引用本文： 王淼, 王南, 权正学, 罗小辑. Hey1表达对BMP-9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化及增殖影响. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(3): 279-285. doi: 10.7507/1002-1892.20160056 复制
干细胞成骨分化的研究一直是骨组织工程关注热点。目前普遍认为，干细胞成骨分化是一系列基因精细调控的结果[1-2]。其中，BMP是公认的能够诱导干细胞异位成骨的细胞因子[3-7]，但其诱导干细胞成骨分化的机制未完全阐明。而且即使使用成骨诱导活性最强的BMP-2、6、7、9等细胞因子诱导干细胞，除成骨分化外，也存在成脂肪、肌肉、软骨分化可能[8]。本课题组前期实验表明，Notch信号通路的关键靶点之一Hey1基因可能在BMP-9诱导干细胞成骨分化过程中起到重要作用[9]。Lavery等[10]也报道BMP-7诱导干细胞成骨分化部分依赖Hey1基因的表达。已有研究证实Notch信号通路对干细胞的成骨分化具有抑制和诱导双重作用[11]，但对Hey1基因在干细胞成骨分化中的作用及机制却未明确[12]。因此，本研究通过慢病毒感染方式改变鼠成纤维细胞C3H10T1/2细胞的Hey1基因表达水平，并建立稳定的细胞系，用BMP-9腺病毒制备含有BMP-9的条件培养基诱导上述细胞，观察Hey1基因表达水平改变对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞增殖和成骨分化的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
慢病毒包装四质粒系统（pGLV5-H1-GFP-Puro、PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE；上海吉玛制药技术有限公司）；鼠成纤维细胞C3H10T1/2细胞、结肠癌细胞株HCT116、293T细胞（中国科学院上海细胞库）；Ad-BMP-9、Ad-GFP（重庆医科大学分子生物实验室）；SYBR Green RT-PCR Kit、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、BamHⅠ、NotⅠ（Takara公司，日本）；质粒小量抽提试剂盒（Promega公司，美国）；制备感受态试剂盒（BIOSCIENCES公司，美国）；DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；ELISA、MTT试剂盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、DEPC（Sigma公司，美国）；BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Hey1、Runx2、骨桥蛋白、骨钙素一抗（Abcam公司、美国）；GAPDH（小鼠来源）、预染蛋白Marker（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ALP染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
FTC-2000实时荧光定量PCR仪（Funglyn Biotech公司，加拿大）；低温高速离心机（Beckman公司，美国）；荧光倒置显微镜（Olympus公司，日本）；垂直板电泳转移装置、电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Tek公司，美国）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司，美国）。
1.2 慢病毒的构建及包装
参考美国国立生物技术信息中心（NCBI）的Hey1基因序列（NM_010423.2），通过Primer5.0设计引物：上游，5' -GATTGGCGGCCGCGCCACCATGAAGAG-A-3' ；下游，5' -GTATGGGATCCTTAGAA-AGCTCCGATCTCTGTCC-3' 。PCR扩增Hey1编码序列（上海生工生物工程技术有限公司），利用Agarose电泳并切胶回收Hey1基因片段。NotⅠ和BamHⅠ酶切Hey1基因片段并线性化pGLV5-H1-GFP-Puro质粒，T4 DNA ligase连接双酶切得到的Hey1基因片段和线性化质粒，22℃连接2 h后得到LV-Hey1，将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行双酶切鉴定并进行对比测序（上海生工生物工程技术有限公司）。鉴定无误后大量质粒抽提，与其他3种辅助包装质粒PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE共感染293T细胞，感染后8 h更换为完全培养基，继续培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到慢病毒浓缩液；取浓缩液感染293T细胞，采用倍比稀释法检测病毒滴度。根据Hey1基因序列设计第347位点为干涉位点，干扰片段序列长21 bp，序列为5' -GCCGACGAGACCGAATCAATA-3' 。同上法构建LV-shHey1与LV-Blank（空质粒）并包装获得病毒。
1.3 慢病毒感染C3H10T1/2细胞及不同Hey1表达水平细胞系的建立
将C3H10T1/2细胞用含10%FBS、100 mmol/L青霉素及100 g/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。然后接种于24孔板，每孔3×104个细胞，铺板时细胞融合约50%。每孔加入含10%FBS的DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养，2 d后待细胞融合约70%时进行病毒感染。以感染复数20为标准，依据病毒滴度计算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank合适感染量，分别以相应的病毒量感染C3H10T1/2细胞（C3H10T1/2-Hey1组、C3H10T1/2-shHey1组、C3H10T1/2-Blank组），24 h后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液继续培养。48 h后取细胞行荧光显微镜观察慢病毒感染效果，采用实时荧光定量PCR（基因引物序列见表 1）以及Western blot对Hey1表达水平进行验证，并以正常C3H10T1/2细胞作为正常对照（C3H10T1/2组）。证实干预Hey1表达水平成功后，采用含4 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基筛选稳定细胞系用于后续实验。
