引用本文： 陈春媛, 李青, 汪泱. 内皮祖细胞源性胞外囊泡的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(9): 1150-1154. doi: 10.7507/1002-1892.20150249 复制
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一群存在于脐带血、成人骨髓和外周血、能增殖分化为成熟血管内皮细胞的幼稚细胞。该类细胞不仅参与胚胎期血管生成，同时也在出生后血管新生和损伤血管修复过程中发挥关键作用[1]。大量动物实验和早期临床试验数据表明，EPCs移植可促进机体损伤部位新生血管的形成和受损血管的再内皮化，加快组织或器官的再生和功能恢复[2-4]。近来研究发现，移植到体内的EPCs不是通过自身增殖分化为成熟内皮细胞参与血管新生和组织再生，而主要是通过旁分泌机制动员、激活内源性内皮细胞和其他相关细胞参与组织修复[1, 4-6]。
胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞旁分泌的生物活性物质之一，在细胞间信息传递过程中扮演着极为重要的角色[7-8]。在EVs的形成过程中，会选择性地分拣、富集与来源细胞相关的蛋白质、mRNAs和微小RNAs（micro RNAs，miRNAs）等信号分子，这些信号分子在EVs与靶细胞相互作用后被释放到靶细胞中，并在靶细胞中继续发挥功能[7-8]。近年已有不少研究报道EVs具有类似于干/祖细胞的组织修复功能[9-11]，但目前有关EPCs源性EVs（EPC-EVs）的研究尚处于初期阶段。本文主要就EPC-EVs的生物学特性、分离纯化和功能方面的相关研究进行综述。
1 EPC-EVs的生物学特性
EVs是指由细胞来源的脂质双分子层包绕的球囊状结构，包括微泡（microvesicles，MVs）和外泌体（exosomes），二者具有不同的生物学特征，其主要区别在于形成方式和直径大小[7]。MVs又称脱落小体、微粒体，早在1946年Chargaff等[12]就提出了这一概念。MVs是细胞直接由胞质膜出芽、脱落而释放到细胞外环境中的膜性小囊泡，透射电镜下观察其形态不均一，直径通常在100～1 000 nm，但也可能＞1 μm或＜100 nm[7]。1981年Trams等[13]在利用透射电镜测量正常细胞和肿瘤细胞的MVs时，发现除了一群直径为500～1 000 nm的小囊泡（即MVs）外，还存在另外一群更小的囊泡状物质，其平均直径为40 nm。6年后，Johnstone等[14]将这种直径＜100 nm的膜性囊泡正式命名为exosomes。Ex osomes起源于细胞内多泡体（multivesicular bod ies，MVBs），在MVBs与细胞膜融合后被分泌到细胞外基质中[7, 15]；同源性exosomes形态均一、大小相近，不同来源的exosomes直径可以不同，但基本介于40～100 nm[7, 15-17]。
然而，目前有关exosomes与MVs的命名经常混淆，有些研究者甚至将二者混为一谈[18]。如关于EPCs源性MVs的研究中，有较多研究者在定义MVs时采用的是exosomes的概念，但在鉴定这些“MVs”表型时采用的不是exosomes的特定标志物，而是MVs的常规标志物，混淆了MVs和exosomes的概念和特征。这些研究分离纯化所得的“MVs”直径多为60～160 nm[19-22]，由于在该直径范围中的囊泡包括MVs和exosomes，故这些“MVs”很可能是两种囊泡的混合物。也有部分研究者分离所得的EPCs源性MVs直径在100～500 nm[23]或1 μm左右[24]，这更符合MVs的特点。目前尚无研究明确报道EPCs源性exosomes的特性，但已有研究者初步探究了CD34+干细胞群（EPCs是该干细胞群中的一类细胞）来源的exosomes的相关特点。Sahoo等[25]从成人外周血中分选出CD34+干细胞群，并在培养上清中分离得到了大量exosomes，其直径为40～60 nm。提示人外周血源性EPCs分泌的exosomes直径也可能在该范围内。
