引用本文： 孙正宇, 李箭. 组织工程韧带的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(9): 1160-1166. doi: 10.7507/1002-1892.20150251 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是一种致密结缔组织，主要维持膝关节活动度和稳定性。它是膝关节常见损伤结构，多为撕裂或断裂，在年轻人群中发病率较高。由于ACL血供较少，一旦损伤很难自行修复[1]。目前国内外主要采用关节镜下重建ACL，用于重建的移植物主要有自体肌腱、同种异体移植物、人工韧带等，但术后存在肌力下降、关节僵硬、移植物再断裂、供区并发症等问题[2]。组织工程韧带以材料学和生物化学为基础，旨在通过细胞治疗方法促进ACL的再生修复，使新生韧带组织达到与原ACL相似的机械强度与生化特性，为治疗ACL损伤带来了希望[3-4]。现广泛查阅近年来有关组织工程韧带构建及其修复ACL损伤的文献，对相关的种子细胞、支架材料、生长因子及力学刺激的研究进展作一综述。
1 种子细胞
ACL主要由胶原纤维组成（约占94%），其中以Ⅰ型胶原为主；余6%由细胞和基质蛋白组成，基质蛋白主要为弹性蛋白（＜5%）和糖蛋白（＜1%）[5]。目前用于构建组织工程韧带的种子细胞主要为各种韧带及肌腱来源的成纤维细胞和不同组织来源的MSCs[6]。前者主要来源于ACL、内侧副韧带（medial collateral ligament，MCL）、髌腱及跟腱等组织，其中ACL成纤维细胞（ACL fibroblast cells，ACLFs）在自我增殖、胶原及基质蛋白表达方面明显优于其他组织来源的成纤维细胞[7]，因此成为组织工程韧带最重要的种子细胞。在此基础上，有学者分别用完整的和断裂的ACL提取成纤维细胞，并将细胞种植在支架材料上进行体外培养，他们发现这两种来源的细胞在外观形态、新生韧带结构以及合成肌动蛋白及整合素方面均无差异，提示将来可利用自身断裂的ACL作为种子细胞来源[8]。进一步研究还发现，ACLFs在凝胶中移行快且表型稳定，使其在细胞学特性方面较其他部位细胞更适合作为组织工程韧带种子细胞[9]。
另一种重要的种子细胞是MSCs，其具有增殖能力强、免疫调节、定向归巢等优点[10]，以及成骨、成脂、成软骨、成韧带等多向分化潜能[11]。目前组织工程韧带相关研究中应用最广泛的是BMSCs。有研究证实，BMSCs能在体内韧带损伤处大量增殖，并定向分化为韧带样细胞，促进韧带组织血管化，刺激韧带中的ACLFs向损伤部位移动，减少韧带损伤处的细胞凋亡，促进损伤处瘢痕组织形成，使损伤韧带修复再生[12]。多项研究已表明，韧带组织中同样富含MSCs和祖细胞群，而祖细胞群也具有自我更新和多向分化潜能，当韧带损伤时，这些细胞能被积极动员并迁移至损伤部位进行自我修复，这也打破了损伤韧带无法自行修复愈合的传统观念，为韧带的修复再生提供了新思路[13-14]。
然而，虽然ACL中含有MSCs，但数量极少，修复作用有限；ACLFs属于终末分化成熟细胞，其来源有限、增殖能力差、体外培养扩增困难、生物活性较低，无法修复损伤韧带[15]。另一方面，BMSCs在骨髓中含量极低（约0.001%），在体外扩增时随着传代次数增加，其增殖能力和分化潜能均会下降，甚至出现细胞老化或转化，逐渐失去其“干性”特点[16]。为解决一种种子细胞无法满足组织工程韧带构建需要的问题，有学者将MSCs和韧带细胞或腱细胞进行共培养，成功表达了更多的胶原及腱糖蛋白。Luo等[17]通过将大鼠BMSCs和跟腱细胞进行共培养，发现与单纯BMSCs对照组相比，在同一时期内共培养组细胞增殖量、增殖相关基因c-fos和肌腱相关基因的表达均明显上升，表明跟腱细胞能促进BMSCs向肌腱分化，并刺激BMSCs增殖和相关肌腱基因的表达。在直接共培养系统中，不同种类的肌腱韧带细胞会对MSCs的增殖、分化方向以及共培养效果起到关键作用，MSCs会按照与之直接接触的肌腱韧带细胞方向分化，并产生相应产物[18-19]。Proffen等[20]通过将ACLFs与髌下脂肪垫及外周血源性MSCs进行共培养，发现髌下脂肪垫来源的MSCs能促进ACLFs增殖及胶原合成，外周血来源的MSCs能动员ACLFs更快迁移至韧带损伤处，从而促进韧带修复，说明以上两种不同来源的MSCs均能加速韧带组织的修复再生。Canseco等[21]通过构建ACLFs和BMSCs共培养体系发现，当ACLFs/MSCs比值为1∶1时，Ⅰ 型胶原及腱糖蛋白表达量最多，Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比值也最大，最接近宿主韧带的组成成分，提示这种细胞比例的共培养方式最适用于构建组织工程韧 带。