表1
实时荧光定量PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 实验分组及方法
参照本课题组方法[13]制备含BMP-9的条件培养基，将培养基以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min后，收集上清，4℃保存备用。根据细胞及培养方法不同，将实验分为5组，其中C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组为正常培养基培养C3H10T1/2细胞及C3H10T1/2-Blank感染细胞；BMP-9+ C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组为含BMP-9的条件培养基培养C3H10T1/2细胞、C3H10T1/2-Hey1感染细胞及C3H10T1/2-shHey1感染细胞。
1.5 观测指标
1.5.1 实时荧光定量PCR检测成骨分化相关转录因子mRNA表达水平
取各组细胞接种于24孔板，每孔2×104个，按分组以对应培养基培养48 h后，每孔加入Trizol试剂400μL，按说明书步骤提取目的细胞总RNA；Runx2、骨桥蛋白、骨钙素及内参GAPDH引物序列见表 1，引物合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。使用SYBR Green RT-PCR Kit进行20.0μL逆转录体系反应，25℃、10 min，42℃、50 min，85℃、5 min；然后取2.0 μL cDNA产物，以2×PCR buffer 25.0μL、Primers（25 pmol/μL）2.0 μL、SYBR Green 0.5μL、cDNA 2.0 μL、DEPC 20.5μL共50 μL反应体系进行荧光定量PCR扩增，条件为：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循环35次。按照2-ΔΔCt法计算相关转录因子mRNA相对表达量。实验重复3次。
1.5.2 Western blot检测成骨分化相关转录因子蛋白表达水平
各组细胞同1.5.1方法培养48 h后，去除培养基，PBS洗1遍；悬浮细胞，以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗1遍。按BCA蛋白定量提取试剂盒说明提取总蛋白。BCA法测定细胞蛋白浓度；取50μg总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后转移至聚偏氟乙烯膜，经脱脂奶粉封闭后，加入至稀释的兔抗鼠Runx2、骨桥蛋白、骨钙素及GAPDH一抗工作液（1:500）中，4℃过夜，漂洗后转入稀释的羊抗兔二抗工作液（1:1 000）中，室温孵育4 h；化学发光试剂ECL显色后，拍照并测定内参蛋白及待测蛋白条带的吸光度（A）值，以待测蛋白与内参蛋白A值比值作为其相对表达量。
1.5.3 MTT测定细胞增殖能力
取各组细胞接种于96孔板，每孔5×103个，按分组以对应培养基培养，4、5、6、7 d各组取3孔，每孔加入20μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后弃培养基，每孔加入DMSO 100 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量A值，间接反映活细胞数量与增殖能力。
1.5.4 流式细胞仪测定细胞周期
取各组细胞同1.5.3方法培养4、5、10 d，分别收集细胞，用75%冰乙醇于4℃冰箱固定过夜。然后弃冰乙醇，用预冷PBS充分混匀洗涤2次，加入0.01%RNase和0.5% PI，4℃避光孵育15 min后，在流式细胞仪488 nm波长下测定DNA含量，PI所发的红光通过630 nm的滤光片进行收集，采用CELLQest软件进行分析，获得细胞周期各时期百分比，计算G2+S期百分比。
1.5.5 成骨分化标志ALP的测定
取各组细胞同1.5.3方法培养4、7 d，将细胞用PBS（pH7.2～7.4）稀释，细胞浓度达1×106个/mL。反复冻融细胞，使其释放出细胞内成分。以离心半径20 cm、2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清，ELISA法测定ALP含量[2]。同时，取细胞采用ALP染色试剂盒，按说明操作对细胞进行染色观察。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒感染C3H10T1/2细胞观察
通过倍比稀释法测得LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank病毒滴度分别为1×108、7×108、3×108 TU/mL。经计算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank的合适感染量分别为10、1、3μL。荧光显微镜观察示，LV-Hey1、LV-shHe y 1、LV-Blank均成功感染C3H10T1/2细胞，感染率达90%以上（图 1）。
图1
荧光显微镜下观察经不同慢病毒感染48 h的C3H10T1/2细胞（×100） ⓐ C3H10T1/2-Blank组 ⓑ C3H10T1/2-Hey1组 ⓒ C3H10T1/2-shHey1组 图 2 Western blot检测不同Hey1表达水平细胞系Hey1蛋白表达Mr：相对分子质量1：C3H10T1/2组2：C3H10T1/2-Blank组3：C3H10T1/2-Hey1组4：C3H10T1/2-shHey1组 图 3 Western blot检测各组成骨分化相关转录因子蛋白表达Mr：相对分子质量1：C3H10T1/2组2：C3H10T1/2-Blank组3：BMP-9+C3H10T1/2组4：BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组5：BMP-9+ C3H10T1/2-shHey1组 图 4 MTT检测诱导培养不同时间点各组A值 图 5流式细胞仪检测诱导培养不同时间点各组细胞G2+S期百分比 图 6 ELISA检测诱导培养4、7 d各组ALP含量
