引用本文： 陈家磊, 项舟. 生物因子控释技术在软骨修复领域的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(8): 1034-1037. doi: 10.7507/1002-1892.20150220 复制
多种生物因子已被证实在关节软骨修复领域具有重要作用[1]。随着对其作用机制的不断研究，从简单的在缺损处注射[2]到应用更为复杂的控释技术[3]，从单一因子[4]到多种因子联合应用[5]，软骨修复生物因子的应用技术也在飞速发展。其中，控释技术因具有可控性和精细化等特点，成为关节软骨修复领域研究的热点之一。本文将就这一热点研究作一综述。
1 软骨修复生物因子
1.1 生长因子
生长因子是一类通过细胞间信号传递影响细胞活动的多肽类分子，目前对其研究较多。它对细胞具有促进分裂、增殖和分化的作用，主要包括TGF-超家族、IGF-1以及bFGF家族等[6]。其中，TGF-超家族中对软骨修复有重要意义的因子有TGF-1、2、3，BMP-2、4、7以及生长分化因子5。TGF-1、2、3被认为可增加Sox-9的表达和软骨细胞外基质生成，同时还可促进软骨细胞的合成能力[7]；BMP具有同TGF相似的作用，同时它还具有促进MSCs成软骨分化的作用[8]。IGF-1和bFGF对维持软骨细胞稳态，平衡其蛋白多糖生成和降解方面都具有重要作用。IGF-1可减少细胞外基质的分解代谢、增加合成代谢，而bFGF具有促进MSCs和软骨细胞有丝分裂的作用[9]。
1.2 抗血管生成因子
关节软骨由上层的软骨层和下层的软骨下骨层构成，软骨层是无血供、无神经支配的细胞层，而软骨下骨层则有血供支配。由于在关节软骨全层损伤修复中，软骨下骨层中的成血管过程也同时被诱发，这一过程并不适合软骨层中软骨细胞修复所需的低氧环境[10]。因此，近年来抗血管生成因子逐渐成为软骨修复领域的研究热点之一。抗血管生成因子包括内皮他丁、舒拉明、Flt-1和贝伐单抗等，具有抑制血管生成、抑制VEGF和维持软骨组织无血供状态的作用，而抗血管生成因子对软骨损伤模型的修复效果则仍需进行深入研究[11-13]。
1.3 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是一种富含BMP、FGF、PDGF、IGF、TGF和VEGF等多种生长因子的人体血液提取物。有研究表明[14]PRP对关节软骨陈旧性损伤和急性损伤均有修复作用。Sundman等[15]发现PRP可减少TNF-α和基质金属蛋白酶13等炎性因子的基因表达，同时增加内源性透明质酸的生成。这显示了PRP可一方面通过抑制炎性信号来减少软骨降解，另一方面则诱导新生软骨生成。在临床实践中也证实将PRP注射至骨关节炎患者膝关节中，可改善关节疼痛和僵硬症状[16]。但目前对PRP修复软骨的作用机制仍不明确，需进一步研究。
2 控释方式
组织工程软骨要求将细胞培养、生物支架材料和生物因子三者结合，但目前在细胞选择、支架制作、生物因子的有效调控等诸多方面均需要深入研究。其中一个重要课题就是外源性生物因子在体内半衰期短，需在一定时间及范围内持续维持有效浓度和活性，才能有利于细胞增殖和分化。目前，有多种控释方式被用于软骨组织工程中，这些方式各有特点，现分述如下。
2.1 生物因子与支架材料结合
