引用本文： 夏远军, 余翔, 章莹, 尹庆水, 夏虹, 郑晓辉, 谢会斌, 黄显华. 重组人BMP-2/壳聚糖/硫酸葡聚糖复合微球诱导异位成骨的micro-CT评价. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(3): 286-291. doi: 10.7507/1002-1892.20160057 复制
骨诱导是近年来骨缺损领域的研究热点。1965年Urist首次发现BMP是具有单独诱导成骨能力的细胞生长因子[1]，其中BMP-2诱导成骨能力最强[2-3]。目前研究已明确，BMP-2具有在动物体内诱导异位骨形成的作用[4-5]。但是BMP-2半衰期短，容易代谢流失，不能维持足够浓度，通过缓释载体技术可有效解决这一问题。研究表明，载药微球具有能控制药物释放速度、降低药物毒副作用、提高疏水性药物对细胞膜的通透性、改善药物的稳定性和改变给药途径、延长药物疗效以及靶向给药等优点[6]。有学者用壳聚糖（chitosan，CS）载体包裹重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）制备了CS/rhBMP-2微球[7]，载药率为（33.437±2.290）μg/mg，但实验中发现CS载体与rhBMP-2黏附效果不佳。本课题组前期实验在CS/rhBMP-2微球基础上引入硫酸葡聚糖（dextran sulfate，DS），构建rhBMP-2/CS/DS复合微球，实验显示该复合微球细胞相容性较好，载药率高，并初步显示出良好的骨诱导效果[8]。异位成骨实验已广泛用于验证BMP-2及BMP-2微球的骨诱导能力[9]，可有效避免原位宿主骨的干扰因素，是国际上检测骨替代材料性能的常用评价手段[10-11]。为此，本次实验选取SD大鼠进行异位成骨实验，采用micro-CT扫描并行骨组织参数检测，进一步分析探讨rhBMP-2/CS/DS复合微球的异位成骨能力。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6～8周龄SPF级雄性SD大鼠48只，体质量140～160 g，由广州军区广州总医院动物实验中心提供。CS（分子量为50 000～190 000、脱乙酰度85%）、DS（分子量为500 000、硫含量40%～50%）（Sigma公司，美国）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；ZnSO4（天津化学试剂公司）；NaOH（广州化学试剂厂）；0.22μm、0.45μm滤过膜（Millipre公司，美国）；ALP试剂盒、钙离子检测试剂盒（南京建成生物技术有限公司）。
JB-2型恒温磁力搅拌器（上海雷磁仪器厂）；DJ-300S型电子天平（SHINKO公司，日本）；LGZ-12型低温负压冻干机（北京松源华兴仪器公司）；DUPONT0-RC5C型高速冷冻台式离心机（Thermo Fisher公司，美国）；S-4800扫描电镜（Hitachi公司，日本）；micro-CT（GE公司，美国）；Mimics10.1软件（Materalise公司，比利时）。
1.2 微球制备及观测
1.2.1 CS/DS微球制备
取CS溶于0.175%乙酸中，配制成1 mg/mL CS溶液；用0.45μm和0.22 μm滤过膜依次过滤；取DS溶于双蒸水，配置1 mg/mL DS溶液，用0.45μm和0.22μm滤过膜依次过滤。取0.2 mL DS溶液，加入0.12 mL CS溶液，在1 500 r/min转速下搅拌5 min后，加入0.1 mL ZnSO4，继续搅拌30 min，加入5%甘露醇后将微球移至离心管中；4℃，以离心半径6 cm、15 000 r/min离心15 min，弃上清液；同上法离心3次后冻干。用3 000 Gy 60Co辐照消毒后，密封，4℃保存备用。
1.2.2 rhBMP-2/CS/DS复合微球制备