Figure1.
Observation of infected C3H10T1/2 cells under fluorescence microscope after 48 hours (×100) ⓐ C3H10T1/2-Blank group ⓑ C3H10T1/2-Hey1 group ⓒ C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 2 Hey1 expression level of C3H10T1/2 cell lines with different Hey1 expression levels by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: C3H10T1/2-Hey1 group 4: C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 3 Expression levels of transcription factors by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: BMP-9+C3H10T1/2 group 4: BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group 5: BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 4 A values of different groups at different time points by MTT assay Fig. 5 Percentage of G2+S cells of different groups at different time points by flow cytometer Fig. 6 ALP activity of different groups at 4 and 7 days by ELISA
实时荧光定量PCR测定C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、C3H10T1/2-Hey1组、C3H10T1/2-shHey1组Hey1 mRNA相对表达量分别为1.038±0.061、0.965±0.085、2.658±0.569、0.291±0.027；Western blot检测Hey1蛋白相对表达量分别为0.506±0.014、0.512±0.001、0.821±0.042、0.106±0.021（图 2）。除C3H10T1/2组Hey1 mRNA及蛋白相对表达量与C3H10T1/2-Blank组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。提示成功建立不同Hey1表达水平的稳定细胞系。
2.2 Hey1表达水平改变对成骨分化相关转录因子的影响
2.2.1 实时荧光定量PCR检测
培养48 h，除C3H10T1/2组与C3H10T1/2-Blank组Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量PCR检测各组成骨分化相关转录因子mRNA相对表达量（n=3，2.2.2 Western blot检测
培养48 h，除C3H10T1/2组与C3H10T1/2-Blank组Runx2、骨桥蛋白、骨钙素蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 3、图 3。
表3
Western blot检测各组成骨分化相关转录因子蛋白相对表达量（n=3，2.3 Hey1表达水平改变对细胞增殖能力的影响
MTT检测显示，4 d各组A值比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；5、6、7 d C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），而BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组及BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组间比较，以及分别与以上3组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
流式细胞仪检测，4、5、10 d，BMP-9+ C3H10T1/2-Hey1组细胞G2+S期百分比较其余各组显著升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。5、10 d时，BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组较C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组显著降低，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；其余各时间点组间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 5。
2.4 Hey1表达水平改变对成骨分化标志物ALP的影响
ELISA检测示，4、7 d时，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组细胞ALP含量显著高于其余各组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；BMP-9+C3H10T1/2组显著高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
ALP染色镜下观察示，4、7 d，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组染色最深，C3H10T1/2组及C3H10T1/2-shHey1组染色无明显差异，均较BMP-9+C3H10T1/2组染色浅。见图 7。
图7
诱导培养4、7 d各组ALP染色观察（×100）从左至右分别为C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组 ⓐ 培养4 d ⓑ 培养7 d
Figure7.
