0.05）；14、21 d间差异无统计学意义（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d HLA-Ⅱ类分子表达也逐渐出现并升高，均显著高于0 d，差异有统计学意义（P＜0.05）；7、14、21 d间差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
图5
流式细胞仪检测BMSCs分化过程中对PBMC增殖的抑制能力 ⓐ 单纯PBMC ⓑ 加入抗CD3、CD28微球刺激后 ⓒ 未分化BMSCs ⓓ BMSCs成骨分化7 d ⓔ BMSCs成骨分化14 d ⓕ BMSCs成骨分化21 d ⓖ BMSCs成软骨分化7 d ⓗ BMSCs成软骨分化14 d ⓘ BMSCs成软骨分化21 d ⓙ BMSCs成脂分化7 d ⓚ BMSCs成脂分化14 d ⓛ BMSCs成脂分化21 d 2.3 BMSCs分化过程中免疫抑制能力检测
PBMC在无抗CD3、CD28微球刺激下无明显增殖，加入抗CD3、CD28微球后显著增殖，未分化BMSCs能显著抑制PBMC的增殖。成骨、成软骨分化过程中BMSCs抑制PBMC增殖能力无明显改变，各时间点间差异均无统计学意义（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d，BMSCs抑制PBMC增殖能力逐渐减弱，共培养体系中PBMC增殖显著增加，各时间点间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 5、6。
3 讨论
同种异体干细胞移植、组织工程与再生医学是当前多种自身免疫性疾病治疗、组织缺损修复的研究热点。MSCs具有自我更新和多向分化潜能，同时具备低免疫原性和强免疫抑制能力的特点，是干细胞治疗、组织工程与再生医学的重要种子细胞[9-12]。BMSCs作为MSCs中的一类，在成人体内数量丰富，取材、分离、培养方法简便。我们在体外成功分离、培养了BMSCs，观察显示其在细胞形态及细胞表型方面与其他MSCs一致，也具备向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化的能力，同时未分化的BMSCs表达HLA-Ⅰ类分子、不表达HLA-Ⅱ类分子、能够抑制PBMC的增殖，这与既往文献报道结果一致[6]，说明BMSCs具备作为主要种子细胞的潜在优势。目前，BMSCs已开始应用于软骨缺损修复[13]、骨组织修复[7]、慢性损伤治疗[14]等组织工程和再生医学的前期临床研究，而BMSCs的免疫学特性却很大程度上影响其移植后的功能发挥[15-16]。然而，体内移植后分化的BMSCs是否仍具有未分化前的低免疫原性和强免疫抑制能力，以防止分化后的体内排斥反应？BMSCs在体外按照需要定向诱导分化后再进行移植治疗，是否仍能保持其低免疫原性和强免疫抑制能力的特点？这些问题目前仍缺乏相关研究。因此，本研究通过流式细胞术检测BMSCs成骨、成软骨和成脂分化过程中的HLA表达及对PBMC增殖的抑制能力，以期明确BMSCs在分化过程中免疫原性和免疫抑制能力的变化。
通过流式细胞术检测我们发现，成骨、成软骨分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达与未分化BMSCs无显著差异，而成脂分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达逐渐增加并显著高于未分化BMSCs，提示BMSCs在成骨、成软骨分化过程中免疫原性无明显改变，而在成脂分化过程中BMSCs的免疫原性却可能有所增强。我们以抗CD3、CD28微球刺激PBMC增殖模拟体内环境，进一步检测分化过程中BMSCs免疫抑制能力的改变。结果发现成骨、成软骨分化过程中BMSCs抑制PBMC增殖能力均无明显改变，而成脂分化7、14、21 d BMSCs抑制PBMC增殖能力逐渐降低，提示BMSCs免疫抑制能力在成骨、成软骨分化过程中变化不大，而在成脂分化过程中持续降 低。
Le Blanc等[17]曾研究BMSCs在分化过程中 的HLA表达及其免疫学特性，结果提示BMSCs在成骨、成软骨及成脂分化后HLA表达均无明显改变，分化前后BMSCs均具有免疫调节效应，这与本研究的部分结论有所不同。然而，该研究仅检测了BMSCs分化6、12 d的免疫原性及免疫抑制能力，属于BMSCs分化早期阶段，而BMSCs在体内移植后的分化属于一长期过程，故该研究具有一定局限性。我们通过对BMSCs整个分化过程（7、14、21 d）中的免疫学特性进行检测，发现其免疫原性及免疫抑制能力的显著性变化出现在成脂分化14 d后（中晚期阶段），提示BMSCs分化早期免疫学特性可能无明显变化而中晚期变化明显。杨大威等[18]也曾对脐带血来源MSCs成骨分化后免疫原性进行研究，发现成骨分化后脐带血来源MSCs免疫原性增加而免疫抑制能力降低，这不仅说明不同组织来源的MSCs在分化后免疫学特性可能出现不同改变，也说明BMSCs相对脐带血来源MSCs更适合作为同种异体干细胞移植治疗与组织工程再生医学的种子细胞。
综上述，本研究结果提示BMSCs除具有向成骨、成软骨、成脂分化潜能，还具有低免疫原性和强免疫抑制能力，成骨、成软骨分化的BMSCs免疫原性无明显改变而免疫抑制能力显著增加，适合作为组织工程种子细胞；而成脂分化的BMSCs免疫原性显著增加而免疫抑制能力降低，不适合作为组织工程的种子细胞。下一步我们将深入研究BMSCs分化过程中出现免疫学特性改变的原因，为BMSCs在组织工程与再生医学中的应用提供更多理论基础和实验依据。