将生物因子与可降解三维支架材料结合，随着支架材料的逐步降解，生长因子得以向周围组织持续释放，并促进细胞在支架材料中增殖。这种方式主要是通过生物因子与支架材料间的作用关系产生的，包括包埋、静电吸引、氢键结合以及表位亲和等。同时，因为这些作用关系的作用力不同，造成生物因子释放曲线也不同[17-19]。Yang等[20]研究发现在修复兔关节软骨损伤模型时，BMP-2在结合肝素的纤维蛋白凝胶中释放持续而稳定，而在普通纤维蛋白凝胶中则有较大的突释率；相应地，BMP-2长期释放比短期释放产生了更多的软骨组织。这可能是因为BMP-2在前者中与肝素产生了静电吸引作用，而在后者中仅仅是包埋作用。所以，如果采用包埋方式，往往早期突释较多，需通过调节支架交联反应时间和交联程度来调整孔隙率和孔径大小，使生长因子可以以不同速率释放，达到控释目的。目前有研究者发明一种新型光敏降解材料o-NB（ortho-nitrobenzyl），这种材料可被设计成支架，结合诸如氨类、生物素、羧酸等活性物质，并根据光敏性设计不同降解率，以达到对这些物质的控释[21]。另外，不同的支架设计也可使生物因子定向释放。Li等[22]设计了一种3层支架结构，上层为致密胶原层，下层为疏松胶原层，中间为负载生长因子的纳米粒层，由于结构的密度不同，中间层生长因子只向下层释放，而不向上层释放，从而使下层具有更好的细胞黏附力和组织修复力。
2.2 微粒与纳米粒的控释
通过微粒与纳米粒控释生物因子是另一种常用方式。微粒和纳米粒可作为分散相植入连续相（如固态聚合物或水凝胶）中，可通过负载生物活性因子、改变孔隙率、机械强度或载细胞作用等改善该合成物的理化性质和生物特性，就可控制不同生长因子的缓释曲线，从而实现不同生长因子的顺序控释。Richardson等[23]使用不同表面共价修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]微球分别负载VEGF和PDGF，实现了2种生长因子的顺序控释。微粒与纳米粒的优势在于其粒径小，相同体积下较普通支架材料具备更大的表面积和更高的载药率。Jiang等[24]将硫酸软骨素按不同比例加入到PLGA中并制成不同大小的微球，发现PLGA微球的直径和孔隙率影响硫酸软骨素的载药率和释放率，随着微球直径在75～150 μm至300～ 355 μm间增大，微球的初始释放率不断降低，而更大的直径则会增加初始释放率。研究者可利用这一特性模拟体内真实环境，控制生长因子释放。另外，微球还可根据外界刺激作为生长因子或化学活性分子的刺激敏感突释载体。Westhaus等[25]将脂质体微球整合入藻酸盐颗粒中制成热敏感脂质体微球，这种微球载荷钙离子，可在37℃时突然释放钙离子。在室温下这种微球具有良好的流动性，但在体内可迅速凝胶化，可作为可注射细胞载体的理想材料。目前，纳米粒正逐渐获得研究者的关注。Santo等[26]发现纳米粒可通过胞吞作用进入细胞，从而在细胞中累积生物因子；另外，更大的表面积容积率也可增大纳米粒对生物因子的包封率和载药率。但是，这一特性也使纳米粒在制备过程中稳定性降低，往往使一部分纳米粒聚合成为微粒，从而削弱其优势。
3 多种生物因子的控释
3.1 多种生物因子联合应用
软骨修复是一极其复杂的过程，涉及到上述多种生物因子的协调参与并激活多条信号通路，而单一因子的作用几乎不可能同时刺激这些信号通路。所以，研究多种生物因子的控释系统是达到更佳软骨修复效果的必然选择。这些控释系统被大体分为两种，一种是多相支架中负载持续释放的生长因子，另一种是生长因子从某种储存器（比如微球）中的定向释放。Dormer等[27]制备支架模拟软骨组织的分层结构，在这些支架材料的不同层次中引入不同生物因子诱导MSCs分别向成软骨和成骨两个方向分化，相对应地修复软骨层和软骨下骨层。另一方面，由于关节微环境的复杂性，当应用多种生物因子时，应尽量把具有不同生物学活性的因子联合起来，以达到模拟真实关节微环境的目的。Bian等[28]将载负TGF-3的藻酸盐微球与包含人MSCs的透明质酸凝胶共培养后植于裸鼠皮下，8周后观察发现形成了钙化现象，但其在微球中加入甲状旁腺激素相关蛋白后，上述钙化现象明显减少。Emans等[12]在修复软骨损伤模型时，将抗血管生成因子舒拉明同软骨生长因子TGF-1联合应用，发现软骨层生成透明软骨而非纤维软骨。同时，Lim等[29]发现BMP-7和TGF-2从水凝胶相的释放不同于从纳米球中释放，其在前者的释放会更加缓慢。这一现象也提示在多因子释放体系中，不同因子间存在潜在的相互影响。
