引用本文： 郑伟伟, 杨民, 武成, 苏显林. 滑膜间充质干细胞体内外成骨特性的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(1): 102-109. doi: 10.7507/1002-1892.20160021 复制
骨质破坏和骨缺损是临床常见疾病，组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新方法。滑膜间充质干细胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）是目前组织工程研究热点。SMSCs易于获取，体外增殖和分化能力强，较其他来源MSCs有明显优势[1-3]。然而，SMSCs在体外诱导成骨以及在体内成骨罕见报道。本实验通过将SMSCs体外扩增、培养、成骨分化，以及将SMSCs与羟基磷灰石/壳聚糖 /聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid，HA/CS/PLLA） 复合植入大鼠体内，探索SMSCs体内、体外分化成骨的能力，以期为构建组织工程骨提供种子细胞。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
12周龄雄性SD大鼠26只，体质量200～250 g，由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。
FBS、胰蛋白酶-EDTA（HyClone公司，美国）；H-DMEM培养液（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、Ⅱ型胶原酶、HA、CS、PLLA、MTT、ALP试剂盒、茜素红染液、氯化十六烷基吡啶（Sigma公司，美国）；Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒（Takara公司，日本）。Männedorf多功能酶标仪（Tecan公司，瑞士）；紫外分光光度计（Genova Nano公司，英国）；CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；DP70倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；Image J软件（National Institutes of Health公司，美国）。
1.2 SMSCs分离培养及鉴定
1.2.1 SMSCs分离培养
取SD大鼠2只，断颈处死，75%乙醇浸泡15～20 min，打开膝关节腔取出滑膜，PBS冲洗3遍；将滑膜周围脂肪组织和部分结缔组织剥离干净，眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1mm×1 mm大小碎块，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃、200 r/min震荡消化3 h；消化后过200目滤网，以离心半径5 cm、1 000 r/min离心5 min，弃沉淀重悬，接入培养瓶培养，置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱内。24 h后可见细胞贴壁生长，每3天换液1次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞行Giemsa染色，倒置荧光显微镜下观察。
1.2.2 流式细胞仪鉴定
根据文献[1]方法，采用流式细胞仪对第3代SMSCs表面标记物CD147、CD90、CD105、CD44、CD117、CD34、CD14、CD45进行检测。
1.2.3 MTT法绘制细胞曲线
取第1、2、3代SM SCs，制备浓度为1.5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱内，每孔加入5 g/L MTT 100 μL，细胞培养箱中孵育4 h，弃培养液，将培养板晾干后每孔加入DMSO 100 μL。培养后1～6d于酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度（A）值。
1.2.4 成脂诱导鉴定
取第3代SMSCs，以成脂诱导培养基（含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10μg/ mL胰岛素、1 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM 培养基）培养14 d，PBS洗净，行油红O染色观察。
1.2.5 成骨诱导鉴定
取第3代SMSCs，以成骨诱导培养基（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、100 mmol/L地塞米松的DMEM培养基）培养7 d行ALP染色鉴定，21 d行茜素红染色鉴定。
1.3 SMSCs体外成骨培养观测
1.3.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
取第3代SMSCs按1.2.3方法成骨诱导1、7、14、21、28 d，取贴壁细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，以总RNA为模板，参照PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒说明书，25μL作为逆转录反应体积进行PCR检测。各引物序列见表 1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法检测成骨相关基因骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 mRNA相对表达量，以β-actin作为内参。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.3.2 ELISA法检测ALP活性