除了透射电镜观察外，表面标志物检测是鉴定exosomes和MVs的另一必不可少的环节。研究发现，某些蛋白质（如CD9、CD63、CD81和TSG101等）在各种细胞来源的exosomes上均有分布，它们在ex osomes的形成、释放等过程中发挥关键作用[7]。因而研究者将这些蛋白质作为exosomes的通用标志物应用于相关鉴定中。然而，目前研究者尚未发现MVs表面的特定标志物，其脂质成分、膜蛋白的组成和密度还有待进一步研究[7]。现阶段主要用L-选择素、整合素α4和β1等非特异性分子作为标志物，这些分子在MVs与靶细胞的相互作用过程中扮演重要角色[7, 19-22, 24, 26-27]。研究表明，exosomes和MVs中还含有与来源细胞相关的特异性蛋白质、核酸等成分。如CD34+干细胞群分泌的exosomes表达CD34蛋白分子[25]；EPCs源性MVs表达其来源细胞EPCs的特异性标志物（如CD31、CD34和VEGF受体2等），而不表达血小板相关标志物P-选择素和CD42b以及单核细胞标志物CD14[19-24, 26-27]；此外，EPCs源性MVs还富集了EPCs的血管新生相关mRNAs和miRNAs等[19-24, 26-27]。
2 EPC-EVs的分离纯化
目前，大部分研究者主要从EPCs的培养上清液（也称条件培养基）中提取EPC-EVs[19-24, 26-27]。为了避免血清源性EVs的影响，研究者通常会在收集EPCs条件培养基的前一天更换EPCs培养基中的血清，使其在无血清状态下生长24 h，然后再收集细胞上清液。也有少数研究者为了探究外周血中EPC-EVs的相关特性，直接从血浆标本中提取EPC-EVs[28-29]。为获得纯度较高的EPC-EVs，研究者会在分离EPC-EVs前将所得血浆标本进行离心（11 000×g、2 min或3 000×g、15 min），以去除混杂其中的大量血小板[28-29]。
现阶段用于分离纯化EVs的方法有差速离心法、密度梯度离心法、微孔过滤技术、免疫磁珠分选和商品化试剂盒等，其中以差速离心法最为高效[7]，成为提纯EPC-EVs的常用方法。其步骤大致如下[18, 30-32]：① 收集细胞培养上清液，2 000×g离心20 min，以去除上清液中的死亡细胞和细胞碎片；② 以（10 000～20 000）×g离心30 min，得到体积较大的囊泡，即MVs；③ 将经步骤② 离心所得的上清液以100 000×g离心60 min，即得体积较小的囊泡，主要为exosomes。若想获得较高纯度的exosomes或MVs，可在离心后将沉积物用大量PBS重悬，然后重复超速离心1次，最后将所得沉积物重悬在PBS中[18, 30-32]。全程均在4℃条件下进行，所得的ex osomes或MVs置于- 80℃保存备用[18, 30-32]。值得注意的是，在与EPC-EVs相关的大量研究中，研究者将经步骤③ 所得到的囊泡称作MVs[19-24, 26]，而非exosomes。这可能是由于研究者将MVs和exosomes的概念混淆所致。也有研究者将经100 000×g离心后所得沉积物直接称为EVs[27]。由于经超速离心后所得exosomes的纯度并不是非常高，也可能会含有一部分体积偏小的MVs[18]，因而这样命名更准确。为此，下文综述EPCs来源的MVs或exosomes功能时均将其统称为EPC-EVs。
3 EPC-EVs的功能
3.1 EPC-EVs与缺血性损伤修复
组织缺血可导致相应器官功能障碍，甚至功能衰竭。EPCs移植可促进损伤区血管新生和内皮修复，从而加速组织再生和功能恢复。但细胞直接移植存在一定风险，如异常分化、血管栓塞等。近年来研究发现，EPC-EVs富集了其来源细胞EPCs的功能性RNAs，具有与EPCs类似的促血管再生和组织修复功能[19-21, 26]。
