引用本文： 周强, 权正学, 罗小辑, 唐可, 周栩, 张圆, 雷涛. 分化抑制因子1基因对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特性基因表达的影响. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(12): 1547-1552. doi: 10.7507/1002-1892.20150330 复制
椎间盘是人体最大的无血管组织，其营养主要经过终板渗透获得[1]。软骨终板对椎间盘营养供给、维持椎间盘形态以及椎间盘内细胞正常生理功能均有重要作用，Gu等[2]研究发现椎间盘营养供给减少可诱发椎间盘退变。再生治疗即通过转入基因或细胞，增加细胞外基质合成，延缓或逆转椎间盘退变，是退变性椎间盘疾病治疗的研究热点，目前多以髓核细胞为研究对象，对椎间盘营养供应途径中起重要作用的软骨终板研究较少。研究发现BMP-2有促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的作用[3]。Ad-BMP-2转染椎间盘软骨终板细胞后，分化抑制因子1（inhibitor of differentiation 1，Id1）基因表达上调[4-5]。目前对于Id1基因表达变化后，对BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞软骨特异性基因表达的影响尚不清楚。为此，本实验通过慢病毒干扰兔软骨终板细胞Id1基因表达，研究Id1基因表达变化后对BMP-2促进椎间盘终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
取2～3岁新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量2.5～4.0 kg，购于重庆医科大学实验动物中心。
BMP-2慢病毒、 Id1慢病毒、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒（病毒滴度均为3×108 TU/mL；重庆高圣生物医药有限责任公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；FBS、DMEM/F12培养基（GIBCO公司，美国）； PrimeSTAR®HSDNAPolymerase、RNase抑制剂、Trizol（TaKaRa公司，日本）；DEPC（Sigma公司，美国）；兔Ⅱ型胶原ELISA试剂盒、兔蛋白多糖ELISA试剂盒（Roche公司，瑞士）；Id1抗体、BMP-2抗体（Abcam公司，英国）。
电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像仪稳压DNA电泳仪（Tianneng公司，美国）；梯度PCR仪（Eppendorf MG公司，德国）；微量DNA/RNA定量仪（GeneGuent Pro公司，美国）；GDS8000凝胶扫描系统（UVP公司，美国）；GS-15R低温高速离心机（Beckman公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Tek公司，美国）。
1.2 兔椎间盘软骨终板细胞分离及培养
取新西兰大白兔L1、2～L6、7节段的椎间盘终板标本，置于含10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 µg/mL的DMEM/F12培养基。显微镜下分离软骨终板组织，将其剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，置于0.25%胰蛋白酶中震荡消化30 min；以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，移除上清液后，加入0.02%Ⅱ型胶原酶消化30 min；再以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，移除上清液后加入0.02%Ⅱ型胶原酶消化4 h。4 h后用200目细胞筛过滤消化液，滤过液以离心半径20 cm、800 r/ min离心5 min×2次，加入含10%FBS、青霉素100 U/ mL、链霉素100 µg/mL的DMEM/F12培养基，悬浮细胞后转入培养瓶。待10 d左右细胞铺满瓶底后进行传代，选取生长良好的第2代椎间盘软骨终板细胞 进 行实验。倒置相差显微镜下观察细胞形态变 化。
1.3 慢病毒转染软骨终板细胞效率及对细胞Id1基因表达的影响
1.3.1 实验分组及荧光显微镜观察
实验分为4 组：A组为正常软骨终板细胞组；B组为细胞 +20 μL GFP慢病毒转染组；C组为细胞+20 μL高表达Id1基因慢病毒转染组；D组为细胞+20 μL RNA干扰（RNA interference，RNAi）Id1基因慢病毒转染组。细胞转染步骤：取第2代椎间盘软骨终板细胞，加入培养基悬浮细胞，调整细胞密度为3×105 个 / mL，转移入24孔板中进行培养。培养3 d后细胞完全贴壁，加入各组对应的20 μL病毒悬液，适度混匀后，于细胞培养箱内培养。转染72 h后采用荧光显微镜观察B、C、D组转染情况。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测Id1基因表达