取第3代SMSCs，以1.0×105个/孔接种于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培养基进行培养，待细胞达100%融合时，于其中6孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余6 孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。分别于成骨诱导后1、3、5、7、9、11 d，PBS漂洗2次，加入1mL PBS溶液，4℃超声裂解细胞，采用ELISA试剂盒和BCA试剂盒分析细胞裂解液中ALP和总蛋白（to talprotein，TP）含量，各组ALP活性以ALP/TP表示。
1.3.3 茜素红S法检测钙盐沉积
取第3代SMSCs，以1.0×105个/孔接种于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培养基进行培养，待细胞达100%融合时，于其中4孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余4孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。成骨诱导7、14、21、28 d，弃培养液，70%乙醇固定30 min，PBS清洗5遍。0.5%茜素红染液室温浸染30 min后，去除多余染料，PBS清洗3遍，倒置荧光显微镜下观察。加入氯化十六烷基室温下浸润30min，吸弃上清液，于分光光度计562 nm波长处测量A值，作为钙含量。
1.4 SMSCs体内成骨培养观测
1.4.1 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察
HA/CS/PLLA 支架材料由中国科技大学微尺度实验室提供，制备方法参照文献[4]。将HA/CS/PLLA支架材料PBS冲洗后，3%戊二醛固定3 h，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯溶液中浸泡20 min，临界点干燥、喷金，扫描电镜观察。
1.4.2 细胞-支架复合物制备
将环氧乙烷消毒后的HA/CS/PLLA材料置入培养皿中，取第3代SMSCs调整成浓度为1.0×106个/mL的细胞悬液，接种于支架材料上，每个材料接种10 μL，置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱中培养3 h，然后缓慢加入含10%FBS的H-DMEM培养基，复合培养72h，备用。
1.4.3 实验分组及方法
取SD大鼠24只，随机分为实验组和对照组（n=12）。3%戊巴比妥钠（30mg/ kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下切开右下肢皮肤，钝性分离肌肉，实验组于肌袋内植入复合培养72h的细胞-支架复合物，对照组仅植入支架材料。缝合切口，分笼饲养。
1.4.4 观测指标
①大体观察：术后观察大鼠活动、切口愈合及进食情况。②X线片观察：术后4、8周，两组分别取6只动物处死，于右下肢行X线片检查，采用Image J软件计算相对灰度值。③组织学观察：术后4、8周，取出两组植入物，去除材料周围脂肪及纤维组织，PBS冲洗；标本于10%多聚甲醛固定72h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋切片，片厚5 μm，每个标本取3张切片，常规行HE染色，光镜下观察。高倍镜下随机测定每张切片3个非重复视野内新骨面积，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMSCs分离培养及鉴定
2.1.1 形态学观察
分离的原代细胞24 h后贴壁，呈不规则形状生长（图 1a）。第2代SMSCs形态混杂，主要以梭形、长梭形为主，可见少量圆形巨噬样细胞（图 1b）。第3代SMSCs铺满瓶底，呈长梭形，主要为滑膜成纤维样细胞（图 1c）。第3代细胞Giemsa染色示细胞为长梭形成纤维样细胞（图 2）。
图1
SMSCs形态学观察 ⓐ 原代细胞（倒置相差显微镜×10） ⓑ 第2代细胞（倒置相差显微镜×20） ⓒ 第3代细胞（倒置相差显微镜 ×20） 图 2 第3代SMSCs Giemsa染色观察（倒置荧光显微镜×20） 图 3 MTT法检测第1～3代细胞增殖曲线 图 4 SMSCs多向分化鉴定（倒置荧光显微镜×20） ⓐ 成脂诱导14 d油红O染色 ⓑ 成骨诱导7 d ALP染色 ⓒ 成骨诱导28 d茜素红染色 图 5 实时荧光定量PCR检测SMSCs体外成骨培养各时间点目的基因表达
Figure1.
Morphological observation of SMSCs ⓐ Primary SMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ⓑ The 2rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) ⓒ The 3rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) Fig. 2 Giemsa staining observation of the 3rd passage SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) Fig. 3 The proliferation curve of passages 1-3 SMSCs by MTT method Fig. 4 Identification of multiple