引用本文： 陈甫寰, 岳晓彤, 宋慧锋, 柴家科, 何秀叶, 王统民, 刘玲英. 表皮干细胞向汗腺细胞分化的表型改变及其通路机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(2): 245-250. doi: 10.7507/1002-1892.20160049 复制
大面积深度烧伤创面愈合后汗腺缺失导致的体温调节障碍，是亟待解决的严重影响患者生存质量的问题。近年来干细胞与再生医学领域研究的飞速发展，使得汗腺重建成为可能[1-2]。表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）作为皮肤的特异性干细胞，具有包括向汗腺细胞（sweat gland cells，SGCs）、成纤维细胞及毛囊干细胞等多向分化的潜能[3]。并且有研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路在汗腺的发生和发育过程中起着重要作用[4-5]。本研究在既往研究基础上，诱导成人皮肤ESCs向SGCs分化，探讨分化过程中ESCs表型的改变，并对MAPK/ERK通路的变化情况进行初步研究，为创面的功能性愈合提供新的思路和实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验标本及主要试剂、仪器
健康成人包皮和全层皮肤取自解放军总医院第一附属医院行包皮环切和全厚皮肤移植的患者，均取得医院伦理委员会批准和患者知情同意。
DMEM/F12基础培养基、FBS、胰蛋白酶-EDTA、无血清细胞培养基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、EGF、中性蛋白酶（GIBCO公司，美国）；PBS、青霉素/链霉素/两性霉素B三抗（PAA公司，美国）；Ⅳ型胶原、Ⅱ型胶原酶、PD98059（Sigma公司、美国）；β1整合素受体单克隆抗体、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）受体单克隆抗体、CK7受体单克隆抗体、CK18受体单克隆抗体、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）受体单克隆抗体（Abcam公司，英国）；RIPA裂解液（谷歌生物科技有限公司）。倒置相差显微镜、荧光显微镜（Leica公司，德国）；离心机（Kubota公司，日本）；流式检测仪（BD Facsverse公司，美国）；Image Pro-plus6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；生物净化工作台（北京伟达净化研究所）。
1.2 ESCs及SGCs的体外分离培养及鉴定
1.2.1 ESCs分离培养及鉴定
取健康成人包皮去除皮下组织，修剪成1 cm×1 cm大小的皮片，中性蛋白酶4℃消化10～12 h，分离表皮和真皮层；0.125%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化表皮15～20 min。以离心半径10 cm、1 300 r/min离心5 min后收集细胞，接种于预先用Ⅳ型胶原铺板的6孔板，K-SFM培养，待细胞生长融合至70%～80%时传代。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。取第3代细胞，采用β1整合素、CK19及p63免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。
1.2.2 SGCs分离培养及鉴定
取健康成人全层皮肤去除皮下组织，修剪为1 mm×1 mm大小的皮片，5 mLⅡ型胶原酶液（2 g/L）消化，4℃冰箱过夜。倒置相差显微镜下用微量移液器挑取汗腺，加入600～800 μL DMEM/F12基础培养基，待汗腺组织贴壁后在6孔板中补加相同培养基1.5 mL。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。待细胞长满6孔板时使用0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化细胞，以离心半径10 cm、800 r/min离心3 min后收集细胞并传代，每3天换液，收集第1代细胞上清液，4℃冰箱保存待用。取第1代细胞采用CK7、CK18、CK19和CEA免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。
1.3 ESCs诱导分化的表型和MAPK/ERK通路检测
1.3.1 实验分组
取第2代ESCs分为4组（由同一株细胞传代而来），按1×106个/mL密度接种于Transwell共培养系统的下室，将Transwell的上室置于下室孔内，按1×106个/mL密度接种第1代SGCs于上室中，上、下室以DMEM/F12基础培养基相互通融，建立ESCs与SGCs共培养体系，每3天换液1次。A组通过Transwell共培养系统将两种细胞共培养；B组直接于6孔培养板中加入第1代SGCs上清液培养ESCs；C组在A组基础上加入浓度为60 ng/mL的EGF；D组在A组基础上加入浓度为10 mmol/L的PD98059。