CS及DS溶液配制同1.2.1方法。取0.2 mL DS溶液加入0.04 mL rhBMP-2，在1 500 r/min转速下搅拌20 min后，加入0.12 mL CS溶液，5 min后加入0.1 mL ZnSO4，继续搅拌30 min，加入5%甘露醇后将微球移至离心管中；4℃，以离心半径6 cm、15 000 r/min离心15 min，弃上清液；同上法离心3次后冻干。用3 000 Gy 60Co辐照消毒后，密封，4℃保存备用。
1.2.3 观测指标
①扫描电镜观察：取rhBMP-2/CS/DS复合微球，用蒸馏水稀释后均匀滴于载玻片上，冷冻干燥后扫描电镜下观察微球形态。②体外缓释检测：取rhBMP-2/CS/DS复合微球（n=3），按照ELISA法于2、6、12、18、24、48、72 h，之后每隔3 d检测上清液中rhBMP-2含量，观测终点为20 d，绘制缓释曲线。
1.3 实验分组及方法
将48只SD大鼠采用随机数字表法分为A、B、C、D 4组（n=12）。4组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，于左后肢大腿作长约1.5 cm切口，制备股四头肌肌袋模型。A、B、C、D组肌袋肌间隙中分别植入相同体积明胶海绵、CS/DS微球（粉末状）、rhBMP-2（粉末状，0.25 mg）、rhBMP-2/CS/DS复合微球（粉末状，含rhBMP-2 0.25 mg），逐层缝合切口。术后分笼正常喂养，自由进食、饮水；3 d内每天腹腔注射青霉素（5 mg/kg）抗感染。
1.3.1 一般情况
术后观察大鼠存活情况，以及并发症（如切口感染、红肿、渗液等）发生情况。
1.3.2 micro-CT检测及三维重建
术后4、8、12、16周，各组分别取3只大鼠脱颈处死。按照原切口入路切取异位骨化组织块行micro-CT扫描。扫描参数：扫描分辨率21μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kV，电流80μA，曝光时间3 000 ms，帧平均数为4，像素组合为1×1。扫描完成后，于micro-CT中检测以下参数：组织骨密度（tissue mineral density，TMD）、骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD）及组织矿含量（tissue mineral content，TMC）。然后，将CT扫描原始数据导入Mimics10.1软件，进行三维重建，观察各组异位成骨情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 rhBMP-2/CS/DS复合微球观察
扫描电镜观察示，制备的rhBMP-2/CS/DS复合微球球形较规整，分散较均匀，无团聚，微球表面较光滑（图 1）。微球体外释放rhBMP-2于2 h后出现1个突释放期，2 d时释放值达峰值，之后缓慢下降，释放周期约20 d（图 2）。
图1
rhBMP-2/CS/DS复合微球扫描电镜观察（×50 k） 图 2 rhBMP-2/CS/DS复合微球缓释曲线
Figure1.
Scanning electron microscope observation of rhBMP-2/CS/DS microspheres (×50 k) Fig. 2 rhBMP-2 release profiles for rhBMP-2/CS/DS microspheres
2.2 植入实验观察
2.2.1 一般情况
术后各组大鼠均存活至实验完成，大鼠活动、进食正常，切口愈合良好，无红肿、渗液等。
2.2.2 micro-CT检测及三维重建
术后各时间点，A、B组CT扫描均未见放射性显影，三维重建未发现成骨。C、D组术后4周，可见少量模糊放射性显影，密度较低，三维重建见少量骨组织形成；8周时，放射性显影较4周增多，且密度稍高，三维重建可见一椭圆形骨组织块；12、16周时，可见明显大量蜂窝状放射性显影，骨截面边缘密度较高，中央密度稍低，三维重建可见较多骨组织形成。各时间点两组放射性显影强度及三维重建骨组织均逐渐增加，且D组放射性显影强度及三维重建骨体积均大于C组。见图 3、4。
图3
术后各时间点各组micro-CT观察箭头示放射性显影从左至右分别为A、B、C、D组 ⓐ 术后4周 ⓑ 术后8周 ⓒ 术后12周 ⓓ 术后16周
Figure3.