differentiation potential of SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) ⓐ Oil red O staining of SMSCs after adipogenic induction for 14 days ⓑ ALP staining of SMSCs after osteogenic induction for 7 days ⓒ Alirazin red staining of SMSCs after osteogenic induction for 28days Fig. 5 Relative expressions of osteogenic related genes at different time points by real-time fluorescent quantitative PCR
2.1.2 流式细胞仪鉴定
第3代SMSCs流式细胞仪检测结果示，CD147、CD90、CD105、CD44呈阳性表达，表达率分别为98.92%±0.21%、96.41%±0.18%、99.56%±0.17%、95.45%±0.29%；而CD117、CD34、CD14、
CD45呈阴性表达，表达率分别为4.53%± 1.23%、3.85%±1.07%、7.36%±2.34%、4.41%±1.21%。
2.1.3 MTT法检测细胞增殖率
随着培养时间延长，第1～3代细胞A值均逐渐增高；第2、3代细胞呈S形增殖曲线，1、2 d为平台期，3～5 d为对数生长期，6 d后细胞密度较大，细胞间接触抑制生长，进入平台期。见图 3。
2.1.4 成脂、成骨诱导鉴定
SMSCs成脂诱导14d，油红O染色可见红染的块状脂滴（图 4 a）；成骨诱导7 d，ALP染色可见细胞质咖啡样深染（图 4 b）；成骨诱导28 d，茜素红染色可见红色钙化灶（图 4 c）。
2.2 SMSCs体外成骨培养观测
2.2.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
成骨分化晚期标志基因OCN在培养7 d上升不明显；与1、7 d比较，OCN在14 d后上升显著，28 d达峰值，差异有统计学意义（P<0.05）。与培养1d相比，成骨分化早期标志基因Ⅰ型胶原在培养7d上升显著，差异有统计学意义（P<0.05）；14、21、28 d与1d相比无明显上调（P>0.05）。而成骨标志基因ALP、Runx-2在培养7～28 d均明显上调，与1d时比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
2.2.2 ALP活性测定
成骨诱导组诱导1、3 d，ALP活性均增加不明显，5 d ALP活性明显增强，7 d时达峰值，9、11 d ALP活性逐渐降低；5～11d ALP活性均显著高于1、3 d，差异有统计学意义（P<0.05），且5～11 d各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。诱导后5、7、9、11 d成骨诱导组ALP活性均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
成骨诱导后各时间点成骨诱导组及对照组ALP活性比较（n=6，2.2.3 茜素红钙含量测定
SMSCs成骨诱导7 d时茜素红染色未见钙基质，14 d开始出现钙沉积，21 d可见钙化结节，28 d可见大量钙化结节和钙沉积；对照组各时间点均未见红染的钙化灶。见图 6。成骨诱导组诱导培养14、21、28 d，钙含量显著高于7d时，也均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
图2
成骨诱导组及对照组诱导培养后各时间点茜素红染色观察（倒置荧光显微镜×20） ⓐ 成骨诱导组7 d ⓑ 成骨诱导组14 d ⓒ 成骨诱导组21 d ⓓ 成骨诱导组28 d ⓔ 对照组28 d 图 7 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察 ⓐ ×1 000 ⓑ ×10 k 图 8 实验组及对照组术后各时间点X线片观察 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 对照组4周 ⓓ 对照组8周 图 9 实验组及对照组术后各时间点组织学观察（HE×10） ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 对照组4周 ⓓ 对照组8周
Figure2.
Alirazin red staining observation of SMSC-induced group and control group at different time points after osteogenic induction (Inverted fluorescent microscope×20) ⓐ SMSC-induced group at 7 days ⓑ SMSC-induced group at 14 days ⓒ SMSC-induced group at 21 days ⓓ SMSC-induced group at 28 days ⓔ Control group at 28 days Fig. 7 Scanning electron microscope observation of HA/CS/PLLA ⓐ ×1 000 ⓑ ×10k Fig. 8 X-ray films observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Control group at 4 weeks ⓓ Control group at 8 weeks Fig. 9 Histological observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation (HE×10) ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Control group at 4 weeks ⓓ Control group at 8 weeks