3.2 多种生物因子的序贯应用
多种生物因子在修复软骨过程的不同时期也在不断变化。为了更好地模拟真实关节微环境，多种生长因子可根据需要按一定顺序进行释放。Jaklenec等[30]制备不同的PLGA微球分别负载TGF-1和IGF-1，发现先释放TGF-1可以刺激前体细胞代谢因子的合成，然后释放IGF-1可以增加软骨基质的生成。目前，还有一种自组装多肽类材料因其独特的设计及良好的生物相容性和可降解性，在众多三维支架材料中脱颖而出；自组装多肽以短肽为基本组成单元，通过生物素-抗生蛋白链菌素联结或多肽支架吸收等不同方式，并根据需求复合不同的生物活性分子，赋予该类材料“生物智能”的特性，使材料兼具生物活性和生物安全性；在由功能化自组装多肽构建的三维环境内，细胞能够有更多机会与功能片段接触，并受到外部信号的调控作用，为细胞提供一个高度仿生的三维微环境；另外，其凝胶化过程是通过改变离子间作用力完成，无需改变温度或添加化学交联剂，这是实现细胞三维培养的必要条件，且自组装多肽可高度模拟细胞外基质含水量高的特点，利于营养和代谢物质的流通[31]。Kopesky等[32]利用自组装多肽凝胶复合TGF-1，通过调控Smad2/3信号通路诱导BMSCs向软骨细胞分化；研究还显示TGF-1实验组（自组装多肽凝胶复合TGF-1）细胞培养4 d时，BMSCs在新生血清产生的蛋白多糖含量是空白对照组（无TGF-1生长因子）细胞培养3周时产生蛋白多糖含量的10倍。这说明负载TGF-1的自组装多肽凝胶可有效促进BMSCs向软骨细胞分化。
4 展望
近年来，生物因子控释技术在软骨修复领域的应用前景越来越广阔，软骨组织工程正朝着可控、三维、多向诱导等方向发展，但目前仍面临许多未解决的问题：生物因子在体外半衰期较短，无法形成持续作用效果；生物因子对于软骨细胞或其前体细胞的作用机制仍不明确；对不同控释技术之间的软骨修复效果尚缺乏统一而标准的评价体系，其临床应用还较少。因此，我们期望通过不断探索和完善，使生物因子控释技术在软骨修复领域得到更广泛的应 用。
多种生物因子已被证实在关节软骨修复领域具有重要作用[1]。随着对其作用机制的不断研究，从简单的在缺损处注射[2]到应用更为复杂的控释技术[3]，从单一因子[4]到多种因子联合应用[5]，软骨修复生物因子的应用技术也在飞速发展。其中，控释技术因具有可控性和精细化等特点，成为关节软骨修复领域研究的热点之一。本文将就这一热点研究作一综述。
1 软骨修复生物因子
1.1 生长因子
生长因子是一类通过细胞间信号传递影响细胞活动的多肽类分子，目前对其研究较多。它对细胞具有促进分裂、增殖和分化的作用，主要包括TGF-超家族、IGF-1以及bFGF家族等[6]。其中，TGF-超家族中对软骨修复有重要意义的因子有TGF-1、2、3，BMP-2、4、7以及生长分化因子5。TGF-1、2、3被认为可增加Sox-9的表达和软骨细胞外基质生成，同时还可促进软骨细胞的合成能力[7]；BMP具有同TGF相似的作用，同时它还具有促进MSCs成软骨分化的作用[8]。IGF-1和bFGF对维持软骨细胞稳态，平衡其蛋白多糖生成和降解方面都具有重要作用。IGF-1可减少细胞外基质的分解代谢、增加合成代谢，而bFGF具有促进MSCs和软骨细胞有丝分裂的作用[9]。
1.2 抗血管生成因子
关节软骨由上层的软骨层和下层的软骨下骨层构成，软骨层是无血供、无神经支配的细胞层，而软骨下骨层则有血供支配。由于在关节软骨全层损伤修复中，软骨下骨层中的成血管过程也同时被诱发，这一过程并不适合软骨层中软骨细胞修复所需的低氧环境[10]。因此，近年来抗血管生成因子逐渐成为软骨修复领域的研究热点之一。抗血管生成因子包括内皮他丁、舒拉明、Flt-1和贝伐单抗等，具有抑制血管生成、抑制VEGF和维持软骨组织无血供状态的作用，而抗血管生成因子对软骨损伤模型的修复效果则仍需进行深入研究[11-13]。