Micro-CT observation of 4 groups at each time point after operation Arrow indicated the radioautography From left to right for groups A, B, C, and D ⓐ At 4 weeks after operation ⓑ At 8 weeks after operation ⓒ At 12 weeks after operation ⓓ At 16 weeks after operation
图4
术后各时间点各组三维重建观察从左至右分别为A、B、C、D组 ⓐ 术后4周 ⓑ 术后8周 ⓒ 术后12周 ⓓ 术后16周 图 5术后各时间点C、D组骨组织参数 ⓐ TMD ⓑ BVF ⓒ Tb.Th ⓓ Tb.N ⓔ BMD ⓕ TMC
Figure4.
Three dimensional reconstruction observation of ectopic bone formation at each time point after operation From left to right for groups A, B, C, and D ⓐ At 4 weeks after operation ⓑ At 8 weeks after operation ⓒ At 12 weeks after operation ⓓ At 16 weeks after operation Fig. 5 Bone tissue parameters of groups C and D at each time point after operation ⓐ TMD ⓑ BVF ⓒ Tb.Th ⓓ Tb.N ⓔ BMD ⓕ TMC
各时间点A、B组TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD及TMC均为0。随着时间延长，异位成骨形成，C、D组TMD、BVF、Tb.Th、BMD及TMC均呈总体增加趋势，Tb.N 12周时达峰值、之后降低；各时间点与A、B组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。C、D组间比较，4周时以上骨组织参数比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；8～16周时D组显著高于C组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。
3 讨论
本研究旨在通过异位成骨实验来验证rhBMP-2/CS/DS复合微球的成骨诱导效应。对于异位成骨观测方法的选择，有学者采用micro-CT扫描观察硫醇化的CS支架负载BMP-2的异位成骨效果，并通过异位成骨扫描结果来分析骨增生情况[12]。micro-CT扫描具有无创性，已被广泛用于定量测定骨三维微结构及组织工程骨[13-14]。我们认为与X线检查相比，micro-CT扫描可更清晰观察到异位成骨情况。而且micro-CT扫描获得的断层平面，通过Mimics软件进行三维重建后，除能清楚显示异位成骨情况外，还能测量相关骨组织参数，进行定量分析，结果具有较高的精确性。
本研究结果显示：C、D组术后4周仅见少量模糊低密度放射性显影，三维重建见少量骨组织，这可能是因为rhBMP-2从CS/DS微球释放需要一定时间，故成骨效果较缓慢。随着时间延长，C、D组放射性显影强度和骨组织参数均逐渐增加，三维重建显示有椭圆形骨块形成且体积不断增加，各时间点D组放射性显影强度、骨块体积均大于C组，与之对应的TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD、TMC也显著高于C组，提示存在异位成骨不断增加的过程。但值得注意的是，从12周开始D组Tb.N逐渐减少，这可能与骨组织内部骨小梁逐渐吸收有关。另外，各时间点各组micro-CT扫描图片显示骨块外层为高密度放射性显影，而骨块内层放射性显影密度较低，这是由于外层骨组织逐渐塑形成为皮质骨导致。植入后异位新生骨从疏松骨小梁形成椭圆形组织块，12周后内部Tb.N逐渐减少，外部钙化加强，骨质改建，与检测得到的TMC和TMD总体呈上升趋势相吻合。Tb.Th持续增加则更加充分地说明了骨小梁的进一步改建。