表3
诱导后各时间点成骨诱导组及对照组钙含量比较（n=6，2.3 SMSCs体内成骨培养观测
2.3.1 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察
扫描电镜观察示，材料表面分布着大小不等的孔隙，内部为三维网状结构（图 7），为细胞附着、生长以及营养物质运输提供了有利场所。
2.3.2 大体观察
24只大鼠全部存活，术后切口均Ⅰ 期愈合，无炎性反应发生；实验期间动物进食正常。
2.3.3 X线片检测
术后4、8周，实验组与对照组均有高密度影，其中实验组骨密度高于对照组（图 8）。4、8周实验组相对灰度值分别为12.61±1.44和29.73±1.67，均分别高于对照组的4.85±0.84和13.23±0.92，差异有统计学意义（t=13.964，P=0.000；t=25.962，P=0.000）。
2.3.3 组织学观察
术后4周，对照组可见大量成骨细胞及少量未成熟的骨基质，支架材料未完全降解；实验组可见大量成骨细胞及未成熟的骨基质，还有较多软骨基质形成，支架材料完全降解。术后8 周，对照组可见少量新骨形成，支架材料完全降解，并可见大量未成熟的骨基质；实验组可见大量新骨，并有少量未成熟的骨基质，纤维结缔组织长入其中。见图 9。
图像分析显示，术后4、8周实验组新骨面积分别为（2.41±0.29）μm2和（12.93±1.09）μm2，均高于对照组的（0.62±0.21）μm2和（8.44±0.91）μm2，差异有统计学意义（t=14.998，P=0.000；t=9.486，P=0.000）。
3 讨论
3.1 SMSCs来源和特征
SMSCs来源于滑膜组织，而滑膜组织缺少血管，因此SMSCs原代培养中不会因血细胞的掺杂受到影响，并且滑膜可再生，在腔镜下也易于获取。滑膜细胞包含多种类型，主要有巨噬样细胞和成纤维样细胞，SMSCs具有成纤维样细胞形态特征[5-6]；且体外培养中，SMSCs增殖速率较其他MSCs更快[1-2]。因此，SMSCs在组织工程中的应用更具优势。
SMSCs具有和其他MSCs相似的表面抗原决定簇，迄今为止尚未发现SMSCs特有的表面抗原决定簇，但相较于BMSCs，SMSCs的CD90表达量更高。本研究发现SMSCs高表达CD147、CD90、CD105、CD44，而CD117、CD34、CD14、CD45则呈阴性表达，与文献报道一致[1]。
3.2 SMSCs体外成骨分化
正常情况下滑膜细胞不具有成骨作用，而在病理情况下，如骨关节病患者的关节滑液中，发现有焦磷酸钙矿化颗粒，且关节缘有骨赘形成[7-8]，体外培养其滑膜成纤维细胞能形成矿化结节[9]，说明滑膜细胞具有成骨分化潜能。SMSCs成骨诱导既往已有学者研究[2, 10]，本实验使用的成骨诱导液[11]，其中地塞米松参与BMSCs增殖及调控早期Ⅰ型胶原形成；β-甘油磷酸钠属于有机磷类，可被ALP水解，释放无机磷，从而促进细胞外基质矿化。本实验中SM SCs体外成骨诱导后ALP染色和茜素红染色阳性，验证了该成骨诱导液的可行性。
为了进一步从转录水平上验证这一结果，我们对成骨诱导后不同时间点SMSCs成骨相关基因的表达进行检测。OCN是成骨分化晚期的标志基因，其在诱导1～7 d上升并不明显，而14 d后上升显著，并在28d达最大值（P<0.05）；而Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2均为成骨分化早期的标志基因，尤其在1～7d上升显著（P<0.05），7 d后开始回落。ALP是骨形成必需的酶，也是评价骨形成的常见指标，细胞外基质中ALP增加会促使细胞外基质矿化，表现为大量钙盐沉积。实验中细胞在诱导后1、3 d ALP增加并不明显，5 d ALP活性开始明显增强，7 d达峰值。茜素红染色可以看出，在成骨诱导14 d开始有钙盐沉积，21 d有钙化结节形成，28 d有大量被染成红色的钙盐沉积和钙结节。提示SMSCs成骨诱导 7d，细胞外基质开始成熟；14 d进入细胞外基质矿化期，产生大量钙盐，从而实现SMSCs成骨分化。
3.3 SMSCs体内成骨
为了观察SMSCs在体内能否形成新骨，本实验使用了骨组织工程支架材料HA/CS/PLLA。HA/ CS/ PLLA具有良好的骨传导性和骨诱导性[12-13]，且植入体内后未发现排斥反应和毒性反应。由于SMSCs成骨分化与其所处环境有关，因此我们将SMSCs与HA/CS/PLLA复合培养72 h后植入大鼠下肢肌袋内。4周和8周分别行X线片观察和组织学观察，发现两组均有新骨形成，而实验组成骨量均高于对照组（P<0.05），提示SMSCs可在体内异位成骨；而4周时材料内可见大量软骨基质，对照组未见明显软骨基质，提示SMSCs可能是经软骨成骨。
骨诱导材料的异位成骨机制目前尚不明确，其可能机制为：HA/CS/PLLA周围的结缔组织和血管组织可成为MSCs和成骨祖细胞来源，在骨诱导材料适宜的微环境下可促进细胞向成骨细胞分化并形成新骨。本实验结果表明，SMSCs在体外经成骨诱导后可转化为成骨细胞；而在体内适宜的成骨信号分子和微环境作用下也可转化为成骨细胞[14-18]，HA/CS/PLLA支架材料可能为SMSCs体内成骨分化提供了适宜的微环境。HA/CS/PLLA支架材料具有多孔结构，有助于复合SMSCs以及周边MSCs、成骨细胞及血细胞，促进其在材料内黏附、增殖和分化，也有利于各种生长因子和营养物质在支架内均匀分布，增加了其“成骨微环境”的作用范围，最终诱导SM SCs 向骨前体细胞转化，在体内异位成骨。本实验SMSCs在植入大鼠体内前并未经体外成骨诱导，虽然有学者认为体外成骨诱导可提高MSCs体内成骨能力[20-21]，但体外成骨诱导会对细胞表型产生破坏，不仅增加了体外培养时间，甚至存在激发恶性肿瘤的风险[22]，给临床应用带来诸多不确定因素。
