引用本文： 李鹏飞, 贾楠, 沈亚欣, 靳宪辉, 申勇, 丁文元, 张为. 纤维环切口方式对椎间盘生物力学强度影响的动物实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(2): 202-207. doi: 10.7507/1002-1892.20160041 复制
目前，髓核摘除术为治疗腰椎间盘突出症的主要手术方法[1]。因其操作简便、创伤小、安全性高，在临床广泛开展[2]。但由于摘除髓核同时需部分切除纤维环，破坏了椎间盘的完整性，对椎间盘术后生物力学强度的维持及纤维环的修复产生负面影响[3]，造成椎间盘退变加速、椎间隙高度丢失、椎间盘源性下腰痛出现，甚至椎间盘再次突出而需翻修治疗[4]。目前，有关纤维环切口方式对髓核摘除术后椎间盘生物力学强度的影响尚存在争议。本研究通过动物实验，旨在探索合适的纤维环切口方式，指导临床工作。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器
健康成年山羊30只，雌雄各半，体质量18～22 kg，由河北医科大学动物实验中心提供；动物实验过程及处置方法严格遵守动物伦理学要求。游标卡尺（精确度0.1 mm；Hexagon公司，瑞士）；MRI（Siemens公司，德国）；GENERAA710多功能监测仪（GENERAL公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
根据处理方法不同，将30只山羊随机分为A、B、C 3组，每组10只。手术均由同一术者完成。术前常规禁食、禁水24 h，臀部肌肉注射速眠新（0.1 mg/ kg）麻醉。作左侧腰背部斜形切口，逐层切开皮肤、皮下及筋膜，于腰背肌外缘进入后钝性分离腰大肌、髂腰肌间隙。逐层显露至后腹膜，暴露L3、4及L4、5椎间盘，将游标卡尺垂直上、下终板分别测量不同位置L3、4及L4、5椎间隙高度3次，取L3、4及L4、5椎间隙高度均值，作为标本椎间隙高度。
椎间盘处理方法：A组，暴露椎间盘纤维环，将导丝穿入纤维环后，使用自主设计的二级多孔套筒，以上级套筒逐步扩大通道，直至扩大至直径5 mm工作套筒后，使用配套的微创咬钳摘除部分髓核组织。B组，用尖刀作直径为5 mm的圆形切口，切开纤维环，以髓核钳摘除部分髓核。C组，用尖刀作大小为 5 mm×5 mm的方形切口，切开纤维环，摘除部分髓核。逐层缝合切口，无菌敷料包扎。术后定期换药，5 d内每天肌肉注射青霉素320万U，预防感染。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
记录3组山羊体质量、雌雄比例、年龄、术中出血量以及切口愈合时间；术后观察各组山羊存活及切口愈合情况，12～14 d后视切口愈合情况拆线。
1.3.2 MRI检查
术后24周，各组山羊以静脉注射空气栓塞处死，即刻行腰椎MRI检查。在T2加权像上，根据改良Thompson分级法[5]对椎间盘退变程度进行分级：Ⅰ级，正常；Ⅱ级，椎间隙信号强度轻度减弱，并且高信号区域缩小；Ⅲ级，椎间隙信号强度中度减弱；Ⅳ级，椎间隙信号强度重度减弱。
1.3.3 椎间隙高度测量
MRI检查后，解剖并显露L3、4及L4、5椎间盘，同1.2方法测量椎间隙高度，计算手术前后椎间隙高度差值，作为椎间隙高度丢失程度。
1.3.4 生物力学测试
椎间隙高度测量后，应用GENERAA710多功能监测仪对L3、4椎间盘进行有创椎间盘测压，测定诱发椎间盘突出的压力值以及椎间盘承受的最大压力值（以纤维环出现明显撕裂损伤为临界情况）。
1.3.5 组织学观察
完整取出L4、5椎体及椎间盘，大体观察椎间盘纤维环连续性及结构完整性后，置于甲醛浸泡固定；完整分离椎间盘，甲酸脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋，切片。分别行HE及Masson染色，镜下观察纤维环连续性及结构完整性。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；计数资料组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
3组山羊体质量、雌雄比例、年龄、术中出血量、切口愈合时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表 1。3组山羊均存活至实验完成，切口顺利愈合后拆线。
表1
3组山羊一般资料比较（n=10）
Table1.