Deregibus等[24]发现人外周血源性EPC-EVs中含有与磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog）/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信号通路相关的mRNAs；将其与人微血管内皮细胞共同孵育一段时间后，内皮细胞的增殖活性和成血管能力增强，PI3K/Akt/eNOS信号通路被激活；若采用RNA酶作用于EPC-EVs，或采用PI3K或NOS抑制剂作用于内皮细胞后，EPC-EVs对内皮细胞的促成血管能力则明显降低。该研究提示EPC-EVs可能通过靶向传递PI3K/Akt/eNOS信号通路相关mRNAs，促使原本处于静止期的内皮细胞“获得性”高表达该信号通路的关键分子，进而触发内皮细胞的一系列促血管生成反应。近年来，已有研究者对人外周血来源的EPC-EVs在下肢缺血性损伤、肾脏缺血再灌注损伤和胰岛移植后缺血缺氧性损伤中的作用进行了探究。Ranghino等[19]将EPC-EVs移植至下肢缺血的免疫缺陷型小鼠体内，发现小鼠缺血后肢的毛细血管密度和血流灌注均增加，肌肉坏死程度较用等体积内皮细胞培养基处理的对照组明显减轻，且有明显的肌组织再生。Cantaluppi等[20]将EPC-EVs经尾静脉注射至肾缺血再灌注损伤的大鼠体内，发现在EPC-EVs移植后第2天，损伤大鼠的血尿素氮、血肌酐水平即出现明显下降；组织学结果显示，EPC-EVs可明显增强肾小管上皮细胞和管周血管内皮细胞的增殖、自我修复和抗凋亡能力，减少损伤肾组织内炎性细胞浸润，并能抑制损伤区肾小管周围毛细血管减少、肾小球硬化和肾小管间质性纤维化等；此外，该研究组还发现EPC-EVs具有促进胰岛移植后血管重建的能力。胰岛移植后的早期缺血缺氧是导致大量胰岛死亡的主要原因，因而迅速、充分的再血管化对于移植胰岛的存活及功能至关重要。Cantaluppi等[21]发现EPC-EVs能促进胰岛内皮细胞从胰岛细胞团内爬出，并可增强其增殖、迁移、成血管和抗凋亡的能力；EPC-EVs还能干扰炎性细胞与胰岛内皮细胞的黏附反应，表明EPC-EVs对内皮细胞介导的炎性反应具有抑制作用；研究者将EPC-EVs和Matrigel包裹的新鲜胰岛经皮下注射至免疫缺陷型小鼠的颈背部，发现EPC-EVs可加速移植胰岛的早期血管化、提高其存活能力和改善分泌功能。经进一步分析，研究者发现EPC-EVs含有与增殖、抗凋亡和血管新生密切相关的miRNAs（如miR-126和miR-296）[19-21, 26]。若在移植前先将EPCs中miRNAs合成相关基因Dicer敲除或抑制EPCs中miR-126和miR-296的表达，使其分泌的EVs不含这些miR NAs，或采用RNA酶作用于EPC-EVs后，EPC-EVs对缺血组织的修复作用则显著减弱甚至消失[19-21, 26]，表明EPC-EVs主要通过靶向传递这些关键miRNAs发挥对缺血性损伤组织的修复功能。
3.2 EPC-EVs与系膜增生性肾炎修复
抗Thy-1肾炎又称抗胸腺细胞血清性肾炎，是经典的系膜增生性肾炎模型，主要表现为补体依赖的系膜细胞溶解、系膜细胞异常增生、弥漫性炎性细胞浸润和内皮细胞损伤等[33]。Cantaluppi等[27]将EPC-EVs经股静脉注射至抗Thy-1肾炎损伤的大鼠体内，发现大鼠蛋白尿水平明显降低，肌酐清除率显著升高；组织学结果显示，大鼠肾组织病理改变明显减轻，表现为系膜细胞溶解和凋亡减少、内皮细胞损伤和炎性反应减轻等；经透射电镜和免疫组织化学染色观察，研究者发现EPC-EVs可抑制系膜区补体复合物的沉积和系膜细胞平滑肌肌动蛋白的表达，表明EPC-EVs可减轻系膜细胞损伤并抑制其活化；再者，EPC-EVs还可减少足细胞和内皮细胞的损伤和丢失，有助于维持肾小球滤过屏障的完整性；补体总活性测试结果表明，EPC-EVs还可明显降低大鼠血清补体的溶血活性。然而，成纤维细胞源性EVs则没有上述修复作用，可见EPC-EVs携带某些独特成分且这些成分对EPC-EVs修复抗Thy-1肾炎不可或缺。研究者进一步探究了EPC-EVs修复抗Thy-1肾炎的机制。经成分分析，研究者发现EPC-EVs中含有促血管新生miRNAs（miR-126和miR-296）以及补体活化抑制因子（包括补体因子H、CD55和CD59）的mRNAs和蛋白质；将EPC-EVs作用于抗Thy-1抗体损伤的大鼠系膜细胞后，系膜细胞增殖、抗凋亡能力提高，补体复合物的沉积减少，补体活化抑制因子的表达水平明显升高；而采用RNA酶作用于EPC-EVs后，上述效应则消失。由此可见，EPC-EVs富集的这些功能性物质使得其在治疗补体介导的系膜增生性肾炎上具有独特优势。