各组转染后3 d去除培养基，将Trizol试剂1 mL加入培养板中，按说明书步骤提取RNA备用。反转录体系：模板（RNA）5 μL、2×RT缓冲液10 μL、随机六聚体引物（100 pmol/μL）1 μL、RTmix 1 μL、DEPC水3 μL；反转录条件：25℃、10 min，42℃、53 min，86℃、5 min。PCR反应体系：2× PCR缓冲液25 μL、Prim ers（25 pmol/μL）1 μL×2、cDNA模板2 μL、DEPC 水20.5 μL、SYBR GreenⅠ（20）0.5 μL；PCR反应条件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，35个循环，检测温度72℃。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt计算Id1基因相对表达量，每个样本重复测量3次。相关基因引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。见表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western
blot检测Id1蛋白表达 各组转染后3 d去除培养基，PBS洗1遍；悬浮细胞，以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗1 遍。按试剂盒说明提取蛋白。用封闭液稀释Id1蛋白抗体（1∶1 000），内参一抗GAPDH （1∶3 000），室温孵育1.5 h；用封闭液稀释二抗（1∶5 000），室温孵育1.5 h。将胶片处理后进行扫描，用UVP凝胶图像处理系统自带Labworks4.6软件分析条带灰度值。
1.4 Id1基因表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响
1.4.1 Western
blot检测BMP-2慢病毒转染椎间盘软骨终板细胞后BMP-2蛋白表达 取第2代椎间盘软骨终板细胞于4孔板中培养5 d后分为2组，分别为细胞+10 μL BMP-2慢病毒转染组（A组）和正常软骨终板细胞组（B组）。A组同上法转染BMP-2慢病毒后3 d去除培养液，B组同时间点去除培养液；以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，按试剂盒说明提取蛋白。用封闭液稀释BMP-2蛋白抗体（1∶1 000），内参一抗GAPDH（1∶3 000），室温孵育1 h；用封闭液稀释二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。将胶片处理后进行扫描，用UVP凝胶图像处理系统自带Labworks4.6软件分析条带灰度值，检测两组BMP-2蛋白表达情况。
1.4.2 实时荧光定量PCR检测BMP-2与不同慢病毒共转染后软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖及Id1基因表达
取第2代椎间盘软骨终板细胞于24孔板中培养5 d后分为6组：A组为细胞+10 μL GFP慢病毒转染组，B组为细胞+10 μL BMP-2慢病毒转染组，C组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，D组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，E组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，F组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组。转染后3 d，同1.3.2方法进行实时荧光定量PCR检测，计算Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因相对表达量。每个样本重复测量3 次。见表 1。
1.4.3 ELISA检测Id1基因表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞合成软骨特异性蛋白的影响
取第2 代椎间盘软骨终板细胞于24孔板中培养5 d后分为10组：A组为正常软骨终板细胞组，B组为细胞+10 μL慢病毒转染组，C组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒转染组，D组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒转染组，E组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒组，F组为细胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，G组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，H组为细胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，I组为细胞+10 μL GFP慢病毒转染组，J组为细胞 +10 μL BMP-2慢病毒转染组。同上法细胞转染72 h后，获取细胞外液，按ELISA试剂盒步骤进行检测，绘制标准曲线，计算Ⅱ型胶原和蛋白多糖浓度。
1.5 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 椎间盘软骨终板细胞形态学观察
兔椎间盘软骨终板细胞于培养后5～7 d开始贴壁，10 d左右可铺满瓶底。原代和传代后细胞均呈三角形或多角形。见图 1。
图1
原代椎间盘软骨终板细胞培养10 d形态观察（倒置相差显微镜×100） 2.2 慢病毒转染软骨终板细胞效率和对细胞Id1基因表达的影响
2.2.1 荧光显微镜观察
转染72 h后荧光显微镜下可见B、C、D组慢病毒均能转染兔椎间盘终板软骨细胞，转染率达90%以上。见图 2。
2.2.2 实时荧光定量PCR检测
A、B、C、D组Id1基因相对表达量分别为1.000±0.110、0.996±0.025、2.397±0.319、0.277±0.105。与A组比较，B组GFP慢病毒转染对Id1基因表达无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组高表达Id1基因慢病毒转染细胞后Id1基因表达显著提高，D组RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1基因表达明显降低，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