Comparison of general data among 3 groups（n=10）
2.2 MRI检查
术后24周，腰椎MRI显示3组椎间盘均出现退变现象，信号强度降低。T2加权像显示，A组纤维环连续性好，外层无明显瘢痕组织形成，椎间盘内部信号强度较其余2组高且均匀；B、C组纤维环瘢痕组织形成明显，纤维连接连续性差，椎间盘内部信号强度低。见图 1。根据改良Thompson分级法，A组Ⅱ级16个、Ⅲ级2个、Ⅳ级2个，B组Ⅱ级6个、Ⅲ级10个、Ⅳ级4个，C组Ⅱ级8个、Ⅲ级8个、Ⅳ级4 个。A组椎间盘退变程度高于B、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图1
术后24周各组MRI矢状位及水平位观察 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组
Figure1.
Sagittal and horizontal MRI in each group at 24 weeks after operation ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
2.3 椎间隙高度测量
3组术前椎间隙高度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。术后24周，A组椎间隙高度大于B、C组，其丢失程度小于B、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各组手术前后椎间隙高度及丢失程度比较（n=10，mm，2.4 生物力学测试
A、B、C组诱发椎间盘突出的压力值分别为（3.04±0.52）、（1.91±0.43）、（1.89±0.45）MPa，椎间盘承受的最大压力值分别为（3.81±0.61）、（2.25±0.50）、（2.18±0.47）MPa。A组均显著大于B、C组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 组织学观察
大体观察见A组为完整纤维环结构，B、C组切开处可见纤维环连续性破坏。见图 2。HE及Masson染色示：A组纤维环连续性良好，层次较清晰；B、C组切开处可见纤维环连续性破坏，瘢痕组织填充明显。见图 3、4。
图2
术后24周各组椎间盘大体观察箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 图 3 术后24周各组椎间盘HE染色观察（×1） 箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 图 4 术后24周各组椎间盘Masson染色观察（×1） 箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组
Figure2.
Gross observation of inter vertebral discs at 24 weeks after operation Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C Fig. 3 HE staining of intervertebral discs at 24 weeks after operation (×1) Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C Fig. 4 Masson staining of intervertebral discs at 24 weeks after operation (×1) Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
3 讨论
腰椎间盘突出症治疗多采用髓核摘除术[6]，纤维环不同切口方式对其术后生物力学强度维持及纤维环修复的影响存在争议[7]。术后椎间盘突出症复发与切口方式相关[8]，因此合理的纤维环切口方式选择具有重要意义。本研究对目前临床常用的3种纤维环切开方法进行比较研究。
纤维环破坏后椎间盘会发生明显退变，生物力学结构发生变化，椎间隙高度丢失，使功能强度不能恢复至原来状态。而传统圆形及方形切口对纤维环连续性破坏更为明显，椎间盘内部信号低且不均匀，椎间隙高度丢失程度更大[9]。由于人类为双足站立，脊柱负重大，所以以上改变在人体上表现更明显[10- 11]。同时，椎间盘内除瘢痕组织，亦可见炎性细胞和血管增生[12]，我们认为这是椎间盘组织损伤后的修复表现。本研究中，A组椎间盘纤维环连续性相对良好，外层无严重瘢痕组织形成，椎间盘内部信号强度较B、C组高且均匀。提示与传统纤维环切开相比，应用工作通道进行穿刺对纤维环结构破坏小，未大量切除原有纤维组织，而新生纤维组织可部分填充纤维环穿刺口，且瘢痕组织增生反应小，椎间盘纤维环连续性相对较好。生物力学检测结果亦表明A组椎间盘内部承压强度明显高于B、C组。