ALP staining observation of different groups at 4 and 7 days (×100) From left to right for C3H10T1/2 group, C3H10T1/2-Blank group, BMP-9+C3H10T1/2 group, BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group, and BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group, respectively ⓐ At 4 days ⓑ At 7 days
3 讨论
Notch信号通路作为高度保守的信号转导通路，对细胞分化起关键作用。通过Notch受体的信号传递能够扩大并固化相邻细胞之间的分子差异，最终决定细胞的分化方向[14]。Tezuka等[15]对MC3T3-E1细胞及C3H10T1/2细胞通过腺病毒感染方式增强Notch信号通路上游蛋白Notch1 CD表达，观察到显著增加的钙结节形成效应以及成骨分化，并且抑制了上述细胞的成脂分化，说明Notch信号的增强有助于成骨分化。而作为Notch信号通路下游关键靶点分子Hey1，其表达具有激活成骨分化关键转录因子Runx2的效应[16]。Suh等[17]对MC3T3-E1细胞成骨分化过程行Chip分析，发现Hey1分子通过增强Runx2蛋白稳定性的方式增加Runx2的转录活性，进而促进成骨分化。本研究我们发现，在BMP-9诱导下的C3H10T1/2细胞过表达Hey1也能显著促进Runx2的转录活性，并且通过比较成骨分化早期标志物ALP活性发现增强了成骨分化的效应。已有研究表明，Notch信号通路参与BMP诱导的干细胞成骨分化，如在BMP-2诱导MC3T3-E1等细胞成骨分化研究中，证实Notch信号通路与BMP-2存在促成骨分化协同作用[18-20]。本研究中，我们通过对成骨分化相关转录因子骨桥蛋白、骨钙素及早期成骨分化标志物ALP的检测，也发现Notch信号通路与BMP-9存在促成骨分化的协同作用。
此外，我们发现抑制Hey1表达，对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化产生明显的拮抗效应，Runx2、骨桥蛋白表达及ALP分泌显著下降。其中Runx2、骨桥蛋白的表达量甚至低于无BMP-9诱导的正常C3H10T1/2细胞，但骨钙素的表达却仍高于C3H10T1/2细胞。结合之前报道[21] Runx2高表达在BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中会抑制骨钙素的表达，提示Hey1分子与Runx2、骨钙素之间可能存在调控回路，需要进一步研究。MTT检测发现，Hey1的过表达与抑制，对BMP-9诱导下的C3H10T1/2细胞增殖分别存在促进和抑制效应，但通过流式周期进一步分析发现随着时间延长，过表达Hey1带来的促增殖效应减弱，与之前的研究报道一致[22]。结合Salie等[23]的体内实验结果，Hey1敲除小鼠与Hey1高表达小鼠均呈严重骨质疏松，其中Hey1过表达导致成骨细胞减少，而Hey1敲除造成显著的破骨细胞生成。提示Hey1表达水平对成骨的最终效应起着重要平衡作用。结合以上报道，我们认为Hey1表达水平影响BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的最终效应还应取决于细胞增殖与分化的平衡，但该结论需要更长时间的检测以及体内实验验证，这也是本研究不足之一。
综上述，Hey1作为Notch信号通路的关键下游分子，参与BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程，与BMP-9诱导成骨分化存在协同效应，并且对细胞早期增殖有重要影响，为进一步阐明BMP诱导干细胞成骨分化过程的机制以及Hey1基因在干细胞成骨分化中的作用奠定了基础。
干细胞成骨分化的研究一直是骨组织工程关注热点。目前普遍认为，干细胞成骨分化是一系列基因精细调控的结果[1-2]。其中，BMP是公认的能够诱导干细胞异位成骨的细胞因子[3-7]，但其诱导干细胞成骨分化的机制未完全阐明。而且即使使用成骨诱导活性最强的BMP-2、6、7、9等细胞因子诱导干细胞，除成骨分化外，也存在成脂肪、肌肉、软骨分化可能[8]。本课题组前期实验表明，Notch信号通路的关键靶点之一Hey1基因可能在BMP-9诱导干细胞成骨分化过程中起到重要作用[9]。Lavery等[10]也报道BMP-7诱导干细胞成骨分化部分依赖Hey1基因的表达。已有研究证实Notch信号通路对干细胞的成骨分化具有抑制和诱导双重作用[11]，但对Hey1基因在干细胞成骨分化中的作用及机制却未明确[12]。因此，本研究通过慢病毒感染方式改变鼠成纤维细胞C3H10T1/2细胞的Hey1基因表达水平，并建立稳定的细胞系，用BMP-9腺病毒制备含有BMP-9的条件培养基诱导上述细胞，观察Hey1基因表达水平改变对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞增殖和成骨分化的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