1.3.2 倒置相差显微镜观察
培养期间采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化。
1.3.3 流式细胞仪检测
各组培养14 d后，采用流式细胞术检测各组ESCs的CEA和β1整合素表达阳性率；同时检测同批次的第2代ESCs作为分化前对照组。其中CEA、β1整合素受体单克隆抗体（1∶100） 孵育40 min，PBS清洗细胞；FITC荧光二抗（1∶100） 避光孵育40 min，PBS清洗后上机检测。
1.3.4 信号通路的Western blot检测
采用Western blot检测各组ERK及磷酸化ERK（phosphorylation ERK，P-ERK）表达。取A、C、D组Transwell下室的细胞和B组培养板中的细胞，PBS冲洗，加入RIPA裂解液；冰浴30 min，12 000×g离心5 min后收集上清，SDS-PAGE电泳，灌胶、上样电泳至溴酚蓝出现，进行转膜，300 mA恒流转膜30 min，25 V恒压转膜过夜。室温下脱色，封闭1 h，稀释一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗；稀释二抗，室温下孵育30 min，PBS清洗，每次5 min。TTBS液冲洗后曝片，胶片用扫描仪成像，Image Pro-plus6.0图像分析软件分析灰度值，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示，并且定义A组为标准数1，其他3组数据以与A组的倍数表示。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ESCs形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，培养细胞24 h贴壁，10 d左右长满6孔板。细胞外观呈卵圆形且透亮，细胞之间连接紧密，呈“铺路石”样排列；原代与传代细胞形态无明显差异。见图 1。第3代细胞经免疫荧光染色，强烈表达β1整合素，同时表达CK19及p63，全部染色均以DAPI染核，提示培养细胞为ESCs。见图 2。
图1
ESCs形态学观察（倒置相差显微镜×50） ⓐ原代细胞 ⓑ第2代细胞 图 2 第3代ESCs免疫荧光染色鉴定（荧光显微镜×200） ⓐCK19 ⓑp63 ⓒβ1整合素 图 3 SGCs形态学观察（倒置相差显微镜×50） ⓐ原代细胞 ⓑ细胞生长过程中混杂成纤维细胞生长 ⓒ第2代细胞成纤维化 图 4 第1代SGCs免疫荧光染色鉴定（荧光显微镜×200） ⓐCEA ⓑCK19 ⓒCK7 ⓓCK18
Figure1.
ESCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐPrimary cells ⓑThe 2nd passage cells Fig. 2 Immunofluorescence staining of the 3rd passage ESCs (Fluorescence microscope×200) ⓐCK19 ⓑp63 ⓒβ1-integrin Fig. 3 SGCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐPrimary cells ⓑMixed fibroblasts growth ⓒFibre-like at passage 2 SGCs Fig. 4 Immunofluorescence staining of the 1st passage SGCs (Fluorescence microscope×200) ⓐCEA ⓑCK19 ⓒCK7 ⓓCK18
2.2 SGCs形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，正常汗腺组织呈卷曲状，2～3 d开始贴壁，20 d左右长满6孔板。细胞呈扁平多角形结构，相邻细胞膜相互贴附紧密；增殖期间易有成纤维细胞混杂生长；与原代SGCs比较，第2代SGCs已开始成纤维化。见图 3。第1 代细胞经免疫荧光染色，强烈表达CEA，同时表达CK19、CK7及CK18，全部染色均以DAPI染核，提示培养细胞为SGCs。见图 4。
2.3 ESCs诱导分化的表型和MAPK/ERK通路检测
2.3.1 倒置相差显微镜观察
A、C、D组培养后细胞形态变化相似，9 d后细胞失去ESCs卵圆形且透亮的结构，开始出现扁平多角形结构改变。B组形态变化较慢，培养12 d后与其他3组结构相似。见图 5。
图2
共培养后各组细胞形态学变化（倒置相差显微镜×50） ⓐA组3 d ⓑA组7 d ⓒA组9 d ⓓB组3 d ⓔB组7 d ⓕB组12 d
Figure2.