综上述，SMSCs经成骨诱导后可分化成骨，在体内亦可形成新骨，为骨组织工程种子细胞的选择提供了新参考。
骨质破坏和骨缺损是临床常见疾病，组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新方法。滑膜间充质干细胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）是目前组织工程研究热点。SMSCs易于获取，体外增殖和分化能力强，较其他来源MSCs有明显优势[1-3]。然而，SMSCs在体外诱导成骨以及在体内成骨罕见报道。本实验通过将SMSCs体外扩增、培养、成骨分化，以及将SMSCs与羟基磷灰石/壳聚糖 /聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid，HA/CS/PLLA） 复合植入大鼠体内，探索SMSCs体内、体外分化成骨的能力，以期为构建组织工程骨提供种子细胞。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
12周龄雄性SD大鼠26只，体质量200～250 g，由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。
FBS、胰蛋白酶-EDTA（HyClone公司，美国）；H-DMEM培养液（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、Ⅱ型胶原酶、HA、CS、PLLA、MTT、ALP试剂盒、茜素红染液、氯化十六烷基吡啶（Sigma公司，美国）；Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒（Takara公司，日本）。Männedorf多功能酶标仪（Tecan公司，瑞士）；紫外分光光度计（Genova Nano公司，英国）；CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；DP70倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；Image J软件（National Institutes of Health公司，美国）。
1.2 SMSCs分离培养及鉴定
1.2.1 SMSCs分离培养
取SD大鼠2只，断颈处死，75%乙醇浸泡15～20 min，打开膝关节腔取出滑膜，PBS冲洗3遍；将滑膜周围脂肪组织和部分结缔组织剥离干净，眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1mm×1 mm大小碎块，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃、200 r/min震荡消化3 h；消化后过200目滤网，以离心半径5 cm、1 000 r/min离心5 min，弃沉淀重悬，接入培养瓶培养，置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱内。24 h后可见细胞贴壁生长，每3天换液1次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞行Giemsa染色，倒置荧光显微镜下观察。
1.2.2 流式细胞仪鉴定
根据文献[1]方法，采用流式细胞仪对第3代SMSCs表面标记物CD147、CD90、CD105、CD44、CD117、CD34、CD14、CD45进行检测。
1.2.3 MTT法绘制细胞曲线
取第1、2、3代SM SCs，制备浓度为1.5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱内，每孔加入5 g/L MTT 100 μL，细胞培养箱中孵育4 h，弃培养液，将培养板晾干后每孔加入DMSO 100 μL。培养后1～6d于酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度（A）值。
1.2.4 成脂诱导鉴定
取第3代SMSCs，以成脂诱导培养基（含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10μg/ mL胰岛素、1 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM 培养基）培养14 d，PBS洗净，行油红O染色观察。
1.2.5 成骨诱导鉴定
取第3代SMSCs，以成骨诱导培养基（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、100 mmol/L地塞米松的DMEM培养基）培养7 d行ALP染色鉴定，21 d行茜素红染色鉴定。
1.3 SMSCs体外成骨培养观测
1.3.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
取第3代SMSCs按1.2.3方法成骨诱导1、7、14、21、28 d，取贴壁细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，以总RNA为模板，参照PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒说明书，25μL作为逆转录反应体积进行PCR检测。各引物序列见表 1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法检测成骨相关基因骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 mRNA相对表达量，以β-actin作为内参。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.3.2 ELISA法检测ALP活性