慢病毒包装四质粒系统（pGLV5-H1-GFP-Puro、PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE；上海吉玛制药技术有限公司）；鼠成纤维细胞C3H10T1/2细胞、结肠癌细胞株HCT116、293T细胞（中国科学院上海细胞库）；Ad-BMP-9、Ad-GFP（重庆医科大学分子生物实验室）；SYBR Green RT-PCR Kit、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、BamHⅠ、NotⅠ（Takara公司，日本）；质粒小量抽提试剂盒（Promega公司，美国）；制备感受态试剂盒（BIOSCIENCES公司，美国）；DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；ELISA、MTT试剂盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、DEPC（Sigma公司，美国）；BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Hey1、Runx2、骨桥蛋白、骨钙素一抗（Abcam公司、美国）；GAPDH（小鼠来源）、预染蛋白Marker（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ALP染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
FTC-2000实时荧光定量PCR仪（Funglyn Biotech公司，加拿大）；低温高速离心机（Beckman公司，美国）；荧光倒置显微镜（Olympus公司，日本）；垂直板电泳转移装置、电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Tek公司，美国）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司，美国）。
1.2 慢病毒的构建及包装
参考美国国立生物技术信息中心（NCBI）的Hey1基因序列（NM_010423.2），通过Primer5.0设计引物：上游，5' -GATTGGCGGCCGCGCCACCATGAAGAG-A-3' ；下游，5' -GTATGGGATCCTTAGAA-AGCTCCGATCTCTGTCC-3' 。PCR扩增Hey1编码序列（上海生工生物工程技术有限公司），利用Agarose电泳并切胶回收Hey1基因片段。NotⅠ和BamHⅠ酶切Hey1基因片段并线性化pGLV5-H1-GFP-Puro质粒，T4 DNA ligase连接双酶切得到的Hey1基因片段和线性化质粒，22℃连接2 h后得到LV-Hey1，将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行双酶切鉴定并进行对比测序（上海生工生物工程技术有限公司）。鉴定无误后大量质粒抽提，与其他3种辅助包装质粒PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE共感染293T细胞，感染后8 h更换为完全培养基，继续培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到慢病毒浓缩液；取浓缩液感染293T细胞，采用倍比稀释法检测病毒滴度。根据Hey1基因序列设计第347位点为干涉位点，干扰片段序列长21 bp，序列为5' -GCCGACGAGACCGAATCAATA-3' 。同上法构建LV-shHey1与LV-Blank（空质粒）并包装获得病毒。
1.3 慢病毒感染C3H10T1/2细胞及不同Hey1表达水平细胞系的建立
将C3H10T1/2细胞用含10%FBS、100 mmol/L青霉素及100 g/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。然后接种于24孔板，每孔3×104个细胞，铺板时细胞融合约50%。每孔加入含10%FBS的DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养，2 d后待细胞融合约70%时进行病毒感染。以感染复数20为标准，依据病毒滴度计算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank合适感染量，分别以相应的病毒量感染C3H10T1/2细胞（C3H10T1/2-Hey1组、C3H10T1/2-shHey1组、C3H10T1/2-Blank组），24 h后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液继续培养。48 h后取细胞行荧光显微镜观察慢病毒感染效果，采用实时荧光定量PCR（基因引物序列见表 1）以及Western blot对Hey1表达水平进行验证，并以正常C3H10T1/2细胞作为正常对照（C3H10T1/2组）。证实干预Hey1表达水平成功后，采用含4 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基筛选稳定细胞系用于后续实验。
表1
实时荧光定量PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 实验分组及方法
参照本课题组方法[13]制备含BMP-9的条件培养基，将培养基以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min后，收集上清，4℃保存备用。根据细胞及培养方法不同，将实验分为5组，其中C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组为正常培养基培养C3H10T1/2细胞及C3H10T1/2-Blank感染细胞；BMP-9+ C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组为含BMP-9的条件培养基培养C3H10T1/2细胞、C3H10T1/2-Hey1感染细胞及C3H10T1/2-shHey1感染细胞。
1.5 观测指标
1.5.1 实时荧光定量PCR检测成骨分化相关转录因子mRNA表达水平