Morphological changes after co-culturing of each group (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐGroup A at 3 days ⓑGroup A at 7 days ⓒGroup A at 9 days ⓓGroup B at 3 days ⓔGroup B at 7 days ⓕGroup B at 12 days
2.3.2 流式细胞仪检测
分化前对照组β1整合素明显高表达，CEA几乎不表达，与A～D组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。B组经上清液培养后，与分化前对照组相比，ESCs的β1整合素表达下降、CEA表达增高，但其β1整合素表达仍显著高于A、C、D组，CEA表达明显低于其余3组，差异均有统计学意义（P<0.05）。A、C、D组中，C组CEA表达最低、β1整合素表达最高，D组CEA表达最高、β1整合素表达最低，3组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
流式细胞仪检测共培养前后ESCsβ1整合素和CEA阳性率（n=5，%，2.3.3 Western blot检测ESCs分化过程中表型转化的MAPK/ERK信号通路
各组均有较高水平ERK表达，但B组明显低于其余3组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余3组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。P-ERK表达A组最高、C组最低，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6、表 2。
图3
Western blot检测各组ESCs分化过程中表型转化的MAPK/ERK信号通路 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组
Figure3.
MAPK/ERK pathway in ESCs differentiation by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot检测各组细胞ESCs分化过程中表型转化的MAPK/erk信号通路（n=5，3 讨论
大面积深度烧伤患者创面愈合后生存质量低下，损伤区汗腺缺失导致体温调节功能障碍是原因之一，因此汗腺构建是临床上亟待解决的重要问题。既往研究表明，ESCs作为皮肤中的多能干细胞，具有高度的增殖能力、多向分化潜能、自我更新能力以及低免疫原性等特点，在皮肤创面修复中发挥重要作用[6-7]。
“龛影学说”认为干细胞所处微环境有着较好的诱导分化作用，当干细胞处于某一特定微环境时，接受其分化信号，可对分化细胞进行某些特定变化[8]。目前尚未发现汗腺样细胞的特异性标志，但研究表明，CEA只在汗腺导管部和分泌部的管腔表达，在表皮的其他部位不表达[9]，在ESCs也不表达，因此本实验选择CEA作为ESCs分化程度的检测指标。β1整合素作为ESCs相对特异性表面标记物已被研究证实[10]，其在ESCs的细胞表面呈现高表达状态，而在终末分化细胞表面则不表达，因此本实验将β1整合素作为反向观察指标以证实ESCs向SGCs分化的表型改变情况。本研究结果显示，单纯使用第1 代SGCs上清液培养SGCs，其表型未发生明显改变，但通过Transwell共培养系统中细胞与细胞间的相互作用后，表型发生显著改变，说明细胞与细胞之间相互作用在ESCs的诱导分化中扮演着非常重要的角色。
MAPK/erk通路通过三级磷酸化级联反应作为主体，构成经典的介导细胞由外到内的重要信号转导通路，主要调节细胞增殖和凋亡[11-12]。研究表明，β1整合素的表达水平和MAPK/erk的活性高低直接决定着ESCs的增殖和分化能力[13-14]。EGF可促进ESCs的增殖，诱导ERK磷酸化，可作为MAPK/erk通路的相对促进剂。PD98059作为MAPK/erk通路的抑制剂，也已广泛应用于ERK1/2的研究中，主要通过阻断ERK磷酸化而发挥作用[15-22]。本研究采用Western blot法测定ESCs中ERK的水平，同时应用PD98059和EGF从正反两个方向影响该通路，观察它们对于ESCs表型转化的影响。结果表明，SGCs与ESCs共培养过程中可激活ESCs中的ERK通路，PD98059可抑制MAPK/erk通路的磷酸化，使其活性降低，促使ESCs退出干细胞群落，向SGCs方向分化；流式细胞术检测结果显示ESCs中CEA的表达明显增多，β1整合素明显降低。相反，EGF可以激活MAPK通路，维持ESCs向增殖方向发展，抑制ESCs向SGCs分化，因此C组ESCs中的CEA表达少于D组，说明抑制MAPK/erk通路的磷酸化在ESCs向SGCs分化过程中的重要作用。
