引用本文： 谭伟伟, 何升华, 孙志涛, 王业广, 王建, 赖居易. 微创针刺旋切制备兔椎间盘退变模型. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(3): 343-347. doi: 10.7507/1002-1892.20160067 复制
腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是骨科常见病、多发病，以一侧下肢疼痛麻木或腰部疼痛为主要临床症状，多认为是椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）引起髓核突出，从而压迫神经产生症状，但对于IDD的确切发生机制目前尚未明确。因此，需要通过一种安全有效的IDD动物模型来研究相关病变机制。但目前对IDD动物模型建立方法尚未达成共识，近年多采用纤维环穿刺法和穿刺后抽吸髓核组织法，均存在一些不足[1-3]。我们设计了微创针刺旋切建立兔IDD模型的方法，本次实验旨在探讨该方法可行性，以期为研究LDH病变机制提供一种新的造模方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量（2.9±0.3）kg，MRI检查椎间盘均正常，由广州中医药大学实验动物中心提供。利多卡因注射液（山西晋新双鹤药业有限责任公司）；戊巴比妥钠（Sigma公司，美国）；注射用生理盐水（安徽丰源药业股份有限公司）；注射用青霉素钠（广州白云山天心制药股份有限公司）；Masson染色试剂盒（上海博谷生物科技有限公司）；甲醛液（上海泸震实业有限公司）；番红O染色液（北京索莱宝科技有限公司）。18G穿刺针、C臂X线机（ZIEM公司，德国）。
1.2 实验分组及方法
将实验动物随机分为2组，每组20只。实验组采用微创穿刺后旋切髓核组织建立IDD模型，具体步骤：动物四肢固定后俯卧于桌面上，软垫垫高腹部，一侧下肢肌肉注射青霉素钠（40万U/只）预防感染。于髂嵴最高点平L7棘突，定位L4、L5、L6棘突及关节突，局麻后取18G穿刺针以右外侧约45°角度进针，C臂X线机透视下经椎间盘后外侧刺入L4、5、L5、6椎间隙，针尖位于髓核内；采用针体旋转法带动针尖旋切髓核组织，顺、逆时针旋转360°各1次，以促使其退变。退出穿刺针、消毒，动物常规饲养。对照组不作任何处理。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验组动物术后存活情况以及精神状态、四肢活动度。
1.3.2 MRI观察
术前及术后4、8、12、16周每组各取10只动物行MRI检测。具体方法：观察前禁食、水24 h，动物肌肉注射3%戊巴比妥钠（1.2 mL/kg）麻醉，四肢固定于木板上（耳内塞入少许棉花以减少MRI噪声的刺激），行MRI观察。T2加权像：脉冲重复间隔时间/回波时间3 000 ms/125 ms，层厚2 mm，层间距1 mm。以Pfirrmann分级法[4]评价椎间盘退变程度。
1.3.3 大体及组织学观察
术后各时间点MRI观察后，各组随机取2只动物采用耳缘静脉注射空气处死。取背部正中切口，分离棘突两旁肌肉组织，暴露L1～7棘突及关节突，剪下L1～7整个脊柱，无菌生理盐水冲洗，自腹侧取出整个椎间盘。大体观察髓核组织含水量及颜色、光泽。然后将椎间盘置于甲醛固定，常规脱水包埋，切片，行Masson染色和番红O染色，镜下观察椎间盘纤维环及髓核变化。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。等级资料组间比较采用秩和检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验组所有动物术后均存活，术后2 d四肢活动度好，精神状态较术前未见明显改变。
2.2 MRI观察
对照组MRI T2加权像示观察早期椎间盘信号强度未见明显改变，后期略减弱；实验组椎间盘信号强度随时间延长呈减弱趋势。见图 1。根据Pfirrmann分级法评价椎间盘退变程度显示，随时间延长，两组椎间盘退变程度均逐渐加重，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。两组间比较除术后4周差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余术后各时间点实验组椎间盘退变程度均重于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
图1
术后各时间点两组MRI观察 箭头示实验节段 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周
Figure1.
MRI results of 2 groups at each time point postoperatively Arrow indicated experimental disc ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks
表1
术后各时间点两组Pfirrmann分级比较
Table1.