利用ACLFs和MSCs的共培养策略，不仅能将种子细胞负载在支架上植入体内，而且可利用细胞释放出的趋化因子和细胞因子促进支架内血管形成，促进愈合反应，动员宿主韧带中的MSCs向支架聚集，从而增强体内韧带的再生反应。此外，MSCs具有抗炎和免疫调节作用，能够减轻支架复合物植入体内后引起的免疫反应与炎性反应，从而保护植入物，加强韧带修复[22]。通过共培养系统可使两种及以上的种子细胞同时或按照一定顺序进行相互作用，一方面ACLFs能为MSCs提供所需的外环境及营养支持，刺激MSCs增殖并向韧带方向分化；另一方面MSCs能充分发挥抗炎和免疫调节作用，刺激ACLFs以及韧带内的祖细胞向韧带缺损处迁移聚集，促进ACLFs生成胶原和基质蛋白[20]。
2 支架材料
良好的支架材料应具有生物相容性好、机械强度高的特点，能为种子细胞的黏附、增殖、迁移和发挥功能提供场所，并能够生物降解以便新的韧带组织向内生长，加速ACL的再生修复。用于构建组织工程韧带的支架材料主要包括生物材料、生物降解聚合物以及复合材料，目前以上支架材料均处于临床研究阶段，其临床适用性还有待进一步评估[23]。
2.1 生物材料
由于天然ACL中Ⅰ型胶原含量接近90%，受此启发，既往一些学者将胶原纤维制成支架材料，并通过体内外实验证明兔ACLFs能够很好地黏附于胶原支架上，并保持细胞活性，但支架植入体内后附着细胞会逐渐减少，机械强度也逐渐降低，并且6周后即被完全降解吸收[24-25]。随后有学者开发出一种新的胶原-糖胺聚糖复合支架，它能使支架细胞快速增殖，并表达韧带成纤维细胞表型，但其机械强度相对较差[26]。为了提高胶原支架的机械性能，许多学者通过特殊处理方式使胶原纤维以交联式或扭曲编织制成支架，虽然在一定程度上提高了胶原支架的机械强度，但仍无法达到要求标准[27-28]。
蚕丝支架也是一种生物材料，由于生物相容性好，在三维空间构型和抗张强度方面与宿主ACL近似，在体内进行生物降解的同时能保持其原有抗张强度达1年左右，可在较长时间内维持关节稳定性，为新生韧带的长入提供充裕时间，使新生韧带组织在胶原纤维排布、血管化等方面与原有韧带相近[29]。目前研究者发现，用亲水性较高的蚕丝衍生物制成的支架能促进细胞更快更好地增殖[30]。鉴于此，Horan等[31]研制出了一种具有亲水性的蚕丝纤维支架，该支架材料层次结构复杂，能在生物相容性、可降解性及机械强度方面满足韧带再生的要求。Fan等[32]将BMSCs负载到编织好的蚕丝纤维支架上，使BMSCs在支架上大量增殖并分化为韧带样成纤维细胞，继而分泌出胶原纤维和腱糖蛋白；然后将细胞-支架复合物植入猪体内24周后观察发现，其成功促进了韧带修复。此外，还有许多生物材料支架可用于构建组织工程韧带，例如透明质酸[33]、壳聚糖[34]、海藻酸盐[35] 等。
2.2 生物降解聚合物
目前由于人工合成的生物降解聚合物在机械性能、降解速度以及生物相容性方面得到了极大改善，其在组织工程领域的应用也越来越广泛。既往有学者将一种编织好的聚二氧六环酮支架植入山羊体内，发现植入后早期支架机械强度即不断下降[36]。Lu等[37]通过将ACLFs分别负载至聚左旋乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及聚乳酸-聚羟基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）所制成的支架上，结果发现PLLA支架上的细胞增殖最多，并且机械强度最好。有学者通过对PLLA支架的不同空间构型进行研究后发现，在线形、编织形、扭曲形、编织-扭曲形这4 种空间排布中，编织-扭曲形排布的支架黏弹性最好[38]。近来，静电纺丝技术被广泛用于制备支架材料，该技术将聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，制造出直径为几纳米至几微米的支架纤维，并能调控支架纤维的孔隙率、直径、强度及排布方式，获得的支架机械强度显著高于大多数生物降解聚合物支架。Cardwell等[39]采用该技术研制出了6种直径排布不同的超细纤维支架，结果显示纤维直径较大 （＞2 μm）、排布规则的支架上MSCs增殖最快，沉积在支架上 的 胶原 及基质蛋白最多，他们还发现支架纤 维 直径对MSCs增殖分化的影响 比 纤维排布更 大。