3.3 EPC-EVs与心肌肥厚修复
心肌肥厚是心肌工作超负荷的一种适应性反应，主要表现为心肌细胞肥大、凋亡和间质细胞增生及纤维化，是多种心血管疾病的发展基础。研究表明，局部过量血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ）可诱导心肌细胞肥大、凋亡和氧化应激损伤，进而引起心肌重构[34]。Gu等[22]报道，在Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞肥大、凋亡反应中，小鼠骨髓源性EPC-EVs可通过向心肌细胞传递功能性RNAs增强心肌细胞的增殖活性和抗凋亡能力，并抑制心肌细胞活性氧的产生，而这一保护作用可能与EPC-EVs激活心肌细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。该研究结果表明，EPC-EVs还具有修复心肌肥厚的潜能。
3.4 EPC-EVs对心血管疾病的预测价值
外周血中EPCs数量降低可独立预测心脑血管疾病的病程和预后[35]。研究表明，EPC-EVs也具有预测心脑血管疾病的作用[28-29]。研究者发现，外周血中EPC-EVs的水平与各种心脑血管危险因素（如高血压、糖尿病等）成正相关[28-29]。动脉硬化通常被认为是多种心脑血管危险因素对血管壁损害的综合表现，是血管病变的特异性和敏感性标志，临床上常采用主动脉脉搏波传导速度（aortic pulse wave velocity，aPWV）反映动脉硬度。Pirro等[28]发现，外周血中EPC-EVs的水平与aPWV成显著正相关，提示EPC-EVs水平升高能预测动脉硬化进程和衡量疾病严重程度。糖尿病是缺血性脑卒中的一个重要危险因素。Chen等[29]发现，糖尿病小鼠外周血中EPC-EVs的基础水平明显偏高，并与小鼠血糖浓度和小鼠脑卒中后的梗死面积成正相关，与脑微血管密度成负相关。由此可见，EPC-EVs水平升高对脑缺血损伤的预后也具有预测作用。
值得注意的是，有研究发现当EPCs受损、凋亡时，所释放的EVs在数量、成分和功能上有所改变。Pirro等[28]将EPCs置于过氧化氢介导的促凋亡环境或高胆固醇患者的血清中培养，发现EPCs凋亡比例和EPC-EVs生成明显增加，表明不利刺激能加速EPC-EVs的产生。Wang等[23]报道，在普通无血清环境下培养的EPCs所分泌的EVs（starving stress，sEPC-EVs）富含血管新生相关miRNA（miR-126），而在TNF-α介导的促凋亡环境下生长的EPCs所释放的EVs（apoptotic stress，aEPC-EVs）则富集了与细胞凋亡密切相关的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的mRNAs；研究者将这两种类型的EPC-EVs作用于因氧化应激损伤的人脑微血管内皮细胞，发现sEPC-EVs可抑制内皮细胞的凋亡和活性氧的产生、增强内皮细胞的成血管能力，而aEPC-EVs却能加速内皮细胞的凋亡、加剧内皮细胞的功能障碍和氧化应激损伤。Chen等[29]发现，糖尿病小鼠外周血中的EPC-EVs可降低正常EPCs的迁移和成血管能力，减弱甚至消除EPCs对小鼠脑缺血损伤的修复作用。这些研究提示，因各种不利刺激（如高血糖、高胆固醇等）的作用而异常增多的EPC-EVs在内皮细胞损伤和功能障碍中扮演重要角色，可能成为血管相关性疾病治疗的新靶点。
4 展望
EVs作为一种新发现的细胞间信息传递途径，已成为当前研究热点。然而目前有关EPC-EVs的研究尚处于初期，存在诸多问题需要进一步探究和解决。如缺乏快速、经济、高效和标准化的分离方法和技术；EPC-EVs中富集的促血管新生miRNAs所调节的靶细胞mRNAs尚不明确；EPC-EVs靶向传递功能性蛋白质和RNAs时，是否具有受体细胞选择性；静脉注射的EPC-EVs是通过何种分子机制被募集到损伤组织；不同状态下，EPC-EVs的形成机制是否存在差异，所含组分和功能上有哪些不同；如何清除心脑血管病患者外周血中的病理性EPC-EVs等。这些问题都需体内外实验以及临床研究予以解释和证实。