纤维环的修复过程开始于损伤后血液渗出、炎性细胞浸润和毛细血管增生，此反应普遍出现在机体组织遭受创伤后[13]。但之后炎性反应逐渐消除，炎性细胞逐渐消失伴随纤维细胞出现，并进行纤维连接[14]。外层纤维环最早进行修复，纤维细胞从切口处边缘逐渐向心性生长连接[15]。内层修复开始较晚，亦是逐渐发生。其连接修复同样为纤维细胞向心性生长及连接[16]。位于切口下方的少量髓核细胞分泌出胶原蛋白，使胶原纤维变得致密[17]。但是纤维环损伤较大时，自我修复能力有限[18]。特别是圆形及方形切口，由于切除了部分纤维环，致使纤维不能连接，缺损无法修复[19]。同时，纤维环破坏后会首先修复外部薄层纤维组织[20]。若纤维环缺损较大，切口两侧纤维不能生长至互相连接，中间部分仅依靠瘢痕组织填充[21]，不能满足纤维组织所需张力。而穿刺技术未对纤维环进行切除，破坏较小，穿刺口纤维环在修复过程中可逐渐闭合并进行纤维连接愈合。结合本研究MRI及组织学观察进行分析，我们认为纤维环外层的连接亦为其内层修复创造了条件，纤维环各层重新修复才可维持椎间盘的生物力学强度。与之相反，瘢痕填充修复使椎间盘整体存在薄弱处，在压力骤增时可出现纤维撕裂，亦是复发原因之一。提示纤维蛋白封闭、纤维环缝合等辅助修复技术的必要性，但需要进一步实验研究证明。
目前有关椎间盘不同切口方式动物模型研究中多应用新西兰白兔[22]。本研究选择山羊作为研究对象具有以下优点：①椎间盘体积相对较大，能够摘取部分髓核；②手术入路明确，显露清晰，便于准确操作；③椎间盘内髓核结构清晰有利于MRI检查[23]；④山羊生命力强，耐受性较好，分笼饲养病死率相对低[19]。但购买及饲养费用相对较高是其缺点。考虑检查时动物微动会对MRI成像的清晰度及T2加权像信号强度测量产生较大影响，我们预实验结果显示，纤维环强度主要由物理学构造决定，动物在检查前数分钟内致死所产生的细胞死亡、代谢停滞、髓核脱水等病理生理变化对纤维环的物理学强度影响甚小，基本可以忽略，因此本研究选择将实验动物处死后进行MRI检查。
综上述，采用工作套筒进行椎间盘髓核摘除手术可有效减小对纤维环结构的破坏，对维持椎间盘生物力学强度及术后纤维环修复起到积极作用，但纤维环修复机制还需要进行进一步的动物实验、组织学及细胞学研究。
目前，髓核摘除术为治疗腰椎间盘突出症的主要手术方法[1]。因其操作简便、创伤小、安全性高，在临床广泛开展[2]。但由于摘除髓核同时需部分切除纤维环，破坏了椎间盘的完整性，对椎间盘术后生物力学强度的维持及纤维环的修复产生负面影响[3]，造成椎间盘退变加速、椎间隙高度丢失、椎间盘源性下腰痛出现，甚至椎间盘再次突出而需翻修治疗[4]。目前，有关纤维环切口方式对髓核摘除术后椎间盘生物力学强度的影响尚存在争议。本研究通过动物实验，旨在探索合适的纤维环切口方式，指导临床工作。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器
健康成年山羊30只，雌雄各半，体质量18～22 kg，由河北医科大学动物实验中心提供；动物实验过程及处置方法严格遵守动物伦理学要求。游标卡尺（精确度0.1 mm；Hexagon公司，瑞士）；MRI（Siemens公司，德国）；GENERAA710多功能监测仪（GENERAL公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
根据处理方法不同，将30只山羊随机分为A、B、C 3组，每组10只。手术均由同一术者完成。术前常规禁食、禁水24 h，臀部肌肉注射速眠新（0.1 mg/ kg）麻醉。作左侧腰背部斜形切口，逐层切开皮肤、皮下及筋膜，于腰背肌外缘进入后钝性分离腰大肌、髂腰肌间隙。逐层显露至后腹膜，暴露L3、4及L4、5椎间盘，将游标卡尺垂直上、下终板分别测量不同位置L3、4及L4、5椎间隙高度3次，取L3、4及L4、5椎间隙高度均值，作为标本椎间隙高度。
椎间盘处理方法：A组，暴露椎间盘纤维环，将导丝穿入纤维环后，使用自主设计的二级多孔套筒，以上级套筒逐步扩大通道，直至扩大至直径5 mm工作套筒后，使用配套的微创咬钳摘除部分髓核组织。B组，用尖刀作直径为5 mm的圆形切口，切开纤维环，以髓核钳摘除部分髓核。C组，用尖刀作大小为 5 mm×5 mm的方形切口，切开纤维环，摘除部分髓核。逐层缝合切口，无菌敷料包扎。术后定期换药，5 d内每天肌肉注射青霉素320万U，预防感染。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