2.2.3 Western
blot检测 A、B、C、D组Id1蛋白相对表达量分别为0.767±0.066、0.769±0.060、1.060± 0.043、0.345±0.015。与A组比较，B组GFP慢病毒转染对Id1蛋白表达无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组高表达Id1基因慢病毒转染细胞后Id1蛋白表达显著提高，D组RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1蛋白表达明显降低，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
2.3 Id1表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的影响
2.3.1 Western
blot检测 BMP-2慢病毒能够有效转染椎间盘软骨终板细胞，并提高BMP-2表达。A、B组BMP-2蛋白相对表达量分别为0.721±0.023、0.198±0.013，比较差异有统计学意义（t=34.946，P=0.000）。见图 4。
2.3.2 实时荧光定量PCR检测
与A、D组比较，B、C、E组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Id1基因的表达显著提高；A、D组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。C组各基因相对表达量显著高于B、E组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B、E组间差异无统计学意义（P＞0.05）。F组各基因表达较其余各组均明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量PCR检测各组软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖及Id1基因表达（n=3，2.3.3 ELISA检测
与A组比较，B、I组Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达差异无统计学意义（P＞0.05）；C、E、G、J组表达明显增加，D、H组表达明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；E组Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达显著高于C、F、G、J组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F组两指标表达较C、J组显著降低，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
ELISA检测Id1表达变化对BMP-2促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响（n=3，3 讨论
软骨终板在椎间盘营养供给中起重要作用[6]。软骨终板是典型透明软骨，由细胞和基质构成。软骨细胞和成纤维细胞是其主要细胞成分，基质主要为蛋白多糖和Ⅱ型胶原，主要由软骨终板的细胞成分合成[7]。软骨终板中还含有Ⅹ型胶原纤维，随着退变和年龄增加其含量逐渐上升；Ⅹ型胶原被认为和软骨终板的钙化相关[8]。徐宏光等[9]研究发现随着软骨终板退变的加重，椎间盘退变随之加重，表明终板退变可能引起椎间盘退变。目前也有研究认为终板损伤是引起严重腰痛的独立病因[10]。椎间盘软骨终板破坏后会引起椎间盘一系列改变，如椎间盘力学环境的改变，局部炎性介质释放及微环境的改变。这些因素会引起椎间盘髓核基质的合成和降解失衡，更重要的是会引起椎间盘营养途径的破坏，引起细胞数量减少[11]。椎间盘退变性疾病是临床常见疾病，目前研究集中于通过各种方法增加髓核基质的合成，同时减少其降解。但这些方法不能从根本上恢复椎间盘营养途径的功能，且体外实验大都未模拟体内髓核营养缺乏的环境。通过注入细胞或增加某种基因表达来治疗椎间盘退变的方法必然会引起营养物质相对匮乏，进而影响椎间盘再生的治疗效果[12]。因此，维持软骨终板的正常结构和功能，对于提高椎间盘再生治疗效果具有重要意义。既往研究发现，BMP-2有促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的作用[3]，Ad-BMP-2转染椎间盘终板细胞后Id1基因表达上调[4-5]。目前对于Id1基因表达变化后，对BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达的影响尚不清楚，因此本实验旨在研究两者之间的关系。
Id基因有Id1、Id2、Id3、Id4共4种亚型，为碱性螺旋环螺旋的分子，缺乏与DNA结合的结构，起到抑制细胞分化、促进细胞增殖的作用[13]。其中，对Id1基因的研究较为透彻。目前使用较多的椎间盘基因治疗载体为腺相关病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒具有基因载荷大、可高效感染分裂期和非分裂期细胞、并可整合入细胞基因组的优点，是椎间盘再生治疗的理想载体[14]。因此本实验选用慢病毒为基因载体，研究Id1、BMP-2共转染对软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达的影响。实时荧光定量PCR检测结果显示，两种慢病毒均能有效转染椎间盘软骨终板细胞。其中，高表达Id1基因慢病毒转染后，椎间盘软骨终板细胞Id1基因表达较正常软骨终板细胞及GFP慢病毒、RNAi Id1基因慢病毒转染细胞明显升高，而RNAi Id1基因慢病毒转染后细胞Id1基因表达明显降低。Western blot结果表明，高表达Id1基因慢病毒转染后，软骨终板细胞Id1蛋白合成增加，RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1蛋白合成明显下降。提示不同慢病毒载体转染软骨终板细胞能获得稳定表达，并影响Id1的合成。