2.3 复合材料
任何一种单一材料均无法满足组织工程韧带在生化特性及力学强度方面的要求，复合材料则综合了以上材料各自优点，成为当前组织工程韧带支架材料的研究重点。Panas-Perez等[40]研究出一种胶原-蚕丝复合支架，支架中的蚕丝成分＞25%，其机械强度与正常ACL相当。Chung等[41]将疏水性的聚己内酯（polycaprolactone，PCL）和亲水性的PGA-PCL-PGA共聚物组成的混合物制成支架，通过改变二者比例可调节支架的亲水性、机械强度和降解速率。Sahoo等[42]用涂有bFGF缓释剂的超细聚乳酸纤维和脱胶后编织好的微纤维蚕丝支架结合而成的生物复合纤维支架来模拟细胞外基质成分，以此来促进间充质祖细胞的黏附、增殖以及分化为所需的韧带细胞，提高胶原及基质蛋白表达量，从而增强支架材料的机械强度。
目前支架制备技术还不能完全模拟天然ACL的复杂空间构型，还需进一步实验研究来解决支架材料植入体内后所面临的机械强度、降解速率和代谢产物等问题。见表 1。
表1
构建组织工程韧带常用支架材料
Table1.
Common scaffold materials used in ACL tissue engineering
3 生长因子
尽管生长因子对于损伤韧带修复的确切信号机制仍不清楚，但目前研究已证实生长因子对于种子细胞的增殖及分化、胶原及基质蛋白的合成、新生韧带的机械强度和血管化形成都至关重要[43]。
TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3种类型，而BMP也属于TGF-β家族。TGF-β在细胞的免疫调节、生长、分化、基质蛋白合成、创伤修复等方面作用显著，对靶细胞作用的效果取决于细胞类型、分化状态、生长条件以及与其他生长因子相互作用产生的结果，对于ACL的修复再生作用尤为显著[44]。Wang等[44]研究证明TGF-β1能促进韧带细胞增殖，并可直接调节或经转录因子 NF-κB路径间接调节基质金属蛋白酶2的释放，从而使韧带细胞快速迁移至韧带损伤处，促进韧带修复再生。Xie等[45]利用TGF-β1刺激ACL和MCL编码出赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），而LOX能催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联反应，进而促进细胞外基质形成，保持其稳定性，对韧带的修复作用巨大。Hashimoto等[46]首次将重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）注入兔半腱肌肌腱两端，6周后CT检查可见肌腱两端注射部位有2个小骨块形成；然后切取包含2个骨块的骨-肌腱-骨移植物用于兔ACL重建，分别于4、8周获取韧带标本，通过影像学、组织学、生物力学检查发现，使用经rhBMP-2处理的移植物重建韧带后腱-骨愈合牢固，且外观形态和功能与正常ACL相似，表明rhBMP-2具有成骨作用以及促进腱-骨愈合的功能。Schwarting等[47]利用BMP-7刺激成骨细胞、腱-骨交界区细胞及韧带成纤维细胞相关基因表达，用以增强这些细胞的成骨作用及成纤维细胞的转化作用，从而促进腱-骨愈合。Dong等[48]将带有BMP-2目的基因的慢病毒载体成功转染至BMSCs内，再将转染后的BMSCs移植到用于重建兔ACL的腓肠肌腱中，取重建4、8周后的韧带标本进行生物力学和组织学检查，提示腱-骨愈合良好，表明BMP-2基因转染的BMSCs对腱-骨愈合有促进作用。