记录3组山羊体质量、雌雄比例、年龄、术中出血量以及切口愈合时间；术后观察各组山羊存活及切口愈合情况，12～14 d后视切口愈合情况拆线。
1.3.2 MRI检查
术后24周，各组山羊以静脉注射空气栓塞处死，即刻行腰椎MRI检查。在T2加权像上，根据改良Thompson分级法[5]对椎间盘退变程度进行分级：Ⅰ级，正常；Ⅱ级，椎间隙信号强度轻度减弱，并且高信号区域缩小；Ⅲ级，椎间隙信号强度中度减弱；Ⅳ级，椎间隙信号强度重度减弱。
1.3.3 椎间隙高度测量
MRI检查后，解剖并显露L3、4及L4、5椎间盘，同1.2方法测量椎间隙高度，计算手术前后椎间隙高度差值，作为椎间隙高度丢失程度。
1.3.4 生物力学测试
椎间隙高度测量后，应用GENERAA710多功能监测仪对L3、4椎间盘进行有创椎间盘测压，测定诱发椎间盘突出的压力值以及椎间盘承受的最大压力值（以纤维环出现明显撕裂损伤为临界情况）。
1.3.5 组织学观察
完整取出L4、5椎体及椎间盘，大体观察椎间盘纤维环连续性及结构完整性后，置于甲醛浸泡固定；完整分离椎间盘，甲酸脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋，切片。分别行HE及Masson染色，镜下观察纤维环连续性及结构完整性。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；计数资料组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
3组山羊体质量、雌雄比例、年龄、术中出血量、切口愈合时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表 1。3组山羊均存活至实验完成，切口顺利愈合后拆线。
表1
3组山羊一般资料比较（n=10）
Table1.
Comparison of general data among 3 groups（n=10）
2.2 MRI检查
术后24周，腰椎MRI显示3组椎间盘均出现退变现象，信号强度降低。T2加权像显示，A组纤维环连续性好，外层无明显瘢痕组织形成，椎间盘内部信号强度较其余2组高且均匀；B、C组纤维环瘢痕组织形成明显，纤维连接连续性差，椎间盘内部信号强度低。见图 1。根据改良Thompson分级法，A组Ⅱ级16个、Ⅲ级2个、Ⅳ级2个，B组Ⅱ级6个、Ⅲ级10个、Ⅳ级4个，C组Ⅱ级8个、Ⅲ级8个、Ⅳ级4 个。A组椎间盘退变程度高于B、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图1
术后24周各组MRI矢状位及水平位观察 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组
Figure1.
Sagittal and horizontal MRI in each group at 24 weeks after operation ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
2.3 椎间隙高度测量
3组术前椎间隙高度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。术后24周，A组椎间隙高度大于B、C组，其丢失程度小于B、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各组手术前后椎间隙高度及丢失程度比较（n=10，mm，2.4 生物力学测试
A、B、C组诱发椎间盘突出的压力值分别为（3.04±0.52）、（1.91±0.43）、（1.89±0.45）MPa，椎间盘承受的最大压力值分别为（3.81±0.61）、（2.25±0.50）、（2.18±0.47）MPa。A组均显著大于B、C组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 组织学观察
大体观察见A组为完整纤维环结构，B、C组切开处可见纤维环连续性破坏。见图 2。HE及Masson染色示：A组纤维环连续性良好，层次较清晰；B、C组切开处可见纤维环连续性破坏，瘢痕组织填充明显。见图 3、4。
图2
术后24周各组椎间盘大体观察箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 图 3 术后24周各组椎间盘HE染色观察（×1） 箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 图 4 术后24周各组椎间盘Masson染色观察（×1） 箭头示瘢痕组织填充纤维环缺损 ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组
Figure2.