多基因联合转染是目前椎间盘再生治疗新的研究方向，Moon等[15]以TGF-β1和IGF-1腺病毒同时转染椎间盘细胞后发现，共转染能够显著提高椎间盘细胞蛋白多糖的合成。BMP是TGF-β超家族的一种多功能细胞因子，其中BMP-2是一种被广泛研究的细胞因子。Li等[16]的研究表明，BMP-2能够增加鼠纤维环及移行区细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的合成，同时能够促进BMP-7基因的表达。Kim等[17]的研究发现，BMP-2能增加椎间盘细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成。椎间盘退变过程中，椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖的分解增加、合成减少。Neumann等[18]发现BMP-2具有促进关节软骨前体细胞软骨特异性基因表达，而不增加Ⅹ型胶原合成的作用。软骨终板及髓核被认为是类软骨样组织，因此BMP-2目前作为一种治疗椎间盘退变行疾病的细胞因子而被广泛研究。既往研究表明，BMP-2转染细胞后Id1基因在早期表达增加[19]。但目前Id1基因表达变化对于BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖的影响尚未明确。本实验采用高表达Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒分别与BMP-2慢病毒共同转染椎间盘终板软骨细胞后发现，与BMP-2慢病毒单独转染比较，BMP-2慢病毒与高表达Id1基因慢病毒共转染能够显著增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，表明Id1能够增强BMP-2促进软骨终板合成软骨特异性基因的作用。RNAi Id1基因慢病毒抑制Id1基因表达后，软骨终板内Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成亦随之下降。表明共转染能够提高细胞因子促进软骨特异性基因合成的效果，但BMP-2通过何种信号途径引起椎间盘细胞软骨特异性基因表达增加的机制尚未完全阐明，还需进一步研究。
综上述，本研究发现Id1基因可能在BMP-2促进软骨终板细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成中起重要作用，但相关的机制和信号通路需进一步研究。此外，本研究尚存在一些不足，如Id1被证实与多种肿瘤的发生和转移有关[20-22]，实验未对Id1基因转染软骨终板细胞后的安全性进行评估，相关实验还有待进一步完善。
椎间盘是人体最大的无血管组织，其营养主要经过终板渗透获得[1]。软骨终板对椎间盘营养供给、维持椎间盘形态以及椎间盘内细胞正常生理功能均有重要作用，Gu等[2]研究发现椎间盘营养供给减少可诱发椎间盘退变。再生治疗即通过转入基因或细胞，增加细胞外基质合成，延缓或逆转椎间盘退变，是退变性椎间盘疾病治疗的研究热点，目前多以髓核细胞为研究对象，对椎间盘营养供应途径中起重要作用的软骨终板研究较少。研究发现BMP-2有促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的作用[3]。Ad-BMP-2转染椎间盘软骨终板细胞后，分化抑制因子1（inhibitor of differentiation 1，Id1）基因表达上调[4-5]。目前对于Id1基因表达变化后，对BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞软骨特异性基因表达的影响尚不清楚。为此，本实验通过慢病毒干扰兔软骨终板细胞Id1基因表达，研究Id1基因表达变化后对BMP-2促进椎间盘终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
取2～3岁新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量2.5～4.0 kg，购于重庆医科大学实验动物中心。
BMP-2慢病毒、 Id1慢病毒、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒（病毒滴度均为3×108 TU/mL；重庆高圣生物医药有限责任公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；FBS、DMEM/F12培养基（GIBCO公司，美国）； PrimeSTAR®HSDNAPolymerase、RNase抑制剂、Trizol（TaKaRa公司，日本）；DEPC（Sigma公司，美国）；兔Ⅱ型胶原ELISA试剂盒、兔蛋白多糖ELISA试剂盒（Roche公司，瑞士）；Id1抗体、BMP-2抗体（Abcam公司，英国）。
电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像仪稳压DNA电泳仪（Tianneng公司，美国）；梯度PCR仪（Eppendorf MG公司，德国）；微量DNA/RNA定量仪（GeneGuent Pro公司，美国）；GDS8000凝胶扫描系统（UVP公司，美国）；GS-15R低温高速离心机（Beckman公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Tek公司，美国）。