Pfirrmann grading comparison between 2 groups after operation
2.3 大体观察
术后4周，对照组髓核透亮、含水量丰富，实验组髓核颜色稍暗淡。8、12周时对照组髓核含水量略减少，颜色稍暗淡；实验组髓核含水量明显减少，颜色呈淡黄色。16周时对照组髓核含水量减少，实验组髓核含水量较对照组明显减少，呈干瘪样。
2.4 组织学观察
2.4.1 Masson染色
对照组术后4、8周时椎间盘纤维环是以髓核为中心的同心圆形分层结构，排列整齐；12、16周纤维环出现排列不规整，但分层结构仍完整。实验组术后4周椎间盘纤维环的同心圆形分层结构尚排列规整；8周排列出现部分紊乱，有少量裂隙存在；12周纤维环排列紊乱加重，裂隙增多；16周纤维环排列紊乱程度进一步加重，甚至出现断裂不能连续现象。见图 2。
图2
各时间点两组椎间盘纤维环Masson染色观察（×200）箭头示纤维环排列情况 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周 图 3各时间点两组椎间盘髓核番红O染色观察（×400）箭头示髓核细胞 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周
Figure2.
Masson staining observations of annulus in 2 groups at each time point postoperatively (×200) Arrow indicated the arrangement of the annulus ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks Fig. 3 Safranin O staining observations of nucleus pulposus in 2 groups at each time point postoperatively (×400) Arrow indicated the nucleus pulposus cells ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks
2.4.2 番红O染色
对照组术后4、8、12周椎间盘髓核细胞呈紫红色，分布均匀，染色均一；16周髓核细胞略减少。实验组术后4周椎间盘髓核细胞呈紫红色，分布情况尚可；8周髓核细胞略减少，仍呈紫红色；12周髓核细胞染色变淡，并出现分布不均；16周髓核细胞明显减少，染色更淡。见图 3。
3 讨论
随着人们生活方式的改变，临床上LDH患者急剧增加，并向低龄化发展。因LDH不易治愈，且易反复发作，成为了临床一大难题。对其发病机制，目前多认为是IDD导致髓核突出或脱出，压迫神经根而产生疼痛麻木等不适，亦可能是炎性反应所致，但确切机制尚未明了。动物模型是研究IDD发生机制及LDH发病机制的实验基础，目前制作IDD动物模型的方法主要分为自然退变和实验诱导。自然退变有高盐饮食制造地中海沙鼠IDD模型[5]、采用截除双前肢建立双后肢大鼠IDD模型[6]、随年龄增长椎间盘自发性退变改变[7]等。实验诱导包括改变脊柱力学特性和破坏椎间盘组织模型，具体方法有增加椎体间剪切应力[8]或改变椎间盘血供[9]以促使椎间盘退变，其中以纤维穿刺法较为常用[10-11]。既往多采用腹部切开直视下进行纤维环穿刺破坏，这种方法创伤较大，与人类椎间盘的自然退变不相符，不能体现IDD的客观规律[12-13]。因此，近年来有学者研究通过微创手术建立IDD模型[3, 14]，主要通过针刺后抽吸髓核组织来促使其退变[1-2]，但此方法需将髓核组织部分抽出，不能体现髓核组织的退变过程。
Kim等[15]分别使用16G、18G、21G穿刺针穿刺纤维环制备IDD动物模型，发现21G穿刺针造模后未能引起椎间盘退变，而18G和16G穿刺针穿刺均成功制备模型，提示穿刺针直径会影响模型制备。吴健等[16]采用21G穿刺针穿刺并抽吸部分髓核组织方法成功制备IDD动物模型。本实验采用18G穿刺针穿刺纤维环后，不抽吸髓核组织，而是在C臂X线机定位监测下使穿刺针进入椎间隙，穿过纤维环到达髓核组织，然后旋转针体，使针尖切割髓核组织以促使其退变，术后MRI和组织学观察提示，IDD模型制备成功。我们认为本实验采用的方法解决了切开暴露范围较大的问题，减少了手术时间，减轻对实验动物的创伤，降低死亡率和感染风险。术后实验组动物均存活至实验完成。
正常椎间盘由外围的纤维环、内部的髓核及上、下软骨终板构成。MRI T2加权像能够清晰显示椎间盘信号强度，以反映髓核内的水分及蛋白多糖含量[2]，故临床上常将MRI检测作为诊断IDD的金标准。有研究[3]采用经皮微创穿刺L3、4、L4、5、L5、6纤维环制备兔IDD模型，以自身L2、3、L6、7作对照，处理后4、8、12周行MRI检测，结果也发现造模组椎间盘信号强度明显降低，且随时间延长，降低强度呈加重趋势。参考文献[17]方法，本实验以术后4周作为观察起始点，通过MRI观察术后不同时间点IDD情况。结果显示，随时间延长，实验组椎间盘在MRI T2加权像上信号呈现逐渐降低趋势，而对照组信号强度降低不明显，与以上研究报道结果相同。