Gross observation of inter vertebral discs at 24 weeks after operation Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C Fig. 3 HE staining of intervertebral discs at 24 weeks after operation (×1) Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C Fig. 4 Masson staining of intervertebral discs at 24 weeks after operation (×1) Arrow indicated the defect of fiber ring was filled with scar tissue ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
3 讨论
腰椎间盘突出症治疗多采用髓核摘除术[6]，纤维环不同切口方式对其术后生物力学强度维持及纤维环修复的影响存在争议[7]。术后椎间盘突出症复发与切口方式相关[8]，因此合理的纤维环切口方式选择具有重要意义。本研究对目前临床常用的3种纤维环切开方法进行比较研究。
纤维环破坏后椎间盘会发生明显退变，生物力学结构发生变化，椎间隙高度丢失，使功能强度不能恢复至原来状态。而传统圆形及方形切口对纤维环连续性破坏更为明显，椎间盘内部信号低且不均匀，椎间隙高度丢失程度更大[9]。由于人类为双足站立，脊柱负重大，所以以上改变在人体上表现更明显[10- 11]。同时，椎间盘内除瘢痕组织，亦可见炎性细胞和血管增生[12]，我们认为这是椎间盘组织损伤后的修复表现。本研究中，A组椎间盘纤维环连续性相对良好，外层无严重瘢痕组织形成，椎间盘内部信号强度较B、C组高且均匀。提示与传统纤维环切开相比，应用工作通道进行穿刺对纤维环结构破坏小，未大量切除原有纤维组织，而新生纤维组织可部分填充纤维环穿刺口，且瘢痕组织增生反应小，椎间盘纤维环连续性相对较好。生物力学检测结果亦表明A组椎间盘内部承压强度明显高于B、C组。
纤维环的修复过程开始于损伤后血液渗出、炎性细胞浸润和毛细血管增生，此反应普遍出现在机体组织遭受创伤后[13]。但之后炎性反应逐渐消除，炎性细胞逐渐消失伴随纤维细胞出现，并进行纤维连接[14]。外层纤维环最早进行修复，纤维细胞从切口处边缘逐渐向心性生长连接[15]。内层修复开始较晚，亦是逐渐发生。其连接修复同样为纤维细胞向心性生长及连接[16]。位于切口下方的少量髓核细胞分泌出胶原蛋白，使胶原纤维变得致密[17]。但是纤维环损伤较大时，自我修复能力有限[18]。特别是圆形及方形切口，由于切除了部分纤维环，致使纤维不能连接，缺损无法修复[19]。同时，纤维环破坏后会首先修复外部薄层纤维组织[20]。若纤维环缺损较大，切口两侧纤维不能生长至互相连接，中间部分仅依靠瘢痕组织填充[21]，不能满足纤维组织所需张力。而穿刺技术未对纤维环进行切除，破坏较小，穿刺口纤维环在修复过程中可逐渐闭合并进行纤维连接愈合。结合本研究MRI及组织学观察进行分析，我们认为纤维环外层的连接亦为其内层修复创造了条件，纤维环各层重新修复才可维持椎间盘的生物力学强度。与之相反，瘢痕填充修复使椎间盘整体存在薄弱处，在压力骤增时可出现纤维撕裂，亦是复发原因之一。提示纤维蛋白封闭、纤维环缝合等辅助修复技术的必要性，但需要进一步实验研究证明。
目前有关椎间盘不同切口方式动物模型研究中多应用新西兰白兔[22]。本研究选择山羊作为研究对象具有以下优点：①椎间盘体积相对较大，能够摘取部分髓核；②手术入路明确，显露清晰，便于准确操作；③椎间盘内髓核结构清晰有利于MRI检查[23]；④山羊生命力强，耐受性较好，分笼饲养病死率相对低[19]。但购买及饲养费用相对较高是其缺点。考虑检查时动物微动会对MRI成像的清晰度及T2加权像信号强度测量产生较大影响，我们预实验结果显示，纤维环强度主要由物理学构造决定，动物在检查前数分钟内致死所产生的细胞死亡、代谢停滞、髓核脱水等病理生理变化对纤维环的物理学强度影响甚小，基本可以忽略，因此本研究选择将实验动物处死后进行MRI检查。
综上述，采用工作套筒进行椎间盘髓核摘除手术可有效减小对纤维环结构的破坏，对维持椎间盘生物力学强度及术后纤维环修复起到积极作用，但纤维环修复机制还需要进行进一步的动物实验、组织学及细胞学研究。