取各组细胞接种于24孔板，每孔2×104个，按分组以对应培养基培养48 h后，每孔加入Trizol试剂400μL，按说明书步骤提取目的细胞总RNA；Runx2、骨桥蛋白、骨钙素及内参GAPDH引物序列见表 1，引物合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。使用SYBR Green RT-PCR Kit进行20.0μL逆转录体系反应，25℃、10 min，42℃、50 min，85℃、5 min；然后取2.0 μL cDNA产物，以2×PCR buffer 25.0μL、Primers（25 pmol/μL）2.0 μL、SYBR Green 0.5μL、cDNA 2.0 μL、DEPC 20.5μL共50 μL反应体系进行荧光定量PCR扩增，条件为：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循环35次。按照2-ΔΔCt法计算相关转录因子mRNA相对表达量。实验重复3次。
1.5.2 Western blot检测成骨分化相关转录因子蛋白表达水平
各组细胞同1.5.1方法培养48 h后，去除培养基，PBS洗1遍；悬浮细胞，以离心半径20 cm、800 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗1遍。按BCA蛋白定量提取试剂盒说明提取总蛋白。BCA法测定细胞蛋白浓度；取50μg总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后转移至聚偏氟乙烯膜，经脱脂奶粉封闭后，加入至稀释的兔抗鼠Runx2、骨桥蛋白、骨钙素及GAPDH一抗工作液（1:500）中，4℃过夜，漂洗后转入稀释的羊抗兔二抗工作液（1:1 000）中，室温孵育4 h；化学发光试剂ECL显色后，拍照并测定内参蛋白及待测蛋白条带的吸光度（A）值，以待测蛋白与内参蛋白A值比值作为其相对表达量。
1.5.3 MTT测定细胞增殖能力
取各组细胞接种于96孔板，每孔5×103个，按分组以对应培养基培养，4、5、6、7 d各组取3孔，每孔加入20μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后弃培养基，每孔加入DMSO 100 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量A值，间接反映活细胞数量与增殖能力。
1.5.4 流式细胞仪测定细胞周期
取各组细胞同1.5.3方法培养4、5、10 d，分别收集细胞，用75%冰乙醇于4℃冰箱固定过夜。然后弃冰乙醇，用预冷PBS充分混匀洗涤2次，加入0.01%RNase和0.5% PI，4℃避光孵育15 min后，在流式细胞仪488 nm波长下测定DNA含量，PI所发的红光通过630 nm的滤光片进行收集，采用CELLQest软件进行分析，获得细胞周期各时期百分比，计算G2+S期百分比。
1.5.5 成骨分化标志ALP的测定
取各组细胞同1.5.3方法培养4、7 d，将细胞用PBS（pH7.2～7.4）稀释，细胞浓度达1×106个/mL。反复冻融细胞，使其释放出细胞内成分。以离心半径20 cm、2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清，ELISA法测定ALP含量[2]。同时，取细胞采用ALP染色试剂盒，按说明操作对细胞进行染色观察。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒感染C3H10T1/2细胞观察
通过倍比稀释法测得LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank病毒滴度分别为1×108、7×108、3×108 TU/mL。经计算LV-Hey1、LV-shHey1、LV-Blank的合适感染量分别为10、1、3μL。荧光显微镜观察示，LV-Hey1、LV-shHe y 1、LV-Blank均成功感染C3H10T1/2细胞，感染率达90%以上（图 1）。
图1
荧光显微镜下观察经不同慢病毒感染48 h的C3H10T1/2细胞（×100） ⓐ C3H10T1/2-Blank组 ⓑ C3H10T1/2-Hey1组 ⓒ C3H10T1/2-shHey1组 图 2 Western blot检测不同Hey1表达水平细胞系Hey1蛋白表达Mr：相对分子质量1：C3H10T1/2组2：C3H10T1/2-Blank组3：C3H10T1/2-Hey1组4：C3H10T1/2-shHey1组 图 3 Western blot检测各组成骨分化相关转录因子蛋白表达Mr：相对分子质量1：C3H10T1/2组2：C3H10T1/2-Blank组3：BMP-9+C3H10T1/2组4：BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组5：BMP-9+ C3H10T1/2-shHey1组 图 4 MTT检测诱导培养不同时间点各组A值 图 5流式细胞仪检测诱导培养不同时间点各组细胞G2+S期百分比 图 6 ELISA检测诱导培养4、7 d各组ALP含量
Figure1.