综上述，CS/DS载体负载rhBMP-2后的成骨诱导能力强于单独rhBMP-2，这与rhBMP-2/CS/DS复合微球高载药率结果[8]相互印证。分析原因可能是由于DS与BMP-2有肝素结合位点，能广泛结合，且CS带正电荷[15]、DS带负电荷[16]，二者可以形成聚合物[15, 17]，CS/DS微球作为载体使rhBMP-2在动物体内缓释时间延长，提高了蛋白的包封率和载药率，从而提高rhBMP-2的成骨效能。结合前期实验[18]得到的rhBMP-2/CS/DS复合微球无毒性，生物相容性良好，载药率、包封率满意的结论，以及与其他载体材料相比，具有制作简便、成本较低等明显优势，提示rhBMP-2/CS/DS复合微球在骨组织工程领域具有较好的应用前景。
骨诱导是近年来骨缺损领域的研究热点。1965年Urist首次发现BMP是具有单独诱导成骨能力的细胞生长因子[1]，其中BMP-2诱导成骨能力最强[2-3]。目前研究已明确，BMP-2具有在动物体内诱导异位骨形成的作用[4-5]。但是BMP-2半衰期短，容易代谢流失，不能维持足够浓度，通过缓释载体技术可有效解决这一问题。研究表明，载药微球具有能控制药物释放速度、降低药物毒副作用、提高疏水性药物对细胞膜的通透性、改善药物的稳定性和改变给药途径、延长药物疗效以及靶向给药等优点[6]。有学者用壳聚糖（chitosan，CS）载体包裹重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）制备了CS/rhBMP-2微球[7]，载药率为（33.437±2.290）μg/mg，但实验中发现CS载体与rhBMP-2黏附效果不佳。本课题组前期实验在CS/rhBMP-2微球基础上引入硫酸葡聚糖（dextran sulfate，DS），构建rhBMP-2/CS/DS复合微球，实验显示该复合微球细胞相容性较好，载药率高，并初步显示出良好的骨诱导效果[8]。异位成骨实验已广泛用于验证BMP-2及BMP-2微球的骨诱导能力[9]，可有效避免原位宿主骨的干扰因素，是国际上检测骨替代材料性能的常用评价手段[10-11]。为此，本次实验选取SD大鼠进行异位成骨实验，采用micro-CT扫描并行骨组织参数检测，进一步分析探讨rhBMP-2/CS/DS复合微球的异位成骨能力。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6～8周龄SPF级雄性SD大鼠48只，体质量140～160 g，由广州军区广州总医院动物实验中心提供。CS（分子量为50 000～190 000、脱乙酰度85%）、DS（分子量为500 000、硫含量40%～50%）（Sigma公司，美国）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；ZnSO4（天津化学试剂公司）；NaOH（广州化学试剂厂）；0.22μm、0.45μm滤过膜（Millipre公司，美国）；ALP试剂盒、钙离子检测试剂盒（南京建成生物技术有限公司）。
JB-2型恒温磁力搅拌器（上海雷磁仪器厂）；DJ-300S型电子天平（SHINKO公司，日本）；LGZ-12型低温负压冻干机（北京松源华兴仪器公司）；DUPONT0-RC5C型高速冷冻台式离心机（Thermo Fisher公司，美国）；S-4800扫描电镜（Hitachi公司，日本）；micro-CT（GE公司，美国）；Mimics10.1软件（Materalise公司，比利时）。
1.2 微球制备及观测
1.2.1 CS/DS微球制备
取CS溶于0.175%乙酸中，配制成1 mg/mL CS溶液；用0.45μm和0.22 μm滤过膜依次过滤；取DS溶于双蒸水，配置1 mg/mL DS溶液，用0.45μm和0.22μm滤过膜依次过滤。取0.2 mL DS溶液，加入0.12 mL CS溶液，在1 500 r/min转速下搅拌5 min后，加入0.1 mL ZnSO4，继续搅拌30 min，加入5%甘露醇后将微球移至离心管中；4℃，以离心半径6 cm、15 000 r/min离心15 min，弃上清液；同上法离心3次后冻干。用3 000 Gy 60Co辐照消毒后，密封，4℃保存备用。
1.2.2 rhBMP-2/CS/DS复合微球制备