1.3 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是一种富含BMP、FGF、PDGF、IGF、TGF和VEGF等多种生长因子的人体血液提取物。有研究表明[14]PRP对关节软骨陈旧性损伤和急性损伤均有修复作用。Sundman等[15]发现PRP可减少TNF-α和基质金属蛋白酶13等炎性因子的基因表达，同时增加内源性透明质酸的生成。这显示了PRP可一方面通过抑制炎性信号来减少软骨降解，另一方面则诱导新生软骨生成。在临床实践中也证实将PRP注射至骨关节炎患者膝关节中，可改善关节疼痛和僵硬症状[16]。但目前对PRP修复软骨的作用机制仍不明确，需进一步研究。
2 控释方式
组织工程软骨要求将细胞培养、生物支架材料和生物因子三者结合，但目前在细胞选择、支架制作、生物因子的有效调控等诸多方面均需要深入研究。其中一个重要课题就是外源性生物因子在体内半衰期短，需在一定时间及范围内持续维持有效浓度和活性，才能有利于细胞增殖和分化。目前，有多种控释方式被用于软骨组织工程中，这些方式各有特点，现分述如下。
2.1 生物因子与支架材料结合
将生物因子与可降解三维支架材料结合，随着支架材料的逐步降解，生长因子得以向周围组织持续释放，并促进细胞在支架材料中增殖。这种方式主要是通过生物因子与支架材料间的作用关系产生的，包括包埋、静电吸引、氢键结合以及表位亲和等。同时，因为这些作用关系的作用力不同，造成生物因子释放曲线也不同[17-19]。Yang等[20]研究发现在修复兔关节软骨损伤模型时，BMP-2在结合肝素的纤维蛋白凝胶中释放持续而稳定，而在普通纤维蛋白凝胶中则有较大的突释率；相应地，BMP-2长期释放比短期释放产生了更多的软骨组织。这可能是因为BMP-2在前者中与肝素产生了静电吸引作用，而在后者中仅仅是包埋作用。所以，如果采用包埋方式，往往早期突释较多，需通过调节支架交联反应时间和交联程度来调整孔隙率和孔径大小，使生长因子可以以不同速率释放，达到控释目的。目前有研究者发明一种新型光敏降解材料o-NB（ortho-nitrobenzyl），这种材料可被设计成支架，结合诸如氨类、生物素、羧酸等活性物质，并根据光敏性设计不同降解率，以达到对这些物质的控释[21]。另外，不同的支架设计也可使生物因子定向释放。Li等[22]设计了一种3层支架结构，上层为致密胶原层，下层为疏松胶原层，中间为负载生长因子的纳米粒层，由于结构的密度不同，中间层生长因子只向下层释放，而不向上层释放，从而使下层具有更好的细胞黏附力和组织修复力。
2.2 微粒与纳米粒的控释
通过微粒与纳米粒控释生物因子是另一种常用方式。微粒和纳米粒可作为分散相植入连续相（如固态聚合物或水凝胶）中，可通过负载生物活性因子、改变孔隙率、机械强度或载细胞作用等改善该合成物的理化性质和生物特性，就可控制不同生长因子的缓释曲线，从而实现不同生长因子的顺序控释。Richardson等[23]使用不同表面共价修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]微球分别负载VEGF和PDGF，实现了2种生长因子的顺序控释。微粒与纳米粒的优势在于其粒径小，相同体积下较普通支架材料具备更大的表面积和更高的载药率。Jiang等[24]将硫酸软骨素按不同比例加入到PLGA中并制成不同大小的微球，发现PLGA微球的直径和孔隙率影响硫酸软骨素的载药率和释放率，随着微球直径在75～150 μm至300～ 355 μm间增大，微球的初始释放率不断降低，而更大的直径则会增加初始释放率。研究者可利用这一特性模拟体内真实环境，控制生长因子释放。另外，微球还可根据外界刺激作为生长因子或化学活性分子的刺激敏感突释载体。Westhaus等[25]将脂质体微球整合入藻酸盐颗粒中制成热敏感脂质体微球，这种微球载荷钙离子，可在37℃时突然释放钙离子。在室温下这种微球具有良好的流动性，但在体内可迅速凝胶化，可作为可注射细胞载体的理想材料。目前，纳米粒正逐渐获得研究者的关注。Santo等[26]发现纳米粒可通过胞吞作用进入细胞，从而在细胞中累积生物因子；另外，更大的表面积容积率也可增大纳米粒对生物因子的包封率和载药率。但是，这一特性也使纳米粒在制备过程中稳定性降低，往往使一部分纳米粒聚合成为微粒，从而削弱其优势。