Observation of infected C3H10T1/2 cells under fluorescence microscope after 48 hours (×100) ⓐ C3H10T1/2-Blank group ⓑ C3H10T1/2-Hey1 group ⓒ C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 2 Hey1 expression level of C3H10T1/2 cell lines with different Hey1 expression levels by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: C3H10T1/2-Hey1 group 4: C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 3 Expression levels of transcription factors by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: C3H10T1/2 group 2: C3H10T1/2-Blank group 3: BMP-9+C3H10T1/2 group 4: BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group 5: BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group Fig. 4 A values of different groups at different time points by MTT assay Fig. 5 Percentage of G2+S cells of different groups at different time points by flow cytometer Fig. 6 ALP activity of different groups at 4 and 7 days by ELISA
实时荧光定量PCR测定C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、C3H10T1/2-Hey1组、C3H10T1/2-shHey1组Hey1 mRNA相对表达量分别为1.038±0.061、0.965±0.085、2.658±0.569、0.291±0.027；Western blot检测Hey1蛋白相对表达量分别为0.506±0.014、0.512±0.001、0.821±0.042、0.106±0.021（图 2）。除C3H10T1/2组Hey1 mRNA及蛋白相对表达量与C3H10T1/2-Blank组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。提示成功建立不同Hey1表达水平的稳定细胞系。
2.2 Hey1表达水平改变对成骨分化相关转录因子的影响
2.2.1 实时荧光定量PCR检测
培养48 h，除C3H10T1/2组与C3H10T1/2-Blank组Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量PCR检测各组成骨分化相关转录因子mRNA相对表达量（n=3，2.2.2 Western blot检测
培养48 h，除C3H10T1/2组与C3H10T1/2-Blank组Runx2、骨桥蛋白、骨钙素蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 3、图 3。
表3
Western blot检测各组成骨分化相关转录因子蛋白相对表达量（n=3，2.3 Hey1表达水平改变对细胞增殖能力的影响
MTT检测显示，4 d各组A值比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；5、6、7 d C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），而BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组及BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组间比较，以及分别与以上3组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
流式细胞仪检测，4、5、10 d，BMP-9+ C3H10T1/2-Hey1组细胞G2+S期百分比较其余各组显著升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。5、10 d时，BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组较C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组显著降低，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；其余各时间点组间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 5。
2.4 Hey1表达水平改变对成骨分化标志物ALP的影响
ELISA检测示，4、7 d时，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组细胞ALP含量显著高于其余各组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；BMP-9+C3H10T1/2组显著高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
ALP染色镜下观察示，4、7 d，BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组染色最深，C3H10T1/2组及C3H10T1/2-shHey1组染色无明显差异，均较BMP-9+C3H10T1/2组染色浅。见图 7。
图7
诱导培养4、7 d各组ALP染色观察（×100）从左至右分别为C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组、BMP-9+C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组 ⓐ 培养4 d ⓑ 培养7 d
Figure7.