取第3代SMSCs，以1.0×105个/孔接种于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培养基进行培养，待细胞达100%融合时，于其中6孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余6 孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。分别于成骨诱导后1、3、5、7、9、11 d，PBS漂洗2次，加入1mL PBS溶液，4℃超声裂解细胞，采用ELISA试剂盒和BCA试剂盒分析细胞裂解液中ALP和总蛋白（to talprotein，TP）含量，各组ALP活性以ALP/TP表示。
1.3.3 茜素红S法检测钙盐沉积
取第3代SMSCs，以1.0×105个/孔接种于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培养基进行培养，待细胞达100%融合时，于其中4孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余4孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。成骨诱导7、14、21、28 d，弃培养液，70%乙醇固定30 min，PBS清洗5遍。0.5%茜素红染液室温浸染30 min后，去除多余染料，PBS清洗3遍，倒置荧光显微镜下观察。加入氯化十六烷基室温下浸润30min，吸弃上清液，于分光光度计562 nm波长处测量A值，作为钙含量。
1.4 SMSCs体内成骨培养观测
1.4.1 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察
HA/CS/PLLA 支架材料由中国科技大学微尺度实验室提供，制备方法参照文献[4]。将HA/CS/PLLA支架材料PBS冲洗后，3%戊二醛固定3 h，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯溶液中浸泡20 min，临界点干燥、喷金，扫描电镜观察。
1.4.2 细胞-支架复合物制备
将环氧乙烷消毒后的HA/CS/PLLA材料置入培养皿中，取第3代SMSCs调整成浓度为1.0×106个/mL的细胞悬液，接种于支架材料上，每个材料接种10 μL，置于37℃、5%CO2及饱和湿度恒温培养箱中培养3 h，然后缓慢加入含10%FBS的H-DMEM培养基，复合培养72h，备用。
1.4.3 实验分组及方法
取SD大鼠24只，随机分为实验组和对照组（n=12）。3%戊巴比妥钠（30mg/ kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下切开右下肢皮肤，钝性分离肌肉，实验组于肌袋内植入复合培养72h的细胞-支架复合物，对照组仅植入支架材料。缝合切口，分笼饲养。
1.4.4 观测指标
①大体观察：术后观察大鼠活动、切口愈合及进食情况。②X线片观察：术后4、8周，两组分别取6只动物处死，于右下肢行X线片检查，采用Image J软件计算相对灰度值。③组织学观察：术后4、8周，取出两组植入物，去除材料周围脂肪及纤维组织，PBS冲洗；标本于10%多聚甲醛固定72h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋切片，片厚5 μm，每个标本取3张切片，常规行HE染色，光镜下观察。高倍镜下随机测定每张切片3个非重复视野内新骨面积，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMSCs分离培养及鉴定
2.1.1 形态学观察
分离的原代细胞24 h后贴壁，呈不规则形状生长（图 1a）。第2代SMSCs形态混杂，主要以梭形、长梭形为主，可见少量圆形巨噬样细胞（图 1b）。第3代SMSCs铺满瓶底，呈长梭形，主要为滑膜成纤维样细胞（图 1c）。第3代细胞Giemsa染色示细胞为长梭形成纤维样细胞（图 2）。
图1
SMSCs形态学观察 ⓐ 原代细胞（倒置相差显微镜×10） ⓑ 第2代细胞（倒置相差显微镜×20） ⓒ 第3代细胞（倒置相差显微镜 ×20） 图 2 第3代SMSCs Giemsa染色观察（倒置荧光显微镜×20） 图 3 MTT法检测第1～3代细胞增殖曲线 图 4 SMSCs多向分化鉴定（倒置荧光显微镜×20） ⓐ 成脂诱导14 d油红O染色 ⓑ 成骨诱导7 d ALP染色 ⓒ 成骨诱导28 d茜素红染色 图 5 实时荧光定量PCR检测SMSCs体外成骨培养各时间点目的基因表达
Figure1.
Morphological observation of SMSCs ⓐ Primary SMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ⓑ The 2rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) ⓒ The 3rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) Fig. 2 Giemsa staining observation of the 3rd passage SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) Fig. 3 The proliferation curve of passages 1-3 SMSCs by MTT method Fig. 4 Identification of multiple differentiation potential of SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) ⓐ Oil red O staining of SMSCs after adipogenic induction for 14 days ⓑ ALP staining of SMSCs after osteogenic induction for 7 days ⓒ Alirazin red staining of SMSCs after osteogenic induction for 28days Fig. 5 Relative expressions of osteogenic related genes at different time points by real-time fluorescent quantitative PCR