此外，还有许多生长因子也能促进韧带修复再生，如IGF[49]、bFGF[50]、生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）[51]、VEGF[52]、EGF[53]、PDGF[54]。Kurtz等[49]通过研究发现IGF-1能显著抑制大鼠损伤跟腱的炎性反应，从而最大程度降低对跟腱功能的损害，加速跟腱愈合，但IGF-1对跟腱的生物力学强度并无明显改善。bFGF是一种强丝裂原，能促进MSCs的增殖及迁移，并使MSCs在多次传代后保持自身分化潜能[50]。也有学者将带有能编码BMP-12和BMP-13基因的腺病毒载体转染BMSCs和ACLFs，并成功诱导两种细胞向韧带分化，进而分泌形成大量韧带样基质蛋白[51]。Wei等[52]用携带有TGF-β1和VEGF165基因的重组腺病毒载体转染ACLFs，通过共同表达TGF-β1和VEGF165基因能快速促使ACLFs迁移、增殖并分泌胶原及纤维蛋白。自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）也能促进韧带再生，其不仅含有大量血小板，还包含韧带修复再生所需的多种生长因子。尽管多项体内外研究证实PRP具有促进韧带细胞增殖和分泌胶原及基质蛋白的作用，但也有研究发现单独使用PRP不能加强韧带修复，因此PRP的临床实用性还存在较大争议[55-57]。目前仍无确凿证据证明PRP对韧带再生有直接作用，因此PRP还不能作为韧带损伤的最佳治疗方案。
生长因子对于细胞的作用效果不是一成不变的，常具有时效性，今后需将支架材料与生长因子更好结合起来，通过更完善的生长因子控释技术，以达到对缺损韧带更快、更好的修复效果。见表 2。
表2
生长因子在组织工程韧带中的作用
Table2.
Effects of growth factors on tissue engineered ligament
4 力学刺激
力学刺激和动力负荷是构建组织工程韧带的关键因素，在适当的力学刺激诱导下，新生成的韧带组织能合成大量胶原纤维和基质蛋白，重塑新生韧带的内部构型，使其具备足够的抗张强度。目前相关研究已证明，循环机械张力能够促使韧带内的成纤维细胞排布规则有序，诱导其形成纺锤形细胞，因而能够重塑韧带的内部结构，提高植入物的机械强度[58]。Altman等[59]研究将张力负荷和扭转负荷作用于BMSCs，发现即使在缺少生长因子作用的情况下，BMSCs也能不断增殖并向韧带方向分化，合成排布有序的胶原纤维和腱糖蛋白。Subramony等[60]将bFGF与机械刺激联合作用于附着有人MSCs的纳米支架上，结果发现与无机械负荷的对照组相比，实验组能促进人MSCs增殖并向韧带细胞分化，提高胶原和基质蛋白的产量。
尽管力学刺激能够促进细胞增殖，提高韧带相关基因的表达，但其效应与作用细胞的类型、机械刺激的频率、持续时间、作用方向及强度大小有关[23]。有学者[61]发现在种子细胞接种至支架后早期施加机械张力，会抑制Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达；而当MSCs增殖数量达到峰值时再施加力学刺激则会促进胶原表达。Park等[62]发现与4%循环张力组和无力学刺激对照组相比，8%循环张力刺激下的ACLFs增殖更快、合成胶原更多。Kreja等[63]将单向循环的间断张力作用于负载有ACLFs的聚乳酸支架上，发现ACLFs表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维蛋白和腱糖蛋白水平明显升高，而处于相同条件下的MSCs则无明显变化。
通常情况下，力学刺激能引起细胞整合素介导的局部黏附和细胞骨架的变形，为了确定组织工程韧带最佳力学刺激参数，还需进一步研究ACL形成过程中的力学传导通路[64-65]。当力学刺激作用于支架上的种子细胞时会引起细胞的养分运输、代谢产物和所需氧气改变，而组织工程韧带重建韧带后必须能经受住关节内部复杂的应力变化，才能维持关节稳定。因此，今后还需要更多体内实验来验证组织工程韧带的机械强度是否达到应对体内复杂力学环境的要求。
5 小结与展望