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一群存在于脐带血、成人骨髓和外周血、能增殖分化为成熟血管内皮细胞的幼稚细胞。该类细胞不仅参与胚胎期血管生成，同时也在出生后血管新生和损伤血管修复过程中发挥关键作用[1]。大量动物实验和早期临床试验数据表明，EPCs移植可促进机体损伤部位新生血管的形成和受损血管的再内皮化，加快组织或器官的再生和功能恢复[2-4]。近来研究发现，移植到体内的EPCs不是通过自身增殖分化为成熟内皮细胞参与血管新生和组织再生，而主要是通过旁分泌机制动员、激活内源性内皮细胞和其他相关细胞参与组织修复[1, 4-6]。
胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞旁分泌的生物活性物质之一，在细胞间信息传递过程中扮演着极为重要的角色[7-8]。在EVs的形成过程中，会选择性地分拣、富集与来源细胞相关的蛋白质、mRNAs和微小RNAs（micro RNAs，miRNAs）等信号分子，这些信号分子在EVs与靶细胞相互作用后被释放到靶细胞中，并在靶细胞中继续发挥功能[7-8]。近年已有不少研究报道EVs具有类似于干/祖细胞的组织修复功能[9-11]，但目前有关EPCs源性EVs（EPC-EVs）的研究尚处于初期阶段。本文主要就EPC-EVs的生物学特性、分离纯化和功能方面的相关研究进行综述。
1 EPC-EVs的生物学特性
EVs是指由细胞来源的脂质双分子层包绕的球囊状结构，包括微泡（microvesicles，MVs）和外泌体（exosomes），二者具有不同的生物学特征，其主要区别在于形成方式和直径大小[7]。MVs又称脱落小体、微粒体，早在1946年Chargaff等[12]就提出了这一概念。MVs是细胞直接由胞质膜出芽、脱落而释放到细胞外环境中的膜性小囊泡，透射电镜下观察其形态不均一，直径通常在100～1 000 nm，但也可能＞1 μm或＜100 nm[7]。1981年Trams等[13]在利用透射电镜测量正常细胞和肿瘤细胞的MVs时，发现除了一群直径为500～1 000 nm的小囊泡（即MVs）外，还存在另外一群更小的囊泡状物质，其平均直径为40 nm。6年后，Johnstone等[14]将这种直径＜100 nm的膜性囊泡正式命名为exosomes。Ex osomes起源于细胞内多泡体（multivesicular bod ies，MVBs），在MVBs与细胞膜融合后被分泌到细胞外基质中[7, 15]；同源性exosomes形态均一、大小相近，不同来源的exosomes直径可以不同，但基本介于40～100 nm[7, 15-17]。
然而，目前有关exosomes与MVs的命名经常混淆，有些研究者甚至将二者混为一谈[18]。如关于EPCs源性MVs的研究中，有较多研究者在定义MVs时采用的是exosomes的概念，但在鉴定这些“MVs”表型时采用的不是exosomes的特定标志物，而是MVs的常规标志物，混淆了MVs和exosomes的概念和特征。这些研究分离纯化所得的“MVs”直径多为60～160 nm[19-22]，由于在该直径范围中的囊泡包括MVs和exosomes，故这些“MVs”很可能是两种囊泡的混合物。也有部分研究者分离所得的EPCs源性MVs直径在100～500 nm[23]或1 μm左右[24]，这更符合MVs的特点。目前尚无研究明确报道EPCs源性exosomes的特性，但已有研究者初步探究了CD34+干细胞群（EPCs是该干细胞群中的一类细胞）来源的exosomes的相关特点。Sahoo等[25]从成人外周血中分选出CD34+干细胞群，并在培养上清中分离得到了大量exosomes，其直径为40～60 nm。提示人外周血源性EPCs分泌的exosomes直径也可能在该范围内。