MSCs是一种多能干细胞，存在于机体多种组织中，成人体内以BMSCs数量较为丰富[1-2]。近年研究发现，BMSCs除了支持造血干细胞外，还具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化的功能和低免疫原性、高免疫抑制能力等特点[3-5]，可广泛应用于同种异体干细胞治疗、组织工程修复与再生医学领域[6-8]。然而，同种异体BMSCs作为干细胞移植治疗与组织工程再生医学的种子细胞，其在种植、分化过程中是否仍保持原有的低免疫原性和高免疫抑制能力的特点，目前尚缺乏这方面的研究。因此，本研究拟通过体外分离、培养BMSCs，并观察其在成骨、成软骨及成脂分化过程中人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ、Ⅱ类分子表达和对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）增殖的抑制能力变化，阐明BMSCs分化过程中免疫原性和免疫抑制能力变化规律，为同种异体BMSCs的临床应用提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
H-DMEM培养基、RPMI1640培养基、青-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS缓冲液、4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司）；石蜡、二甲苯（广州化学试剂厂）；Percoll分离液（Pharmacia Biotech公司，瑞典）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、丙酮酸钠、脯氨酸、羧基荧光素二醋酸盐琥珀亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE）、茜素红、甲苯胺蓝、油红O（Sigma公司，美国）；抗CD3微球、抗CD28微球（BD公司，美国）；胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂（insulin-transferrin-selenium，ITS；Corning公司，美国）；重组人TGF-β3（Peprotech公司，美国）；抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗体（Meltenyi公司，德国）；离心管（15、50 mL）、6孔板、24孔板、25 cm2培养瓶（Corning公司，美国）；移液器（Eppendorf公司，德国）。
生物安全柜、CO2恒温培养箱、低温高速离心机（Thermo Fisher公司，美国）； FACSCalibur流式细胞仪（BD公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；石蜡切片机（Leica公司，德国）。
1.2 BMSCs体外分离、培养及鉴定
1.2.1 BMSCs体外分离、培养
9份骨髓样本分别来自9名25～30岁健康志愿者，经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准并经志愿者知情同意。骨髓样本加入PBS缓冲液按1∶1比例混匀，用注射器缓慢加入等量1.073 g/mL Percoll分离液，以900×g离心30 min。吸取中间白膜层并用PBS缓冲液洗涤3次，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基重悬后，以2×106个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。72 h后洗去未贴壁细胞，此后每3天换液1次。于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，当细胞达80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代，取第2～3代细胞用于后续实验。
1.2.2 BMSCs三向分化鉴定
① 成骨分化：将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后换为成骨诱导培养基（含10%FBS、50 mg/ L抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后行茜素红染色，倒置相差显微镜下观察钙结节形成情况。② 成软骨分化：调整BMSCs密度为1×106 个 /μL，吸取20 μL接种于24孔板，2 h后加入成软骨诱导培养基（含10%FBS、50 mg/L抗坏血酸、1%ITS-Premix、1 mmol/ L丙酮酸钠、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后收获软骨球，多聚甲醛固定、石蜡包埋切片后行甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜下观察软骨形成情况。③ 成脂分化：将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后换为成脂诱导培养基（含10%FBS、10 μg/mL胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM培养基），此后每3天换液1次。诱导14 d后行油红O染色，倒置相差显微镜下观察脂肪滴形成情况。