1.2 兔椎间盘软骨终板细胞分离及培养
取新西兰大白兔L1、2～L6、7节段的椎间盘终板标本，置于含10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 µg/mL的DMEM/F12培养基。显微镜下分离软骨终板组织，将其剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，置于0.25%胰蛋白酶中震荡消化30 min；以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，移除上清液后，加入0.02%Ⅱ型胶原酶消化30 min；再以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，移除上清液后加入0.02%Ⅱ型胶原酶消化4 h。4 h后用200目细胞筛过滤消化液，滤过液以离心半径20 cm、800 r/ min离心5 min×2次，加入含10%FBS、青霉素100 U/ mL、链霉素100 µg/mL的DMEM/F12培养基，悬浮细胞后转入培养瓶。待10 d左右细胞铺满瓶底后进行传代，选取生长良好的第2代椎间盘软骨终板细胞 进 行实验。倒置相差显微镜下观察细胞形态变 化。
1.3 慢病毒转染软骨终板细胞效率及对细胞Id1基因表达的影响
1.3.1 实验分组及荧光显微镜观察
实验分为4 组：A组为正常软骨终板细胞组；B组为细胞 +20 μL GFP慢病毒转染组；C组为细胞+20 μL高表达Id1基因慢病毒转染组；D组为细胞+20 μL RNA干扰（RNA interference，RNAi）Id1基因慢病毒转染组。细胞转染步骤：取第2代椎间盘软骨终板细胞，加入培养基悬浮细胞，调整细胞密度为3×105 个 / mL，转移入24孔板中进行培养。培养3 d后细胞完全贴壁，加入各组对应的20 μL病毒悬液，适度混匀后，于细胞培养箱内培养。转染72 h后采用荧光显微镜观察B、C、D组转染情况。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测Id1基因表达
各组转染后3 d去除培养基，将Trizol试剂1 mL加入培养板中，按说明书步骤提取RNA备用。反转录体系：模板（RNA）5 μL、2×RT缓冲液10 μL、随机六聚体引物（100 pmol/μL）1 μL、RTmix 1 μL、DEPC水3 μL；反转录条件：25℃、10 min，42℃、53 min，86℃、5 min。PCR反应体系：2× PCR缓冲液25 μL、Prim ers（25 pmol/μL）1 μL×2、cDNA模板2 μL、DEPC 水20.5 μL、SYBR GreenⅠ（20）0.5 μL；PCR反应条件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，35个循环，检测温度72℃。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt计算Id1基因相对表达量，每个样本重复测量3次。相关基因引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。见表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western
blot检测Id1蛋白表达 各组转染后3 d去除培养基，PBS洗1遍；悬浮细胞，以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗1 遍。按试剂盒说明提取蛋白。用封闭液稀释Id1蛋白抗体（1∶1 000），内参一抗GAPDH （1∶3 000），室温孵育1.5 h；用封闭液稀释二抗（1∶5 000），室温孵育1.5 h。将胶片处理后进行扫描，用UVP凝胶图像处理系统自带Labworks4.6软件分析条带灰度值。
1.4 Id1基因表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响
1.4.1 Western
blot检测BMP-2慢病毒转染椎间盘软骨终板细胞后BMP-2蛋白表达 取第2代椎间盘软骨终板细胞于4孔板中培养5 d后分为2组，分别为细胞+10 μL BMP-2慢病毒转染组（A组）和正常软骨终板细胞组（B组）。A组同上法转染BMP-2慢病毒后3 d去除培养液，B组同时间点去除培养液；以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，按试剂盒说明提取蛋白。用封闭液稀释BMP-2蛋白抗体（1∶1 000），内参一抗GAPDH（1∶3 000），室温孵育1 h；用封闭液稀释二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。将胶片处理后进行扫描，用UVP凝胶图像处理系统自带Labworks4.6软件分析条带灰度值，检测两组BMP-2蛋白表达情况。
1.4.2 实时荧光定量PCR检测BMP-2与不同慢病毒共转染后软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖及Id1基因表达
取第2代椎间盘软骨终板细胞于24孔板中培养5 d后分为6组：A组为细胞+10 μL GFP慢病毒转染组，B组为细胞+10 μL BMP-2慢病毒转染组，C组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，D组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，E组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，F组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组。转染后3 d，同1.3.2方法进行实时荧光定量PCR检测，计算Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因相对表达量。每个样本重复测量3 次。见表 1。