组织工程韧带构建涉及到种子细胞、支架材料、生长因子、力学刺激等多个环节，以及各种要素的组合。在目前研究基础上需要进一步探索ACL体内再生重塑过程，明确体内局部生长因子以及力学传导通路在该过程中的相互作用机制，这对实验过程中构建ACL再生修复所需内部环境至关重要。种子细胞及支架材料的优选及其向临床的转化应用研究迫在眉睫。体外精准设计的仿生组织工程韧带在体内的转归及促进韧带再生的确切机制也需进一步研究。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是一种致密结缔组织，主要维持膝关节活动度和稳定性。它是膝关节常见损伤结构，多为撕裂或断裂，在年轻人群中发病率较高。由于ACL血供较少，一旦损伤很难自行修复[1]。目前国内外主要采用关节镜下重建ACL，用于重建的移植物主要有自体肌腱、同种异体移植物、人工韧带等，但术后存在肌力下降、关节僵硬、移植物再断裂、供区并发症等问题[2]。组织工程韧带以材料学和生物化学为基础，旨在通过细胞治疗方法促进ACL的再生修复，使新生韧带组织达到与原ACL相似的机械强度与生化特性，为治疗ACL损伤带来了希望[3-4]。现广泛查阅近年来有关组织工程韧带构建及其修复ACL损伤的文献，对相关的种子细胞、支架材料、生长因子及力学刺激的研究进展作一综述。
1 种子细胞
ACL主要由胶原纤维组成（约占94%），其中以Ⅰ型胶原为主；余6%由细胞和基质蛋白组成，基质蛋白主要为弹性蛋白（＜5%）和糖蛋白（＜1%）[5]。目前用于构建组织工程韧带的种子细胞主要为各种韧带及肌腱来源的成纤维细胞和不同组织来源的MSCs[6]。前者主要来源于ACL、内侧副韧带（medial collateral ligament，MCL）、髌腱及跟腱等组织，其中ACL成纤维细胞（ACL fibroblast cells，ACLFs）在自我增殖、胶原及基质蛋白表达方面明显优于其他组织来源的成纤维细胞[7]，因此成为组织工程韧带最重要的种子细胞。在此基础上，有学者分别用完整的和断裂的ACL提取成纤维细胞，并将细胞种植在支架材料上进行体外培养，他们发现这两种来源的细胞在外观形态、新生韧带结构以及合成肌动蛋白及整合素方面均无差异，提示将来可利用自身断裂的ACL作为种子细胞来源[8]。进一步研究还发现，ACLFs在凝胶中移行快且表型稳定，使其在细胞学特性方面较其他部位细胞更适合作为组织工程韧带种子细胞[9]。
另一种重要的种子细胞是MSCs，其具有增殖能力强、免疫调节、定向归巢等优点[10]，以及成骨、成脂、成软骨、成韧带等多向分化潜能[11]。目前组织工程韧带相关研究中应用最广泛的是BMSCs。有研究证实，BMSCs能在体内韧带损伤处大量增殖，并定向分化为韧带样细胞，促进韧带组织血管化，刺激韧带中的ACLFs向损伤部位移动，减少韧带损伤处的细胞凋亡，促进损伤处瘢痕组织形成，使损伤韧带修复再生[12]。多项研究已表明，韧带组织中同样富含MSCs和祖细胞群，而祖细胞群也具有自我更新和多向分化潜能，当韧带损伤时，这些细胞能被积极动员并迁移至损伤部位进行自我修复，这也打破了损伤韧带无法自行修复愈合的传统观念，为韧带的修复再生提供了新思路[13-14]。
然而，虽然ACL中含有MSCs，但数量极少，修复作用有限；ACLFs属于终末分化成熟细胞，其来源有限、增殖能力差、体外培养扩增困难、生物活性较低，无法修复损伤韧带[15]。另一方面，BMSCs在骨髓中含量极低（约0.001%），在体外扩增时随着传代次数增加，其增殖能力和分化潜能均会下降，甚至出现细胞老化或转化，逐渐失去其“干性”特点[16]。为解决一种种子细胞无法满足组织工程韧带构建需要的问题，有学者将MSCs和韧带细胞或腱细胞进行共培养，成功表达了更多的胶原及腱糖蛋白。Luo等[17]通过将大鼠BMSCs和跟腱细胞进行共培养，发现与单纯BMSCs对照组相比，在同一时期内共培养组细胞增殖量、增殖相关基因c-fos和肌腱相关基因的表达均明显上升，表明跟腱细胞能促进BMSCs向肌腱分化，并刺激BMSCs增殖和相关肌腱基因的表达。在直接共培养系统中，不同种类的肌腱韧带细胞会对MSCs的增殖、分化方向以及共培养效果起到关键作用，MSCs会按照与之直接接触的肌腱韧带细胞方向分化，并产生相应产物[18-19]。Proffen等[20]通过将ACLFs与髌下脂肪垫及外周血源性MSCs进行共培养，发现髌下脂肪垫来源的MSCs能促进ACLFs增殖及胶原合成，外周血来源的MSCs能动员ACLFs更快迁移至韧带损伤处，从而促进韧带修复，说明以上两种不同来源的MSCs均能加速韧带组织的修复再生。Canseco等[21]通过构建ACLFs和BMSCs共培养体系发现，当ACLFs/MSCs比值为1∶1时，Ⅰ 型胶原及腱糖蛋白表达量最多，Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比值也最大，最接近宿主韧带的组成成分，提示这种细胞比例的共培养方式最适用于构建组织工程韧 带。