1.2.3 流式细胞仪鉴定
取第2～3代未分化BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以450×g离心5 min后PBS缓冲液重悬计数，调整浓度为1×107个/mL。吸取90 μL细胞悬液分至各流式检测管中，分别加入抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗体10 μL，阴性对照管加入10 μL PBS缓冲液，充分混匀后室温避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次后重悬，于FACSCalibur流式细胞仪上机检测。
1.3 BMSCs分化过程中HLA分子表达检测
将BMSCs以1×105个/孔密度接种于6孔板，分别加入成骨、成软骨、成脂诱导培养基诱导分化7、14、21 d，同时将未诱导分化的BMSCs（0 d）作为对照。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g离心5 min，用PBS缓冲液重悬并调整浓度为1×107 个 / mL。每个样本吸取90 μL细胞悬液，分别加入抗人HLA-Ⅰ-PE和HLA-Ⅱ-FITC抗体10 μL，于4℃避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次后重悬，通过FACSCalibur流式细胞仪检测未分化及成骨、成软骨、成脂分化过程中BMSCs的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类分子表达水平。
1.4 BMSCs分化过程中免疫抑制能力检测
1.4.1 PBMC制备
20份外周血样本分别来自20名25～35岁健康志愿者，经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准并经志愿者知情同意。外周血样本用PBS缓冲液1∶1稀释，用注射器缓慢加入等量1.073 g/mL Percoll分离液，以900×g离心30 min。吸取中间白膜层并用PBS缓冲液洗涤3次，用PBS缓冲液调整密度为1×107个/mL。吸取1 mL细胞悬液并加入1 μL CFSE，于37℃避光孵育30 min，加入4℃预冷的FBS终止反应，并用PBS缓冲液洗涤3次，用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬，计数备用。
1.4.2 分化BMSCs免疫抑制能力检测
将BMSCs按1.3方法分别成骨、成软骨、成脂诱导分化7、14、21 d后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g离心5 min，以3.3×104个/mL密度接种于6 孔板，将未诱导分化的BMSCs（0 d）作为对照，于培养箱中静置12 h贴壁。吸去培养基，按3.3×105个 / mL密度将PBMC接种于上述6孔板，按10∶1比例将PBMC与BMSCs共培养5 d，同时加入抗CD3（0.2 μg/ mL）、CD28（1 μg/mL）微球刺激PBMC增殖，分别以未加入抗CD3、CD28微球为阴性对照，以加入抗CD3、CD28微球但未加入BMSCs作为阳性对照。刺激增殖5 d后收集共培养体系中的PBMC，用PBS缓冲液洗涤、重悬后通过FACSCalibur流式细胞仪检测其CFSE荧光强弱水平作为PBMC的增殖能力指标，以检测未分化及成骨、成软骨、成脂分化过程中BMSCs的免疫抑制能力。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs的形态、分化与表型鉴定
原代及传代后BMSCs均呈梭形、成纤维细胞样生长（图 1）。成骨诱导14 d后茜素红染色呈阳性，镜下可见多个大小不等的红色钙结节；成软骨诱导14 d后甲苯胺蓝染色呈阳性，镜下可见软骨球切片呈蓝紫色；成脂诱导14 d后油红O染色呈阳性，镜下可见细胞内多个红色脂肪滴形成（图 2）。流式细胞仪检测示，BMSCs表型CD14、CD45、HLA-DR表达为阴性，CD29、CD44、CD105表达为阳性，符合MSCs表型特征（图 3）。
图1
第3代BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×40） 2.2 BMSCs分化过程中HLA分子表达检测
未分化BMSCs表达HLA-Ⅰ类分子，基本不表达HLA-Ⅱ类分子。成骨、成软骨分化过程中HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达无明显改变，各时间点间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），且HLA-Ⅱ类分子表达水平均较低。成脂分化14、21 d HLA-Ⅰ类分子表达升高，与0、7 d比较差异有统计学意义（P＜0.05）；14、21 d间差异无统计学意义（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d HLA-Ⅱ类分子表达也逐渐出现并升高，均显著高于0 d，差异有统计学意义（P＜0.05）；7、14、21 d间差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