本研究结果表明，在合适条件下，ESCs可经诱导分化为SGCs，其表型发生相应改变；通过对MAPK/erk通路的控制，可以调节ESCs的分化方向和程度。但汗腺重建是一个复杂过程，其机制尚需要进一步研究予以明确。
大面积深度烧伤创面愈合后汗腺缺失导致的体温调节障碍，是亟待解决的严重影响患者生存质量的问题。近年来干细胞与再生医学领域研究的飞速发展，使得汗腺重建成为可能[1-2]。表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）作为皮肤的特异性干细胞，具有包括向汗腺细胞（sweat gland cells，SGCs）、成纤维细胞及毛囊干细胞等多向分化的潜能[3]。并且有研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路在汗腺的发生和发育过程中起着重要作用[4-5]。本研究在既往研究基础上，诱导成人皮肤ESCs向SGCs分化，探讨分化过程中ESCs表型的改变，并对MAPK/ERK通路的变化情况进行初步研究，为创面的功能性愈合提供新的思路和实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验标本及主要试剂、仪器
健康成人包皮和全层皮肤取自解放军总医院第一附属医院行包皮环切和全厚皮肤移植的患者，均取得医院伦理委员会批准和患者知情同意。
DMEM/F12基础培养基、FBS、胰蛋白酶-EDTA、无血清细胞培养基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、EGF、中性蛋白酶（GIBCO公司，美国）；PBS、青霉素/链霉素/两性霉素B三抗（PAA公司，美国）；Ⅳ型胶原、Ⅱ型胶原酶、PD98059（Sigma公司、美国）；β1整合素受体单克隆抗体、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）受体单克隆抗体、CK7受体单克隆抗体、CK18受体单克隆抗体、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）受体单克隆抗体（Abcam公司，英国）；RIPA裂解液（谷歌生物科技有限公司）。倒置相差显微镜、荧光显微镜（Leica公司，德国）；离心机（Kubota公司，日本）；流式检测仪（BD Facsverse公司，美国）；Image Pro-plus6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；生物净化工作台（北京伟达净化研究所）。
1.2 ESCs及SGCs的体外分离培养及鉴定
1.2.1 ESCs分离培养及鉴定
取健康成人包皮去除皮下组织，修剪成1 cm×1 cm大小的皮片，中性蛋白酶4℃消化10～12 h，分离表皮和真皮层；0.125%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化表皮15～20 min。以离心半径10 cm、1 300 r/min离心5 min后收集细胞，接种于预先用Ⅳ型胶原铺板的6孔板，K-SFM培养，待细胞生长融合至70%～80%时传代。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。取第3代细胞，采用β1整合素、CK19及p63免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。
1.2.2 SGCs分离培养及鉴定
取健康成人全层皮肤去除皮下组织，修剪为1 mm×1 mm大小的皮片，5 mLⅡ型胶原酶液（2 g/L）消化，4℃冰箱过夜。倒置相差显微镜下用微量移液器挑取汗腺，加入600～800 μL DMEM/F12基础培养基，待汗腺组织贴壁后在6孔板中补加相同培养基1.5 mL。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。待细胞长满6孔板时使用0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化细胞，以离心半径10 cm、800 r/min离心3 min后收集细胞并传代，每3天换液，收集第1代细胞上清液，4℃冰箱保存待用。取第1代细胞采用CK7、CK18、CK19和CEA免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。
1.3 ESCs诱导分化的表型和MAPK/ERK通路检测
1.3.1 实验分组
取第2代ESCs分为4组（由同一株细胞传代而来），按1×106个/mL密度接种于Transwell共培养系统的下室，将Transwell的上室置于下室孔内，按1×106个/mL密度接种第1代SGCs于上室中，上、下室以DMEM/F12基础培养基相互通融，建立ESCs与SGCs共培养体系，每3天换液1次。A组通过Transwell共培养系统将两种细胞共培养；B组直接于6孔培养板中加入第1代SGCs上清液培养ESCs；C组在A组基础上加入浓度为60 ng/mL的EGF；D组在A组基础上加入浓度为10 mmol/L的PD98059。