1.4.3 ELISA检测Id1基因表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞合成软骨特异性蛋白的影响
取第2 代椎间盘软骨终板细胞于24孔板中培养5 d后分为10组：A组为正常软骨终板细胞组，B组为细胞+10 μL慢病毒转染组，C组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒转染组，D组为细胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒转染组，E组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒组，F组为细胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒转染组，G组为细胞+10 μL高表达Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，H组为细胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒转染组，I组为细胞+10 μL GFP慢病毒转染组，J组为细胞 +10 μL BMP-2慢病毒转染组。同上法细胞转染72 h后，获取细胞外液，按ELISA试剂盒步骤进行检测，绘制标准曲线，计算Ⅱ型胶原和蛋白多糖浓度。
1.5 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 椎间盘软骨终板细胞形态学观察
兔椎间盘软骨终板细胞于培养后5～7 d开始贴壁，10 d左右可铺满瓶底。原代和传代后细胞均呈三角形或多角形。见图 1。
图1
原代椎间盘软骨终板细胞培养10 d形态观察（倒置相差显微镜×100） 2.2 慢病毒转染软骨终板细胞效率和对细胞Id1基因表达的影响
2.2.1 荧光显微镜观察
转染72 h后荧光显微镜下可见B、C、D组慢病毒均能转染兔椎间盘终板软骨细胞，转染率达90%以上。见图 2。
2.2.2 实时荧光定量PCR检测
A、B、C、D组Id1基因相对表达量分别为1.000±0.110、0.996±0.025、2.397±0.319、0.277±0.105。与A组比较，B组GFP慢病毒转染对Id1基因表达无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组高表达Id1基因慢病毒转染细胞后Id1基因表达显著提高，D组RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1基因表达明显降低，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
2.2.3 Western
blot检测 A、B、C、D组Id1蛋白相对表达量分别为0.767±0.066、0.769±0.060、1.060± 0.043、0.345±0.015。与A组比较，B组GFP慢病毒转染对Id1蛋白表达无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组高表达Id1基因慢病毒转染细胞后Id1蛋白表达显著提高，D组RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1蛋白表达明显降低，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
2.3 Id1表达变化对BMP-2促进软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的影响
2.3.1 Western
blot检测 BMP-2慢病毒能够有效转染椎间盘软骨终板细胞，并提高BMP-2表达。A、B组BMP-2蛋白相对表达量分别为0.721±0.023、0.198±0.013，比较差异有统计学意义（t=34.946，P=0.000）。见图 4。
2.3.2 实时荧光定量PCR检测
与A、D组比较，B、C、E组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Id1基因的表达显著提高；A、D组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。C组各基因相对表达量显著高于B、E组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B、E组间差异无统计学意义（P＞0.05）。F组各基因表达较其余各组均明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量PCR检测各组软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖及Id1基因表达（n=3，2.3.3 ELISA检测
与A组比较，B、I组Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达差异无统计学意义（P＞0.05）；C、E、G、J组表达明显增加，D、H组表达明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；E组Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达显著高于C、F、G、J组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F组两指标表达较C、J组显著降低，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