利用ACLFs和MSCs的共培养策略，不仅能将种子细胞负载在支架上植入体内，而且可利用细胞释放出的趋化因子和细胞因子促进支架内血管形成，促进愈合反应，动员宿主韧带中的MSCs向支架聚集，从而增强体内韧带的再生反应。此外，MSCs具有抗炎和免疫调节作用，能够减轻支架复合物植入体内后引起的免疫反应与炎性反应，从而保护植入物，加强韧带修复[22]。通过共培养系统可使两种及以上的种子细胞同时或按照一定顺序进行相互作用，一方面ACLFs能为MSCs提供所需的外环境及营养支持，刺激MSCs增殖并向韧带方向分化；另一方面MSCs能充分发挥抗炎和免疫调节作用，刺激ACLFs以及韧带内的祖细胞向韧带缺损处迁移聚集，促进ACLFs生成胶原和基质蛋白[20]。
2 支架材料
良好的支架材料应具有生物相容性好、机械强度高的特点，能为种子细胞的黏附、增殖、迁移和发挥功能提供场所，并能够生物降解以便新的韧带组织向内生长，加速ACL的再生修复。用于构建组织工程韧带的支架材料主要包括生物材料、生物降解聚合物以及复合材料，目前以上支架材料均处于临床研究阶段，其临床适用性还有待进一步评估[23]。
2.1 生物材料
由于天然ACL中Ⅰ型胶原含量接近90%，受此启发，既往一些学者将胶原纤维制成支架材料，并通过体内外实验证明兔ACLFs能够很好地黏附于胶原支架上，并保持细胞活性，但支架植入体内后附着细胞会逐渐减少，机械强度也逐渐降低，并且6周后即被完全降解吸收[24-25]。随后有学者开发出一种新的胶原-糖胺聚糖复合支架，它能使支架细胞快速增殖，并表达韧带成纤维细胞表型，但其机械强度相对较差[26]。为了提高胶原支架的机械性能，许多学者通过特殊处理方式使胶原纤维以交联式或扭曲编织制成支架，虽然在一定程度上提高了胶原支架的机械强度，但仍无法达到要求标准[27-28]。
蚕丝支架也是一种生物材料，由于生物相容性好，在三维空间构型和抗张强度方面与宿主ACL近似，在体内进行生物降解的同时能保持其原有抗张强度达1年左右，可在较长时间内维持关节稳定性，为新生韧带的长入提供充裕时间，使新生韧带组织在胶原纤维排布、血管化等方面与原有韧带相近[29]。目前研究者发现，用亲水性较高的蚕丝衍生物制成的支架能促进细胞更快更好地增殖[30]。鉴于此，Horan等[31]研制出了一种具有亲水性的蚕丝纤维支架，该支架材料层次结构复杂，能在生物相容性、可降解性及机械强度方面满足韧带再生的要求。Fan等[32]将BMSCs负载到编织好的蚕丝纤维支架上，使BMSCs在支架上大量增殖并分化为韧带样成纤维细胞，继而分泌出胶原纤维和腱糖蛋白；然后将细胞-支架复合物植入猪体内24周后观察发现，其成功促进了韧带修复。此外，还有许多生物材料支架可用于构建组织工程韧带，例如透明质酸[33]、壳聚糖[34]、海藻酸盐[35] 等。
2.2 生物降解聚合物
目前由于人工合成的生物降解聚合物在机械性能、降解速度以及生物相容性方面得到了极大改善，其在组织工程领域的应用也越来越广泛。既往有学者将一种编织好的聚二氧六环酮支架植入山羊体内，发现植入后早期支架机械强度即不断下降[36]。Lu等[37]通过将ACLFs分别负载至聚左旋乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及聚乳酸-聚羟基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）所制成的支架上，结果发现PLLA支架上的细胞增殖最多，并且机械强度最好。有学者通过对PLLA支架的不同空间构型进行研究后发现，在线形、编织形、扭曲形、编织-扭曲形这4 种空间排布中，编织-扭曲形排布的支架黏弹性最好[38]。近来，静电纺丝技术被广泛用于制备支架材料，该技术将聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，制造出直径为几纳米至几微米的支架纤维，并能调控支架纤维的孔隙率、直径、强度及排布方式，获得的支架机械强度显著高于大多数生物降解聚合物支架。Cardwell等[39]采用该技术研制出了6种直径排布不同的超细纤维支架，结果显示纤维直径较大 （＞2 μm）、排布规则的支架上MSCs增殖最快，沉积在支架上 的 胶原 及基质蛋白最多，他们还发现支架纤 维 直径对MSCs增殖分化的影响 比 纤维排布更 大。