1.3.2 倒置相差显微镜观察
培养期间采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化。
1.3.3 流式细胞仪检测
各组培养14 d后，采用流式细胞术检测各组ESCs的CEA和β1整合素表达阳性率；同时检测同批次的第2代ESCs作为分化前对照组。其中CEA、β1整合素受体单克隆抗体（1∶100） 孵育40 min，PBS清洗细胞；FITC荧光二抗（1∶100） 避光孵育40 min，PBS清洗后上机检测。
1.3.4 信号通路的Western blot检测
采用Western blot检测各组ERK及磷酸化ERK（phosphorylation ERK，P-ERK）表达。取A、C、D组Transwell下室的细胞和B组培养板中的细胞，PBS冲洗，加入RIPA裂解液；冰浴30 min，12 000×g离心5 min后收集上清，SDS-PAGE电泳，灌胶、上样电泳至溴酚蓝出现，进行转膜，300 mA恒流转膜30 min，25 V恒压转膜过夜。室温下脱色，封闭1 h，稀释一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗；稀释二抗，室温下孵育30 min，PBS清洗，每次5 min。TTBS液冲洗后曝片，胶片用扫描仪成像，Image Pro-plus6.0图像分析软件分析灰度值，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示，并且定义A组为标准数1，其他3组数据以与A组的倍数表示。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ESCs形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，培养细胞24 h贴壁，10 d左右长满6孔板。细胞外观呈卵圆形且透亮，细胞之间连接紧密，呈“铺路石”样排列；原代与传代细胞形态无明显差异。见图 1。第3代细胞经免疫荧光染色，强烈表达β1整合素，同时表达CK19及p63，全部染色均以DAPI染核，提示培养细胞为ESCs。见图 2。
图1
ESCs形态学观察（倒置相差显微镜×50） ⓐ原代细胞 ⓑ第2代细胞 图 2 第3代ESCs免疫荧光染色鉴定（荧光显微镜×200） ⓐCK19 ⓑp63 ⓒβ1整合素 图 3 SGCs形态学观察（倒置相差显微镜×50） ⓐ原代细胞 ⓑ细胞生长过程中混杂成纤维细胞生长 ⓒ第2代细胞成纤维化 图 4 第1代SGCs免疫荧光染色鉴定（荧光显微镜×200） ⓐCEA ⓑCK19 ⓒCK7 ⓓCK18
Figure1.
ESCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐPrimary cells ⓑThe 2nd passage cells Fig. 2 Immunofluorescence staining of the 3rd passage ESCs (Fluorescence microscope×200) ⓐCK19 ⓑp63 ⓒβ1-integrin Fig. 3 SGCs morphology observation (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐPrimary cells ⓑMixed fibroblasts growth ⓒFibre-like at passage 2 SGCs Fig. 4 Immunofluorescence staining of the 1st passage SGCs (Fluorescence microscope×200) ⓐCEA ⓑCK19 ⓒCK7 ⓓCK18
2.2 SGCs形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，正常汗腺组织呈卷曲状，2～3 d开始贴壁，20 d左右长满6孔板。细胞呈扁平多角形结构，相邻细胞膜相互贴附紧密；增殖期间易有成纤维细胞混杂生长；与原代SGCs比较，第2代SGCs已开始成纤维化。见图 3。第1 代细胞经免疫荧光染色，强烈表达CEA，同时表达CK19、CK7及CK18，全部染色均以DAPI染核，提示培养细胞为SGCs。见图 4。
2.3 ESCs诱导分化的表型和MAPK/ERK通路检测
2.3.1 倒置相差显微镜观察
A、C、D组培养后细胞形态变化相似，9 d后细胞失去ESCs卵圆形且透亮的结构，开始出现扁平多角形结构改变。B组形态变化较慢，培养12 d后与其他3组结构相似。见图 5。
图2
共培养后各组细胞形态学变化（倒置相差显微镜×50） ⓐA组3 d ⓑA组7 d ⓒA组9 d ⓓB组3 d ⓔB组7 d ⓕB组12 d
Figure2.