除了透射电镜观察外，表面标志物检测是鉴定exosomes和MVs的另一必不可少的环节。研究发现，某些蛋白质（如CD9、CD63、CD81和TSG101等）在各种细胞来源的exosomes上均有分布，它们在ex osomes的形成、释放等过程中发挥关键作用[7]。因而研究者将这些蛋白质作为exosomes的通用标志物应用于相关鉴定中。然而，目前研究者尚未发现MVs表面的特定标志物，其脂质成分、膜蛋白的组成和密度还有待进一步研究[7]。现阶段主要用L-选择素、整合素α4和β1等非特异性分子作为标志物，这些分子在MVs与靶细胞的相互作用过程中扮演重要角色[7, 19-22, 24, 26-27]。研究表明，exosomes和MVs中还含有与来源细胞相关的特异性蛋白质、核酸等成分。如CD34+干细胞群分泌的exosomes表达CD34蛋白分子[25]；EPCs源性MVs表达其来源细胞EPCs的特异性标志物（如CD31、CD34和VEGF受体2等），而不表达血小板相关标志物P-选择素和CD42b以及单核细胞标志物CD14[19-24, 26-27]；此外，EPCs源性MVs还富集了EPCs的血管新生相关mRNAs和miRNAs等[19-24, 26-27]。
2 EPC-EVs的分离纯化
目前，大部分研究者主要从EPCs的培养上清液（也称条件培养基）中提取EPC-EVs[19-24, 26-27]。为了避免血清源性EVs的影响，研究者通常会在收集EPCs条件培养基的前一天更换EPCs培养基中的血清，使其在无血清状态下生长24 h，然后再收集细胞上清液。也有少数研究者为了探究外周血中EPC-EVs的相关特性，直接从血浆标本中提取EPC-EVs[28-29]。为获得纯度较高的EPC-EVs，研究者会在分离EPC-EVs前将所得血浆标本进行离心（11 000×g、2 min或3 000×g、15 min），以去除混杂其中的大量血小板[28-29]。
现阶段用于分离纯化EVs的方法有差速离心法、密度梯度离心法、微孔过滤技术、免疫磁珠分选和商品化试剂盒等，其中以差速离心法最为高效[7]，成为提纯EPC-EVs的常用方法。其步骤大致如下[18, 30-32]：① 收集细胞培养上清液，2 000×g离心20 min，以去除上清液中的死亡细胞和细胞碎片；② 以（10 000～20 000）×g离心30 min，得到体积较大的囊泡，即MVs；③ 将经步骤② 离心所得的上清液以100 000×g离心60 min，即得体积较小的囊泡，主要为exosomes。若想获得较高纯度的exosomes或MVs，可在离心后将沉积物用大量PBS重悬，然后重复超速离心1次，最后将所得沉积物重悬在PBS中[18, 30-32]。全程均在4℃条件下进行，所得的ex osomes或MVs置于- 80℃保存备用[18, 30-32]。值得注意的是，在与EPC-EVs相关的大量研究中，研究者将经步骤③ 所得到的囊泡称作MVs[19-24, 26]，而非exosomes。这可能是由于研究者将MVs和exosomes的概念混淆所致。也有研究者将经100 000×g离心后所得沉积物直接称为EVs[27]。由于经超速离心后所得exosomes的纯度并不是非常高，也可能会含有一部分体积偏小的MVs[18]，因而这样命名更准确。为此，下文综述EPCs来源的MVs或exosomes功能时均将其统称为EPC-EVs。
3 EPC-EVs的功能
3.1 EPC-EVs与缺血性损伤修复
组织缺血可导致相应器官功能障碍，甚至功能衰竭。EPCs移植可促进损伤区血管新生和内皮修复，从而加速组织再生和功能恢复。但细胞直接移植存在一定风险，如异常分化、血管栓塞等。近年来研究发现，EPC-EVs富集了其来源细胞EPCs的功能性RNAs，具有与EPCs类似的促血管再生和组织修复功能[19-21, 26]。