CS及DS溶液配制同1.2.1方法。取0.2 mL DS溶液加入0.04 mL rhBMP-2，在1 500 r/min转速下搅拌20 min后，加入0.12 mL CS溶液，5 min后加入0.1 mL ZnSO4，继续搅拌30 min，加入5%甘露醇后将微球移至离心管中；4℃，以离心半径6 cm、15 000 r/min离心15 min，弃上清液；同上法离心3次后冻干。用3 000 Gy 60Co辐照消毒后，密封，4℃保存备用。
1.2.3 观测指标
①扫描电镜观察：取rhBMP-2/CS/DS复合微球，用蒸馏水稀释后均匀滴于载玻片上，冷冻干燥后扫描电镜下观察微球形态。②体外缓释检测：取rhBMP-2/CS/DS复合微球（n=3），按照ELISA法于2、6、12、18、24、48、72 h，之后每隔3 d检测上清液中rhBMP-2含量，观测终点为20 d，绘制缓释曲线。
1.3 实验分组及方法
将48只SD大鼠采用随机数字表法分为A、B、C、D 4组（n=12）。4组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，于左后肢大腿作长约1.5 cm切口，制备股四头肌肌袋模型。A、B、C、D组肌袋肌间隙中分别植入相同体积明胶海绵、CS/DS微球（粉末状）、rhBMP-2（粉末状，0.25 mg）、rhBMP-2/CS/DS复合微球（粉末状，含rhBMP-2 0.25 mg），逐层缝合切口。术后分笼正常喂养，自由进食、饮水；3 d内每天腹腔注射青霉素（5 mg/kg）抗感染。
1.3.1 一般情况
术后观察大鼠存活情况，以及并发症（如切口感染、红肿、渗液等）发生情况。
1.3.2 micro-CT检测及三维重建
术后4、8、12、16周，各组分别取3只大鼠脱颈处死。按照原切口入路切取异位骨化组织块行micro-CT扫描。扫描参数：扫描分辨率21μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kV，电流80μA，曝光时间3 000 ms，帧平均数为4，像素组合为1×1。扫描完成后，于micro-CT中检测以下参数：组织骨密度（tissue mineral density，TMD）、骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD）及组织矿含量（tissue mineral content，TMC）。然后，将CT扫描原始数据导入Mimics10.1软件，进行三维重建，观察各组异位成骨情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 rhBMP-2/CS/DS复合微球观察
扫描电镜观察示，制备的rhBMP-2/CS/DS复合微球球形较规整，分散较均匀，无团聚，微球表面较光滑（图 1）。微球体外释放rhBMP-2于2 h后出现1个突释放期，2 d时释放值达峰值，之后缓慢下降，释放周期约20 d（图 2）。
图1
rhBMP-2/CS/DS复合微球扫描电镜观察（×50 k） 图 2 rhBMP-2/CS/DS复合微球缓释曲线
Figure1.
Scanning electron microscope observation of rhBMP-2/CS/DS microspheres (×50 k) Fig. 2 rhBMP-2 release profiles for rhBMP-2/CS/DS microspheres
2.2 植入实验观察
2.2.1 一般情况
术后各组大鼠均存活至实验完成，大鼠活动、进食正常，切口愈合良好，无红肿、渗液等。
2.2.2 micro-CT检测及三维重建
术后各时间点，A、B组CT扫描均未见放射性显影，三维重建未发现成骨。C、D组术后4周，可见少量模糊放射性显影，密度较低，三维重建见少量骨组织形成；8周时，放射性显影较4周增多，且密度稍高，三维重建可见一椭圆形骨组织块；12、16周时，可见明显大量蜂窝状放射性显影，骨截面边缘密度较高，中央密度稍低，三维重建可见较多骨组织形成。各时间点两组放射性显影强度及三维重建骨组织均逐渐增加，且D组放射性显影强度及三维重建骨体积均大于C组。见图 3、4。
图3
术后各时间点各组micro-CT观察箭头示放射性显影从左至右分别为A、B、C、D组 ⓐ 术后4周 ⓑ 术后8周 ⓒ 术后12周 ⓓ 术后16周
Figure3.