3 多种生物因子的控释
3.1 多种生物因子联合应用
软骨修复是一极其复杂的过程，涉及到上述多种生物因子的协调参与并激活多条信号通路，而单一因子的作用几乎不可能同时刺激这些信号通路。所以，研究多种生物因子的控释系统是达到更佳软骨修复效果的必然选择。这些控释系统被大体分为两种，一种是多相支架中负载持续释放的生长因子，另一种是生长因子从某种储存器（比如微球）中的定向释放。Dormer等[27]制备支架模拟软骨组织的分层结构，在这些支架材料的不同层次中引入不同生物因子诱导MSCs分别向成软骨和成骨两个方向分化，相对应地修复软骨层和软骨下骨层。另一方面，由于关节微环境的复杂性，当应用多种生物因子时，应尽量把具有不同生物学活性的因子联合起来，以达到模拟真实关节微环境的目的。Bian等[28]将载负TGF-3的藻酸盐微球与包含人MSCs的透明质酸凝胶共培养后植于裸鼠皮下，8周后观察发现形成了钙化现象，但其在微球中加入甲状旁腺激素相关蛋白后，上述钙化现象明显减少。Emans等[12]在修复软骨损伤模型时，将抗血管生成因子舒拉明同软骨生长因子TGF-1联合应用，发现软骨层生成透明软骨而非纤维软骨。同时，Lim等[29]发现BMP-7和TGF-2从水凝胶相的释放不同于从纳米球中释放，其在前者的释放会更加缓慢。这一现象也提示在多因子释放体系中，不同因子间存在潜在的相互影响。
3.2 多种生物因子的序贯应用
多种生物因子在修复软骨过程的不同时期也在不断变化。为了更好地模拟真实关节微环境，多种生长因子可根据需要按一定顺序进行释放。Jaklenec等[30]制备不同的PLGA微球分别负载TGF-1和IGF-1，发现先释放TGF-1可以刺激前体细胞代谢因子的合成，然后释放IGF-1可以增加软骨基质的生成。目前，还有一种自组装多肽类材料因其独特的设计及良好的生物相容性和可降解性，在众多三维支架材料中脱颖而出；自组装多肽以短肽为基本组成单元，通过生物素-抗生蛋白链菌素联结或多肽支架吸收等不同方式，并根据需求复合不同的生物活性分子，赋予该类材料“生物智能”的特性，使材料兼具生物活性和生物安全性；在由功能化自组装多肽构建的三维环境内，细胞能够有更多机会与功能片段接触，并受到外部信号的调控作用，为细胞提供一个高度仿生的三维微环境；另外，其凝胶化过程是通过改变离子间作用力完成，无需改变温度或添加化学交联剂，这是实现细胞三维培养的必要条件，且自组装多肽可高度模拟细胞外基质含水量高的特点，利于营养和代谢物质的流通[31]。Kopesky等[32]利用自组装多肽凝胶复合TGF-1，通过调控Smad2/3信号通路诱导BMSCs向软骨细胞分化；研究还显示TGF-1实验组（自组装多肽凝胶复合TGF-1）细胞培养4 d时，BMSCs在新生血清产生的蛋白多糖含量是空白对照组（无TGF-1生长因子）细胞培养3周时产生蛋白多糖含量的10倍。这说明负载TGF-1的自组装多肽凝胶可有效促进BMSCs向软骨细胞分化。
4 展望
近年来，生物因子控释技术在软骨修复领域的应用前景越来越广阔，软骨组织工程正朝着可控、三维、多向诱导等方向发展，但目前仍面临许多未解决的问题：生物因子在体外半衰期较短，无法形成持续作用效果；生物因子对于软骨细胞或其前体细胞的作用机制仍不明确；对不同控释技术之间的软骨修复效果尚缺乏统一而标准的评价体系，其临床应用还较少。因此，我们期望通过不断探索和完善，使生物因子控释技术在软骨修复领域得到更广泛的应 用。