Deregibus等[24]发现人外周血源性EPC-EVs中含有与磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog）/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信号通路相关的mRNAs；将其与人微血管内皮细胞共同孵育一段时间后，内皮细胞的增殖活性和成血管能力增强，PI3K/Akt/eNOS信号通路被激活；若采用RNA酶作用于EPC-EVs，或采用PI3K或NOS抑制剂作用于内皮细胞后，EPC-EVs对内皮细胞的促成血管能力则明显降低。该研究提示EPC-EVs可能通过靶向传递PI3K/Akt/eNOS信号通路相关mRNAs，促使原本处于静止期的内皮细胞“获得性”高表达该信号通路的关键分子，进而触发内皮细胞的一系列促血管生成反应。近年来，已有研究者对人外周血来源的EPC-EVs在下肢缺血性损伤、肾脏缺血再灌注损伤和胰岛移植后缺血缺氧性损伤中的作用进行了探究。Ranghino等[19]将EPC-EVs移植至下肢缺血的免疫缺陷型小鼠体内，发现小鼠缺血后肢的毛细血管密度和血流灌注均增加，肌肉坏死程度较用等体积内皮细胞培养基处理的对照组明显减轻，且有明显的肌组织再生。Cantaluppi等[20]将EPC-EVs经尾静脉注射至肾缺血再灌注损伤的大鼠体内，发现在EPC-EVs移植后第2天，损伤大鼠的血尿素氮、血肌酐水平即出现明显下降；组织学结果显示，EPC-EVs可明显增强肾小管上皮细胞和管周血管内皮细胞的增殖、自我修复和抗凋亡能力，减少损伤肾组织内炎性细胞浸润，并能抑制损伤区肾小管周围毛细血管减少、肾小球硬化和肾小管间质性纤维化等；此外，该研究组还发现EPC-EVs具有促进胰岛移植后血管重建的能力。胰岛移植后的早期缺血缺氧是导致大量胰岛死亡的主要原因，因而迅速、充分的再血管化对于移植胰岛的存活及功能至关重要。Cantaluppi等[21]发现EPC-EVs能促进胰岛内皮细胞从胰岛细胞团内爬出，并可增强其增殖、迁移、成血管和抗凋亡的能力；EPC-EVs还能干扰炎性细胞与胰岛内皮细胞的黏附反应，表明EPC-EVs对内皮细胞介导的炎性反应具有抑制作用；研究者将EPC-EVs和Matrigel包裹的新鲜胰岛经皮下注射至免疫缺陷型小鼠的颈背部，发现EPC-EVs可加速移植胰岛的早期血管化、提高其存活能力和改善分泌功能。经进一步分析，研究者发现EPC-EVs含有与增殖、抗凋亡和血管新生密切相关的miRNAs（如miR-126和miR-296）[19-21, 26]。若在移植前先将EPCs中miRNAs合成相关基因Dicer敲除或抑制EPCs中miR-126和miR-296的表达，使其分泌的EVs不含这些miR NAs，或采用RNA酶作用于EPC-EVs后，EPC-EVs对缺血组织的修复作用则显著减弱甚至消失[19-21, 26]，表明EPC-EVs主要通过靶向传递这些关键miRNAs发挥对缺血性损伤组织的修复功能。
3.2 EPC-EVs与系膜增生性肾炎修复
抗Thy-1肾炎又称抗胸腺细胞血清性肾炎，是经典的系膜增生性肾炎模型，主要表现为补体依赖的系膜细胞溶解、系膜细胞异常增生、弥漫性炎性细胞浸润和内皮细胞损伤等[33]。Cantaluppi等[27]将EPC-EVs经股静脉注射至抗Thy-1肾炎损伤的大鼠体内，发现大鼠蛋白尿水平明显降低，肌酐清除率显著升高；组织学结果显示，大鼠肾组织病理改变明显减轻，表现为系膜细胞溶解和凋亡减少、内皮细胞损伤和炎性反应减轻等；经透射电镜和免疫组织化学染色观察，研究者发现EPC-EVs可抑制系膜区补体复合物的沉积和系膜细胞平滑肌肌动蛋白的表达，表明EPC-EVs可减轻系膜细胞损伤并抑制其活化；再者，EPC-EVs还可减少足细胞和内皮细胞的损伤和丢失，有助于维持肾小球滤过屏障的完整性；补体总活性测试结果表明，EPC-EVs还可明显降低大鼠血清补体的溶血活性。然而，成纤维细胞源性EVs则没有上述修复作用，可见EPC-EVs携带某些独特成分且这些成分对EPC-EVs修复抗Thy-1肾炎不可或缺。研究者进一步探究了EPC-EVs修复抗Thy-1肾炎的机制。经成分分析，研究者发现EPC-EVs中含有促血管新生miRNAs（miR-126和miR-296）以及补体活化抑制因子（包括补体因子H、CD55和CD59）的mRNAs和蛋白质；将EPC-EVs作用于抗Thy-1抗体损伤的大鼠系膜细胞后，系膜细胞增殖、抗凋亡能力提高，补体复合物的沉积减少，补体活化抑制因子的表达水平明显升高；而采用RNA酶作用于EPC-EVs后，上述效应则消失。由此可见，EPC-EVs富集的这些功能性物质使得其在治疗补体介导的系膜增生性肾炎上具有独特优势。