2.3 复合材料
任何一种单一材料均无法满足组织工程韧带在生化特性及力学强度方面的要求，复合材料则综合了以上材料各自优点，成为当前组织工程韧带支架材料的研究重点。Panas-Perez等[40]研究出一种胶原-蚕丝复合支架，支架中的蚕丝成分＞25%，其机械强度与正常ACL相当。Chung等[41]将疏水性的聚己内酯（polycaprolactone，PCL）和亲水性的PGA-PCL-PGA共聚物组成的混合物制成支架，通过改变二者比例可调节支架的亲水性、机械强度和降解速率。Sahoo等[42]用涂有bFGF缓释剂的超细聚乳酸纤维和脱胶后编织好的微纤维蚕丝支架结合而成的生物复合纤维支架来模拟细胞外基质成分，以此来促进间充质祖细胞的黏附、增殖以及分化为所需的韧带细胞，提高胶原及基质蛋白表达量，从而增强支架材料的机械强度。
目前支架制备技术还不能完全模拟天然ACL的复杂空间构型，还需进一步实验研究来解决支架材料植入体内后所面临的机械强度、降解速率和代谢产物等问题。见表 1。
表1
构建组织工程韧带常用支架材料
Table1.
Common scaffold materials used in ACL tissue engineering
3 生长因子
尽管生长因子对于损伤韧带修复的确切信号机制仍不清楚，但目前研究已证实生长因子对于种子细胞的增殖及分化、胶原及基质蛋白的合成、新生韧带的机械强度和血管化形成都至关重要[43]。
TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3种类型，而BMP也属于TGF-β家族。TGF-β在细胞的免疫调节、生长、分化、基质蛋白合成、创伤修复等方面作用显著，对靶细胞作用的效果取决于细胞类型、分化状态、生长条件以及与其他生长因子相互作用产生的结果，对于ACL的修复再生作用尤为显著[44]。Wang等[44]研究证明TGF-β1能促进韧带细胞增殖，并可直接调节或经转录因子 NF-κB路径间接调节基质金属蛋白酶2的释放，从而使韧带细胞快速迁移至韧带损伤处，促进韧带修复再生。Xie等[45]利用TGF-β1刺激ACL和MCL编码出赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），而LOX能催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联反应，进而促进细胞外基质形成，保持其稳定性，对韧带的修复作用巨大。Hashimoto等[46]首次将重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）注入兔半腱肌肌腱两端，6周后CT检查可见肌腱两端注射部位有2个小骨块形成；然后切取包含2个骨块的骨-肌腱-骨移植物用于兔ACL重建，分别于4、8周获取韧带标本，通过影像学、组织学、生物力学检查发现，使用经rhBMP-2处理的移植物重建韧带后腱-骨愈合牢固，且外观形态和功能与正常ACL相似，表明rhBMP-2具有成骨作用以及促进腱-骨愈合的功能。Schwarting等[47]利用BMP-7刺激成骨细胞、腱-骨交界区细胞及韧带成纤维细胞相关基因表达，用以增强这些细胞的成骨作用及成纤维细胞的转化作用，从而促进腱-骨愈合。Dong等[48]将带有BMP-2目的基因的慢病毒载体成功转染至BMSCs内，再将转染后的BMSCs移植到用于重建兔ACL的腓肠肌腱中，取重建4、8周后的韧带标本进行生物力学和组织学检查，提示腱-骨愈合良好，表明BMP-2基因转染的BMSCs对腱-骨愈合有促进作用。