图5
流式细胞仪检测BMSCs分化过程中对PBMC增殖的抑制能力 ⓐ 单纯PBMC ⓑ 加入抗CD3、CD28微球刺激后 ⓒ 未分化BMSCs ⓓ BMSCs成骨分化7 d ⓔ BMSCs成骨分化14 d ⓕ BMSCs成骨分化21 d ⓖ BMSCs成软骨分化7 d ⓗ BMSCs成软骨分化14 d ⓘ BMSCs成软骨分化21 d ⓙ BMSCs成脂分化7 d ⓚ BMSCs成脂分化14 d ⓛ BMSCs成脂分化21 d 2.3 BMSCs分化过程中免疫抑制能力检测
PBMC在无抗CD3、CD28微球刺激下无明显增殖，加入抗CD3、CD28微球后显著增殖，未分化BMSCs能显著抑制PBMC的增殖。成骨、成软骨分化过程中BMSCs抑制PBMC增殖能力无明显改变，各时间点间差异均无统计学意义（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d，BMSCs抑制PBMC增殖能力逐渐减弱，共培养体系中PBMC增殖显著增加，各时间点间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 5、6。
3 讨论
同种异体干细胞移植、组织工程与再生医学是当前多种自身免疫性疾病治疗、组织缺损修复的研究热点。MSCs具有自我更新和多向分化潜能，同时具备低免疫原性和强免疫抑制能力的特点，是干细胞治疗、组织工程与再生医学的重要种子细胞[9-12]。BMSCs作为MSCs中的一类，在成人体内数量丰富，取材、分离、培养方法简便。我们在体外成功分离、培养了BMSCs，观察显示其在细胞形态及细胞表型方面与其他MSCs一致，也具备向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化的能力，同时未分化的BMSCs表达HLA-Ⅰ类分子、不表达HLA-Ⅱ类分子、能够抑制PBMC的增殖，这与既往文献报道结果一致[6]，说明BMSCs具备作为主要种子细胞的潜在优势。目前，BMSCs已开始应用于软骨缺损修复[13]、骨组织修复[7]、慢性损伤治疗[14]等组织工程和再生医学的前期临床研究，而BMSCs的免疫学特性却很大程度上影响其移植后的功能发挥[15-16]。然而，体内移植后分化的BMSCs是否仍具有未分化前的低免疫原性和强免疫抑制能力，以防止分化后的体内排斥反应？BMSCs在体外按照需要定向诱导分化后再进行移植治疗，是否仍能保持其低免疫原性和强免疫抑制能力的特点？这些问题目前仍缺乏相关研究。因此，本研究通过流式细胞术检测BMSCs成骨、成软骨和成脂分化过程中的HLA表达及对PBMC增殖的抑制能力，以期明确BMSCs在分化过程中免疫原性和免疫抑制能力的变化。
通过流式细胞术检测我们发现，成骨、成软骨分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达与未分化BMSCs无显著差异，而成脂分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子表达逐渐增加并显著高于未分化BMSCs，提示BMSCs在成骨、成软骨分化过程中免疫原性无明显改变，而在成脂分化过程中BMSCs的免疫原性却可能有所增强。我们以抗CD3、CD28微球刺激PBMC增殖模拟体内环境，进一步检测分化过程中BMSCs免疫抑制能力的改变。结果发现成骨、成软骨分化过程中BMSCs抑制PBMC增殖能力均无明显改变，而成脂分化7、14、21 d BMSCs抑制PBMC增殖能力逐渐降低，提示BMSCs免疫抑制能力在成骨、成软骨分化过程中变化不大，而在成脂分化过程中持续降 低。
Le Blanc等[17]曾研究BMSCs在分化过程中 的HLA表达及其免疫学特性，结果提示BMSCs在成骨、成软骨及成脂分化后HLA表达均无明显改变，分化前后BMSCs均具有免疫调节效应，这与本研究的部分结论有所不同。然而，该研究仅检测了BMSCs分化6、12 d的免疫原性及免疫抑制能力，属于BMSCs分化早期阶段，而BMSCs在体内移植后的分化属于一长期过程，故该研究具有一定局限性。我们通过对BMSCs整个分化过程（7、14、21 d）中的免疫学特性进行检测，发现其免疫原性及免疫抑制能力的显著性变化出现在成脂分化14 d后（中晚期阶段），提示BMSCs分化早期免疫学特性可能无明显变化而中晚期变化明显。杨大威等[18]也曾对脐带血来源MSCs成骨分化后免疫原性进行研究，发现成骨分化后脐带血来源MSCs免疫原性增加而免疫抑制能力降低，这不仅说明不同组织来源的MSCs在分化后免疫学特性可能出现不同改变，也说明BMSCs相对脐带血来源MSCs更适合作为同种异体干细胞移植治疗与组织工程再生医学的种子细胞。
综上述，本研究结果提示BMSCs除具有向成骨、成软骨、成脂分化潜能，还具有低免疫原性和强免疫抑制能力，成骨、成软骨分化的BMSCs免疫原性无明显改变而免疫抑制能力显著增加，适合作为组织工程种子细胞；而成脂分化的BMSCs免疫原性显著增加而免疫抑制能力降低，不适合作为组织工程的种子细胞。下一步我们将深入研究BMSCs分化过程中出现免疫学特性改变的原因，为BMSCs在组织工程与再生医学中的应用提供更多理论基础和实验依据。