2.1.2 流式细胞仪鉴定
第3代SMSCs流式细胞仪检测结果示，CD147、CD90、CD105、CD44呈阳性表达，表达率分别为98.92%±0.21%、96.41%±0.18%、99.56%±0.17%、95.45%±0.29%；而CD117、CD34、CD14、
CD45呈阴性表达，表达率分别为4.53%± 1.23%、3.85%±1.07%、7.36%±2.34%、4.41%±1.21%。
2.1.3 MTT法检测细胞增殖率
随着培养时间延长，第1～3代细胞A值均逐渐增高；第2、3代细胞呈S形增殖曲线，1、2 d为平台期，3～5 d为对数生长期，6 d后细胞密度较大，细胞间接触抑制生长，进入平台期。见图 3。
2.1.4 成脂、成骨诱导鉴定
SMSCs成脂诱导14d，油红O染色可见红染的块状脂滴（图 4 a）；成骨诱导7 d，ALP染色可见细胞质咖啡样深染（图 4 b）；成骨诱导28 d，茜素红染色可见红色钙化灶（图 4 c）。
2.2 SMSCs体外成骨培养观测
2.2.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
成骨分化晚期标志基因OCN在培养7 d上升不明显；与1、7 d比较，OCN在14 d后上升显著，28 d达峰值，差异有统计学意义（P<0.05）。与培养1d相比，成骨分化早期标志基因Ⅰ型胶原在培养7d上升显著，差异有统计学意义（P<0.05）；14、21、28 d与1d相比无明显上调（P>0.05）。而成骨标志基因ALP、Runx-2在培养7～28 d均明显上调，与1d时比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
2.2.2 ALP活性测定
成骨诱导组诱导1、3 d，ALP活性均增加不明显，5 d ALP活性明显增强，7 d时达峰值，9、11 d ALP活性逐渐降低；5～11d ALP活性均显著高于1、3 d，差异有统计学意义（P<0.05），且5～11 d各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。诱导后5、7、9、11 d成骨诱导组ALP活性均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
成骨诱导后各时间点成骨诱导组及对照组ALP活性比较（n=6，2.2.3 茜素红钙含量测定
SMSCs成骨诱导7 d时茜素红染色未见钙基质，14 d开始出现钙沉积，21 d可见钙化结节，28 d可见大量钙化结节和钙沉积；对照组各时间点均未见红染的钙化灶。见图 6。成骨诱导组诱导培养14、21、28 d，钙含量显著高于7d时，也均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
图2
成骨诱导组及对照组诱导培养后各时间点茜素红染色观察（倒置荧光显微镜×20） ⓐ 成骨诱导组7 d ⓑ 成骨诱导组14 d ⓒ 成骨诱导组21 d ⓓ 成骨诱导组28 d ⓔ 对照组28 d 图 7 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察 ⓐ ×1 000 ⓑ ×10 k 图 8 实验组及对照组术后各时间点X线片观察 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 对照组4周 ⓓ 对照组8周 图 9 实验组及对照组术后各时间点组织学观察（HE×10） ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 对照组4周 ⓓ 对照组8周
Figure2.
Alirazin red staining observation of SMSC-induced group and control group at different time points after osteogenic induction (Inverted fluorescent microscope×20) ⓐ SMSC-induced group at 7 days ⓑ SMSC-induced group at 14 days ⓒ SMSC-induced group at 21 days ⓓ SMSC-induced group at 28 days ⓔ Control group at 28 days Fig. 7 Scanning electron microscope observation of HA/CS/PLLA ⓐ ×1 000 ⓑ ×10k Fig. 8 X-ray films observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Control group at 4 weeks ⓓ Control group at 8 weeks Fig. 9 Histological observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation (HE×10) ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Control group at 4 weeks ⓓ Control group at 8 weeks