此外，还有许多生长因子也能促进韧带修复再生，如IGF[49]、bFGF[50]、生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）[51]、VEGF[52]、EGF[53]、PDGF[54]。Kurtz等[49]通过研究发现IGF-1能显著抑制大鼠损伤跟腱的炎性反应，从而最大程度降低对跟腱功能的损害，加速跟腱愈合，但IGF-1对跟腱的生物力学强度并无明显改善。bFGF是一种强丝裂原，能促进MSCs的增殖及迁移，并使MSCs在多次传代后保持自身分化潜能[50]。也有学者将带有能编码BMP-12和BMP-13基因的腺病毒载体转染BMSCs和ACLFs，并成功诱导两种细胞向韧带分化，进而分泌形成大量韧带样基质蛋白[51]。Wei等[52]用携带有TGF-β1和VEGF165基因的重组腺病毒载体转染ACLFs，通过共同表达TGF-β1和VEGF165基因能快速促使ACLFs迁移、增殖并分泌胶原及纤维蛋白。自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）也能促进韧带再生，其不仅含有大量血小板，还包含韧带修复再生所需的多种生长因子。尽管多项体内外研究证实PRP具有促进韧带细胞增殖和分泌胶原及基质蛋白的作用，但也有研究发现单独使用PRP不能加强韧带修复，因此PRP的临床实用性还存在较大争议[55-57]。目前仍无确凿证据证明PRP对韧带再生有直接作用，因此PRP还不能作为韧带损伤的最佳治疗方案。
生长因子对于细胞的作用效果不是一成不变的，常具有时效性，今后需将支架材料与生长因子更好结合起来，通过更完善的生长因子控释技术，以达到对缺损韧带更快、更好的修复效果。见表 2。
表2
生长因子在组织工程韧带中的作用
Table2.
Effects of growth factors on tissue engineered ligament
4 力学刺激
力学刺激和动力负荷是构建组织工程韧带的关键因素，在适当的力学刺激诱导下，新生成的韧带组织能合成大量胶原纤维和基质蛋白，重塑新生韧带的内部构型，使其具备足够的抗张强度。目前相关研究已证明，循环机械张力能够促使韧带内的成纤维细胞排布规则有序，诱导其形成纺锤形细胞，因而能够重塑韧带的内部结构，提高植入物的机械强度[58]。Altman等[59]研究将张力负荷和扭转负荷作用于BMSCs，发现即使在缺少生长因子作用的情况下，BMSCs也能不断增殖并向韧带方向分化，合成排布有序的胶原纤维和腱糖蛋白。Subramony等[60]将bFGF与机械刺激联合作用于附着有人MSCs的纳米支架上，结果发现与无机械负荷的对照组相比，实验组能促进人MSCs增殖并向韧带细胞分化，提高胶原和基质蛋白的产量。
尽管力学刺激能够促进细胞增殖，提高韧带相关基因的表达，但其效应与作用细胞的类型、机械刺激的频率、持续时间、作用方向及强度大小有关[23]。有学者[61]发现在种子细胞接种至支架后早期施加机械张力，会抑制Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达；而当MSCs增殖数量达到峰值时再施加力学刺激则会促进胶原表达。Park等[62]发现与4%循环张力组和无力学刺激对照组相比，8%循环张力刺激下的ACLFs增殖更快、合成胶原更多。Kreja等[63]将单向循环的间断张力作用于负载有ACLFs的聚乳酸支架上，发现ACLFs表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维蛋白和腱糖蛋白水平明显升高，而处于相同条件下的MSCs则无明显变化。
通常情况下，力学刺激能引起细胞整合素介导的局部黏附和细胞骨架的变形，为了确定组织工程韧带最佳力学刺激参数，还需进一步研究ACL形成过程中的力学传导通路[64-65]。当力学刺激作用于支架上的种子细胞时会引起细胞的养分运输、代谢产物和所需氧气改变，而组织工程韧带重建韧带后必须能经受住关节内部复杂的应力变化，才能维持关节稳定。因此，今后还需要更多体内实验来验证组织工程韧带的机械强度是否达到应对体内复杂力学环境的要求。
5 小结与展望
组织工程韧带构建涉及到种子细胞、支架材料、生长因子、力学刺激等多个环节，以及各种要素的组合。在目前研究基础上需要进一步探索ACL体内再生重塑过程，明确体内局部生长因子以及力学传导通路在该过程中的相互作用机制，这对实验过程中构建ACL再生修复所需内部环境至关重要。种子细胞及支架材料的优选及其向临床的转化应用研究迫在眉睫。体外精准设计的仿生组织工程韧带在体内的转归及促进韧带再生的确切机制也需进一步研究。