ELISA检测Id1表达变化对BMP-2促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响（n=3，3 讨论
软骨终板在椎间盘营养供给中起重要作用[6]。软骨终板是典型透明软骨，由细胞和基质构成。软骨细胞和成纤维细胞是其主要细胞成分，基质主要为蛋白多糖和Ⅱ型胶原，主要由软骨终板的细胞成分合成[7]。软骨终板中还含有Ⅹ型胶原纤维，随着退变和年龄增加其含量逐渐上升；Ⅹ型胶原被认为和软骨终板的钙化相关[8]。徐宏光等[9]研究发现随着软骨终板退变的加重，椎间盘退变随之加重，表明终板退变可能引起椎间盘退变。目前也有研究认为终板损伤是引起严重腰痛的独立病因[10]。椎间盘软骨终板破坏后会引起椎间盘一系列改变，如椎间盘力学环境的改变，局部炎性介质释放及微环境的改变。这些因素会引起椎间盘髓核基质的合成和降解失衡，更重要的是会引起椎间盘营养途径的破坏，引起细胞数量减少[11]。椎间盘退变性疾病是临床常见疾病，目前研究集中于通过各种方法增加髓核基质的合成，同时减少其降解。但这些方法不能从根本上恢复椎间盘营养途径的功能，且体外实验大都未模拟体内髓核营养缺乏的环境。通过注入细胞或增加某种基因表达来治疗椎间盘退变的方法必然会引起营养物质相对匮乏，进而影响椎间盘再生的治疗效果[12]。因此，维持软骨终板的正常结构和功能，对于提高椎间盘再生治疗效果具有重要意义。既往研究发现，BMP-2有促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的作用[3]，Ad-BMP-2转染椎间盘终板细胞后Id1基因表达上调[4-5]。目前对于Id1基因表达变化后，对BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达的影响尚不清楚，因此本实验旨在研究两者之间的关系。
Id基因有Id1、Id2、Id3、Id4共4种亚型，为碱性螺旋环螺旋的分子，缺乏与DNA结合的结构，起到抑制细胞分化、促进细胞增殖的作用[13]。其中，对Id1基因的研究较为透彻。目前使用较多的椎间盘基因治疗载体为腺相关病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒具有基因载荷大、可高效感染分裂期和非分裂期细胞、并可整合入细胞基因组的优点，是椎间盘再生治疗的理想载体[14]。因此本实验选用慢病毒为基因载体，研究Id1、BMP-2共转染对软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达的影响。实时荧光定量PCR检测结果显示，两种慢病毒均能有效转染椎间盘软骨终板细胞。其中，高表达Id1基因慢病毒转染后，椎间盘软骨终板细胞Id1基因表达较正常软骨终板细胞及GFP慢病毒、RNAi Id1基因慢病毒转染细胞明显升高，而RNAi Id1基因慢病毒转染后细胞Id1基因表达明显降低。Western blot结果表明，高表达Id1基因慢病毒转染后，软骨终板细胞Id1蛋白合成增加，RNAi Id1基因慢病毒转染后Id1蛋白合成明显下降。提示不同慢病毒载体转染软骨终板细胞能获得稳定表达，并影响Id1的合成。
多基因联合转染是目前椎间盘再生治疗新的研究方向，Moon等[15]以TGF-β1和IGF-1腺病毒同时转染椎间盘细胞后发现，共转染能够显著提高椎间盘细胞蛋白多糖的合成。BMP是TGF-β超家族的一种多功能细胞因子，其中BMP-2是一种被广泛研究的细胞因子。Li等[16]的研究表明，BMP-2能够增加鼠纤维环及移行区细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的合成，同时能够促进BMP-7基因的表达。Kim等[17]的研究发现，BMP-2能增加椎间盘细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成。椎间盘退变过程中，椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖的分解增加、合成减少。Neumann等[18]发现BMP-2具有促进关节软骨前体细胞软骨特异性基因表达，而不增加Ⅹ型胶原合成的作用。软骨终板及髓核被认为是类软骨样组织，因此BMP-2目前作为一种治疗椎间盘退变行疾病的细胞因子而被广泛研究。既往研究表明，BMP-2转染细胞后Id1基因在早期表达增加[19]。但目前Id1基因表达变化对于BMP-2促进椎间盘软骨终板细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖的影响尚未明确。本实验采用高表达Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒分别与BMP-2慢病毒共同转染椎间盘终板软骨细胞后发现，与BMP-2慢病毒单独转染比较，BMP-2慢病毒与高表达Id1基因慢病毒共转染能够显著增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，表明Id1能够增强BMP-2促进软骨终板合成软骨特异性基因的作用。RNAi Id1基因慢病毒抑制Id1基因表达后，软骨终板内Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成亦随之下降。表明共转染能够提高细胞因子促进软骨特异性基因合成的效果，但BMP-2通过何种信号途径引起椎间盘细胞软骨特异性基因表达增加的机制尚未完全阐明，还需进一步研究。
综上述，本研究发现Id1基因可能在BMP-2促进软骨终板细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成中起重要作用，但相关的机制和信号通路需进一步研究。此外，本研究尚存在一些不足，如Id1被证实与多种肿瘤的发生和转移有关[20-22]，实验未对Id1基因转染软骨终板细胞后的安全性进行评估，相关实验还有待进一步完善。