表3
诱导后各时间点成骨诱导组及对照组钙含量比较（n=6，2.3 SMSCs体内成骨培养观测
2.3.1 HA/CS/PLLA支架材料扫描电镜观察
扫描电镜观察示，材料表面分布着大小不等的孔隙，内部为三维网状结构（图 7），为细胞附着、生长以及营养物质运输提供了有利场所。
2.3.2 大体观察
24只大鼠全部存活，术后切口均Ⅰ 期愈合，无炎性反应发生；实验期间动物进食正常。
2.3.3 X线片检测
术后4、8周，实验组与对照组均有高密度影，其中实验组骨密度高于对照组（图 8）。4、8周实验组相对灰度值分别为12.61±1.44和29.73±1.67，均分别高于对照组的4.85±0.84和13.23±0.92，差异有统计学意义（t=13.964，P=0.000；t=25.962，P=0.000）。
2.3.3 组织学观察
术后4周，对照组可见大量成骨细胞及少量未成熟的骨基质，支架材料未完全降解；实验组可见大量成骨细胞及未成熟的骨基质，还有较多软骨基质形成，支架材料完全降解。术后8 周，对照组可见少量新骨形成，支架材料完全降解，并可见大量未成熟的骨基质；实验组可见大量新骨，并有少量未成熟的骨基质，纤维结缔组织长入其中。见图 9。
图像分析显示，术后4、8周实验组新骨面积分别为（2.41±0.29）μm2和（12.93±1.09）μm2，均高于对照组的（0.62±0.21）μm2和（8.44±0.91）μm2，差异有统计学意义（t=14.998，P=0.000；t=9.486，P=0.000）。
3 讨论
3.1 SMSCs来源和特征
SMSCs来源于滑膜组织，而滑膜组织缺少血管，因此SMSCs原代培养中不会因血细胞的掺杂受到影响，并且滑膜可再生，在腔镜下也易于获取。滑膜细胞包含多种类型，主要有巨噬样细胞和成纤维样细胞，SMSCs具有成纤维样细胞形态特征[5-6]；且体外培养中，SMSCs增殖速率较其他MSCs更快[1-2]。因此，SMSCs在组织工程中的应用更具优势。
SMSCs具有和其他MSCs相似的表面抗原决定簇，迄今为止尚未发现SMSCs特有的表面抗原决定簇，但相较于BMSCs，SMSCs的CD90表达量更高。本研究发现SMSCs高表达CD147、CD90、CD105、CD44，而CD117、CD34、CD14、CD45则呈阴性表达，与文献报道一致[1]。
3.2 SMSCs体外成骨分化
正常情况下滑膜细胞不具有成骨作用，而在病理情况下，如骨关节病患者的关节滑液中，发现有焦磷酸钙矿化颗粒，且关节缘有骨赘形成[7-8]，体外培养其滑膜成纤维细胞能形成矿化结节[9]，说明滑膜细胞具有成骨分化潜能。SMSCs成骨诱导既往已有学者研究[2, 10]，本实验使用的成骨诱导液[11]，其中地塞米松参与BMSCs增殖及调控早期Ⅰ型胶原形成；β-甘油磷酸钠属于有机磷类，可被ALP水解，释放无机磷，从而促进细胞外基质矿化。本实验中SM SCs体外成骨诱导后ALP染色和茜素红染色阳性，验证了该成骨诱导液的可行性。
为了进一步从转录水平上验证这一结果，我们对成骨诱导后不同时间点SMSCs成骨相关基因的表达进行检测。OCN是成骨分化晚期的标志基因，其在诱导1～7 d上升并不明显，而14 d后上升显著，并在28d达最大值（P<0.05）；而Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2均为成骨分化早期的标志基因，尤其在1～7d上升显著（P<0.05），7 d后开始回落。ALP是骨形成必需的酶，也是评价骨形成的常见指标，细胞外基质中ALP增加会促使细胞外基质矿化，表现为大量钙盐沉积。实验中细胞在诱导后1、3 d ALP增加并不明显，5 d ALP活性开始明显增强，7 d达峰值。茜素红染色可以看出，在成骨诱导14 d开始有钙盐沉积，21 d有钙化结节形成，28 d有大量被染成红色的钙盐沉积和钙结节。提示SMSCs成骨诱导 7d，细胞外基质开始成熟；14 d进入细胞外基质矿化期，产生大量钙盐，从而实现SMSCs成骨分化。
3.3 SMSCs体内成骨
为了观察SMSCs在体内能否形成新骨，本实验使用了骨组织工程支架材料HA/CS/PLLA。HA/ CS/ PLLA具有良好的骨传导性和骨诱导性[12-13]，且植入体内后未发现排斥反应和毒性反应。由于SMSCs成骨分化与其所处环境有关，因此我们将SMSCs与HA/CS/PLLA复合培养72 h后植入大鼠下肢肌袋内。4周和8周分别行X线片观察和组织学观察，发现两组均有新骨形成，而实验组成骨量均高于对照组（P<0.05），提示SMSCs可在体内异位成骨；而4周时材料内可见大量软骨基质，对照组未见明显软骨基质，提示SMSCs可能是经软骨成骨。
骨诱导材料的异位成骨机制目前尚不明确，其可能机制为：HA/CS/PLLA周围的结缔组织和血管组织可成为MSCs和成骨祖细胞来源，在骨诱导材料适宜的微环境下可促进细胞向成骨细胞分化并形成新骨。本实验结果表明，SMSCs在体外经成骨诱导后可转化为成骨细胞；而在体内适宜的成骨信号分子和微环境作用下也可转化为成骨细胞[14-18]，HA/CS/PLLA支架材料可能为SMSCs体内成骨分化提供了适宜的微环境。HA/CS/PLLA支架材料具有多孔结构，有助于复合SMSCs以及周边MSCs、成骨细胞及血细胞，促进其在材料内黏附、增殖和分化，也有利于各种生长因子和营养物质在支架内均匀分布，增加了其“成骨微环境”的作用范围，最终诱导SM SCs 向骨前体细胞转化，在体内异位成骨。本实验SMSCs在植入大鼠体内前并未经体外成骨诱导，虽然有学者认为体外成骨诱导可提高MSCs体内成骨能力[20-21]，但体外成骨诱导会对细胞表型产生破坏，不仅增加了体外培养时间，甚至存在激发恶性肿瘤的风险[22]，给临床应用带来诸多不确定因素。
综上述，SMSCs经成骨诱导后可分化成骨，在体内亦可形成新骨，为骨组织工程种子细胞的选择提供了新参考。