Morphological changes after co-culturing of each group (Inverted phase contrast microscope×50) ⓐGroup A at 3 days ⓑGroup A at 7 days ⓒGroup A at 9 days ⓓGroup B at 3 days ⓔGroup B at 7 days ⓕGroup B at 12 days
2.3.2 流式细胞仪检测
分化前对照组β1整合素明显高表达，CEA几乎不表达，与A～D组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。B组经上清液培养后，与分化前对照组相比，ESCs的β1整合素表达下降、CEA表达增高，但其β1整合素表达仍显著高于A、C、D组，CEA表达明显低于其余3组，差异均有统计学意义（P<0.05）。A、C、D组中，C组CEA表达最低、β1整合素表达最高，D组CEA表达最高、β1整合素表达最低，3组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
流式细胞仪检测共培养前后ESCsβ1整合素和CEA阳性率（n=5，%，2.3.3 Western blot检测ESCs分化过程中表型转化的MAPK/ERK信号通路
各组均有较高水平ERK表达，但B组明显低于其余3组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余3组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。P-ERK表达A组最高、C组最低，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6、表 2。
图3
Western blot检测各组ESCs分化过程中表型转化的MAPK/ERK信号通路 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组
Figure3.
MAPK/ERK pathway in ESCs differentiation by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot检测各组细胞ESCs分化过程中表型转化的MAPK/erk信号通路（n=5，3 讨论
大面积深度烧伤患者创面愈合后生存质量低下，损伤区汗腺缺失导致体温调节功能障碍是原因之一，因此汗腺构建是临床上亟待解决的重要问题。既往研究表明，ESCs作为皮肤中的多能干细胞，具有高度的增殖能力、多向分化潜能、自我更新能力以及低免疫原性等特点，在皮肤创面修复中发挥重要作用[6-7]。
“龛影学说”认为干细胞所处微环境有着较好的诱导分化作用，当干细胞处于某一特定微环境时，接受其分化信号，可对分化细胞进行某些特定变化[8]。目前尚未发现汗腺样细胞的特异性标志，但研究表明，CEA只在汗腺导管部和分泌部的管腔表达，在表皮的其他部位不表达[9]，在ESCs也不表达，因此本实验选择CEA作为ESCs分化程度的检测指标。β1整合素作为ESCs相对特异性表面标记物已被研究证实[10]，其在ESCs的细胞表面呈现高表达状态，而在终末分化细胞表面则不表达，因此本实验将β1整合素作为反向观察指标以证实ESCs向SGCs分化的表型改变情况。本研究结果显示，单纯使用第1 代SGCs上清液培养SGCs，其表型未发生明显改变，但通过Transwell共培养系统中细胞与细胞间的相互作用后，表型发生显著改变，说明细胞与细胞之间相互作用在ESCs的诱导分化中扮演着非常重要的角色。
MAPK/erk通路通过三级磷酸化级联反应作为主体，构成经典的介导细胞由外到内的重要信号转导通路，主要调节细胞增殖和凋亡[11-12]。研究表明，β1整合素的表达水平和MAPK/erk的活性高低直接决定着ESCs的增殖和分化能力[13-14]。EGF可促进ESCs的增殖，诱导ERK磷酸化，可作为MAPK/erk通路的相对促进剂。PD98059作为MAPK/erk通路的抑制剂，也已广泛应用于ERK1/2的研究中，主要通过阻断ERK磷酸化而发挥作用[15-22]。本研究采用Western blot法测定ESCs中ERK的水平，同时应用PD98059和EGF从正反两个方向影响该通路，观察它们对于ESCs表型转化的影响。结果表明，SGCs与ESCs共培养过程中可激活ESCs中的ERK通路，PD98059可抑制MAPK/erk通路的磷酸化，使其活性降低，促使ESCs退出干细胞群落，向SGCs方向分化；流式细胞术检测结果显示ESCs中CEA的表达明显增多，β1整合素明显降低。相反，EGF可以激活MAPK通路，维持ESCs向增殖方向发展，抑制ESCs向SGCs分化，因此C组ESCs中的CEA表达少于D组，说明抑制MAPK/erk通路的磷酸化在ESCs向SGCs分化过程中的重要作用。
本研究结果表明，在合适条件下，ESCs可经诱导分化为SGCs，其表型发生相应改变；通过对MAPK/erk通路的控制，可以调节ESCs的分化方向和程度。但汗腺重建是一个复杂过程，其机制尚需要进一步研究予以明确。