3.3 EPC-EVs与心肌肥厚修复
心肌肥厚是心肌工作超负荷的一种适应性反应，主要表现为心肌细胞肥大、凋亡和间质细胞增生及纤维化，是多种心血管疾病的发展基础。研究表明，局部过量血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ）可诱导心肌细胞肥大、凋亡和氧化应激损伤，进而引起心肌重构[34]。Gu等[22]报道，在Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞肥大、凋亡反应中，小鼠骨髓源性EPC-EVs可通过向心肌细胞传递功能性RNAs增强心肌细胞的增殖活性和抗凋亡能力，并抑制心肌细胞活性氧的产生，而这一保护作用可能与EPC-EVs激活心肌细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。该研究结果表明，EPC-EVs还具有修复心肌肥厚的潜能。
3.4 EPC-EVs对心血管疾病的预测价值
外周血中EPCs数量降低可独立预测心脑血管疾病的病程和预后[35]。研究表明，EPC-EVs也具有预测心脑血管疾病的作用[28-29]。研究者发现，外周血中EPC-EVs的水平与各种心脑血管危险因素（如高血压、糖尿病等）成正相关[28-29]。动脉硬化通常被认为是多种心脑血管危险因素对血管壁损害的综合表现，是血管病变的特异性和敏感性标志，临床上常采用主动脉脉搏波传导速度（aortic pulse wave velocity，aPWV）反映动脉硬度。Pirro等[28]发现，外周血中EPC-EVs的水平与aPWV成显著正相关，提示EPC-EVs水平升高能预测动脉硬化进程和衡量疾病严重程度。糖尿病是缺血性脑卒中的一个重要危险因素。Chen等[29]发现，糖尿病小鼠外周血中EPC-EVs的基础水平明显偏高，并与小鼠血糖浓度和小鼠脑卒中后的梗死面积成正相关，与脑微血管密度成负相关。由此可见，EPC-EVs水平升高对脑缺血损伤的预后也具有预测作用。
值得注意的是，有研究发现当EPCs受损、凋亡时，所释放的EVs在数量、成分和功能上有所改变。Pirro等[28]将EPCs置于过氧化氢介导的促凋亡环境或高胆固醇患者的血清中培养，发现EPCs凋亡比例和EPC-EVs生成明显增加，表明不利刺激能加速EPC-EVs的产生。Wang等[23]报道，在普通无血清环境下培养的EPCs所分泌的EVs（starving stress，sEPC-EVs）富含血管新生相关miRNA（miR-126），而在TNF-α介导的促凋亡环境下生长的EPCs所释放的EVs（apoptotic stress，aEPC-EVs）则富集了与细胞凋亡密切相关的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的mRNAs；研究者将这两种类型的EPC-EVs作用于因氧化应激损伤的人脑微血管内皮细胞，发现sEPC-EVs可抑制内皮细胞的凋亡和活性氧的产生、增强内皮细胞的成血管能力，而aEPC-EVs却能加速内皮细胞的凋亡、加剧内皮细胞的功能障碍和氧化应激损伤。Chen等[29]发现，糖尿病小鼠外周血中的EPC-EVs可降低正常EPCs的迁移和成血管能力，减弱甚至消除EPCs对小鼠脑缺血损伤的修复作用。这些研究提示，因各种不利刺激（如高血糖、高胆固醇等）的作用而异常增多的EPC-EVs在内皮细胞损伤和功能障碍中扮演重要角色，可能成为血管相关性疾病治疗的新靶点。
4 展望
EVs作为一种新发现的细胞间信息传递途径，已成为当前研究热点。然而目前有关EPC-EVs的研究尚处于初期，存在诸多问题需要进一步探究和解决。如缺乏快速、经济、高效和标准化的分离方法和技术；EPC-EVs中富集的促血管新生miRNAs所调节的靶细胞mRNAs尚不明确；EPC-EVs靶向传递功能性蛋白质和RNAs时，是否具有受体细胞选择性；静脉注射的EPC-EVs是通过何种分子机制被募集到损伤组织；不同状态下，EPC-EVs的形成机制是否存在差异，所含组分和功能上有哪些不同；如何清除心脑血管病患者外周血中的病理性EPC-EVs等。这些问题都需体内外实验以及临床研究予以解释和证实。