ALP staining observation of different groups at 4 and 7 days (×100) From left to right for C3H10T1/2 group, C3H10T1/2-Blank group, BMP-9+C3H10T1/2 group, BMP-9+C3H10T1/2-Hey1 group, and BMP-9+C3H10T1/2-shHey1 group, respectively ⓐ At 4 days ⓑ At 7 days
3 讨论
Notch信号通路作为高度保守的信号转导通路，对细胞分化起关键作用。通过Notch受体的信号传递能够扩大并固化相邻细胞之间的分子差异，最终决定细胞的分化方向[14]。Tezuka等[15]对MC3T3-E1细胞及C3H10T1/2细胞通过腺病毒感染方式增强Notch信号通路上游蛋白Notch1 CD表达，观察到显著增加的钙结节形成效应以及成骨分化，并且抑制了上述细胞的成脂分化，说明Notch信号的增强有助于成骨分化。而作为Notch信号通路下游关键靶点分子Hey1，其表达具有激活成骨分化关键转录因子Runx2的效应[16]。Suh等[17]对MC3T3-E1细胞成骨分化过程行Chip分析，发现Hey1分子通过增强Runx2蛋白稳定性的方式增加Runx2的转录活性，进而促进成骨分化。本研究我们发现，在BMP-9诱导下的C3H10T1/2细胞过表达Hey1也能显著促进Runx2的转录活性，并且通过比较成骨分化早期标志物ALP活性发现增强了成骨分化的效应。已有研究表明，Notch信号通路参与BMP诱导的干细胞成骨分化，如在BMP-2诱导MC3T3-E1等细胞成骨分化研究中，证实Notch信号通路与BMP-2存在促成骨分化协同作用[18-20]。本研究中，我们通过对成骨分化相关转录因子骨桥蛋白、骨钙素及早期成骨分化标志物ALP的检测，也发现Notch信号通路与BMP-9存在促成骨分化的协同作用。
此外，我们发现抑制Hey1表达，对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化产生明显的拮抗效应，Runx2、骨桥蛋白表达及ALP分泌显著下降。其中Runx2、骨桥蛋白的表达量甚至低于无BMP-9诱导的正常C3H10T1/2细胞，但骨钙素的表达却仍高于C3H10T1/2细胞。结合之前报道[21] Runx2高表达在BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中会抑制骨钙素的表达，提示Hey1分子与Runx2、骨钙素之间可能存在调控回路，需要进一步研究。MTT检测发现，Hey1的过表达与抑制，对BMP-9诱导下的C3H10T1/2细胞增殖分别存在促进和抑制效应，但通过流式周期进一步分析发现随着时间延长，过表达Hey1带来的促增殖效应减弱，与之前的研究报道一致[22]。结合Salie等[23]的体内实验结果，Hey1敲除小鼠与Hey1高表达小鼠均呈严重骨质疏松，其中Hey1过表达导致成骨细胞减少，而Hey1敲除造成显著的破骨细胞生成。提示Hey1表达水平对成骨的最终效应起着重要平衡作用。结合以上报道，我们认为Hey1表达水平影响BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的最终效应还应取决于细胞增殖与分化的平衡，但该结论需要更长时间的检测以及体内实验验证，这也是本研究不足之一。
综上述，Hey1作为Notch信号通路的关键下游分子，参与BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程，与BMP-9诱导成骨分化存在协同效应，并且对细胞早期增殖有重要影响，为进一步阐明BMP诱导干细胞成骨分化过程的机制以及Hey1基因在干细胞成骨分化中的作用奠定了基础。