Micro-CT observation of 4 groups at each time point after operation Arrow indicated the radioautography From left to right for groups A, B, C, and D ⓐ At 4 weeks after operation ⓑ At 8 weeks after operation ⓒ At 12 weeks after operation ⓓ At 16 weeks after operation
图4
术后各时间点各组三维重建观察从左至右分别为A、B、C、D组 ⓐ 术后4周 ⓑ 术后8周 ⓒ 术后12周 ⓓ 术后16周 图 5术后各时间点C、D组骨组织参数 ⓐ TMD ⓑ BVF ⓒ Tb.Th ⓓ Tb.N ⓔ BMD ⓕ TMC
Figure4.
Three dimensional reconstruction observation of ectopic bone formation at each time point after operation From left to right for groups A, B, C, and D ⓐ At 4 weeks after operation ⓑ At 8 weeks after operation ⓒ At 12 weeks after operation ⓓ At 16 weeks after operation Fig. 5 Bone tissue parameters of groups C and D at each time point after operation ⓐ TMD ⓑ BVF ⓒ Tb.Th ⓓ Tb.N ⓔ BMD ⓕ TMC
各时间点A、B组TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD及TMC均为0。随着时间延长，异位成骨形成，C、D组TMD、BVF、Tb.Th、BMD及TMC均呈总体增加趋势，Tb.N 12周时达峰值、之后降低；各时间点与A、B组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。C、D组间比较，4周时以上骨组织参数比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；8～16周时D组显著高于C组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。
3 讨论
本研究旨在通过异位成骨实验来验证rhBMP-2/CS/DS复合微球的成骨诱导效应。对于异位成骨观测方法的选择，有学者采用micro-CT扫描观察硫醇化的CS支架负载BMP-2的异位成骨效果，并通过异位成骨扫描结果来分析骨增生情况[12]。micro-CT扫描具有无创性，已被广泛用于定量测定骨三维微结构及组织工程骨[13-14]。我们认为与X线检查相比，micro-CT扫描可更清晰观察到异位成骨情况。而且micro-CT扫描获得的断层平面，通过Mimics软件进行三维重建后，除能清楚显示异位成骨情况外，还能测量相关骨组织参数，进行定量分析，结果具有较高的精确性。
本研究结果显示：C、D组术后4周仅见少量模糊低密度放射性显影，三维重建见少量骨组织，这可能是因为rhBMP-2从CS/DS微球释放需要一定时间，故成骨效果较缓慢。随着时间延长，C、D组放射性显影强度和骨组织参数均逐渐增加，三维重建显示有椭圆形骨块形成且体积不断增加，各时间点D组放射性显影强度、骨块体积均大于C组，与之对应的TMD、BVF、Tb.Th、Tb.N、BMD、TMC也显著高于C组，提示存在异位成骨不断增加的过程。但值得注意的是，从12周开始D组Tb.N逐渐减少，这可能与骨组织内部骨小梁逐渐吸收有关。另外，各时间点各组micro-CT扫描图片显示骨块外层为高密度放射性显影，而骨块内层放射性显影密度较低，这是由于外层骨组织逐渐塑形成为皮质骨导致。植入后异位新生骨从疏松骨小梁形成椭圆形组织块，12周后内部Tb.N逐渐减少，外部钙化加强，骨质改建，与检测得到的TMC和TMD总体呈上升趋势相吻合。Tb.Th持续增加则更加充分地说明了骨小梁的进一步改建。
综上述，CS/DS载体负载rhBMP-2后的成骨诱导能力强于单独rhBMP-2，这与rhBMP-2/CS/DS复合微球高载药率结果[8]相互印证。分析原因可能是由于DS与BMP-2有肝素结合位点，能广泛结合，且CS带正电荷[15]、DS带负电荷[16]，二者可以形成聚合物[15, 17]，CS/DS微球作为载体使rhBMP-2在动物体内缓释时间延长，提高了蛋白的包封率和载药率，从而提高rhBMP-2的成骨效能。结合前期实验[18]得到的rhBMP-2/CS/DS复合微球无毒性，生物相容性良好，载药率、包封率满意的结论，以及与其他载体材料相比，具有制作简便、成本较低等明显优势，提示rhBMP-2/CS/DS复合微球在骨组织工程领域具有较好的应用前景。