本实验选用Masson染色和番红O染色行组织学观察，Masson染色可使胶原纤维、软骨染成蓝色，肌纤维、细胞质染成红色，细胞核染成蓝褐色，可清晰观察纤维环胶原纤维的变化；番红O染色可以反映蛋白聚糖含量及其分布[18-19]。Masson染色示实验组术后4周胶原纤维排列尚整齐，呈同心圆状；8周开始即出现少许紊乱现象，说明椎间盘开始退变；12周时退变进一步加重，纤维环排列紊乱，层次开始模糊不清，裂隙增大增宽；至16周时已无明显分层现象，纤维环胶原纤维甚至断裂，提示退变严重。而对照组纤维环至16周时仍可见同心圆状排列，部分胶原纤维出现小裂隙，提示椎间盘仅有部分退变，与MRI检测结果相符。番红O染色示实验组髓核细胞在术后4周染色仍呈深红色，从8周开始染色逐渐变浅，12、16周染色明显变浅；而对照组至16周才有部分髓核细胞减少。
综上述，C臂X线机引导下采用微创针刺旋切法可成功建立兔IDD模型。其局限在于操作者经皮穿刺纤维环有一定难度，正确穿刺、避免反复操作是减少创伤、降低脊髓神经误伤率和实验动物死亡率的关键。
腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是骨科常见病、多发病，以一侧下肢疼痛麻木或腰部疼痛为主要临床症状，多认为是椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）引起髓核突出，从而压迫神经产生症状，但对于IDD的确切发生机制目前尚未明确。因此，需要通过一种安全有效的IDD动物模型来研究相关病变机制。但目前对IDD动物模型建立方法尚未达成共识，近年多采用纤维环穿刺法和穿刺后抽吸髓核组织法，均存在一些不足[1-3]。我们设计了微创针刺旋切建立兔IDD模型的方法，本次实验旨在探讨该方法可行性，以期为研究LDH病变机制提供一种新的造模方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量（2.9±0.3）kg，MRI检查椎间盘均正常，由广州中医药大学实验动物中心提供。利多卡因注射液（山西晋新双鹤药业有限责任公司）；戊巴比妥钠（Sigma公司，美国）；注射用生理盐水（安徽丰源药业股份有限公司）；注射用青霉素钠（广州白云山天心制药股份有限公司）；Masson染色试剂盒（上海博谷生物科技有限公司）；甲醛液（上海泸震实业有限公司）；番红O染色液（北京索莱宝科技有限公司）。18G穿刺针、C臂X线机（ZIEM公司，德国）。
1.2 实验分组及方法
将实验动物随机分为2组，每组20只。实验组采用微创穿刺后旋切髓核组织建立IDD模型，具体步骤：动物四肢固定后俯卧于桌面上，软垫垫高腹部，一侧下肢肌肉注射青霉素钠（40万U/只）预防感染。于髂嵴最高点平L7棘突，定位L4、L5、L6棘突及关节突，局麻后取18G穿刺针以右外侧约45°角度进针，C臂X线机透视下经椎间盘后外侧刺入L4、5、L5、6椎间隙，针尖位于髓核内；采用针体旋转法带动针尖旋切髓核组织，顺、逆时针旋转360°各1次，以促使其退变。退出穿刺针、消毒，动物常规饲养。对照组不作任何处理。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验组动物术后存活情况以及精神状态、四肢活动度。
1.3.2 MRI观察
术前及术后4、8、12、16周每组各取10只动物行MRI检测。具体方法：观察前禁食、水24 h，动物肌肉注射3%戊巴比妥钠（1.2 mL/kg）麻醉，四肢固定于木板上（耳内塞入少许棉花以减少MRI噪声的刺激），行MRI观察。T2加权像：脉冲重复间隔时间/回波时间3 000 ms/125 ms，层厚2 mm，层间距1 mm。以Pfirrmann分级法[4]评价椎间盘退变程度。
1.3.3 大体及组织学观察
术后各时间点MRI观察后，各组随机取2只动物采用耳缘静脉注射空气处死。取背部正中切口，分离棘突两旁肌肉组织，暴露L1～7棘突及关节突，剪下L1～7整个脊柱，无菌生理盐水冲洗，自腹侧取出整个椎间盘。大体观察髓核组织含水量及颜色、光泽。然后将椎间盘置于甲醛固定，常规脱水包埋，切片，行Masson染色和番红O染色，镜下观察椎间盘纤维环及髓核变化。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。等级资料组间比较采用秩和检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验组所有动物术后均存活，术后2 d四肢活动度好，精神状态较术前未见明显改变。
2.2 MRI观察
对照组MRI T2加权像示观察早期椎间盘信号强度未见明显改变，后期略减弱；实验组椎间盘信号强度随时间延长呈减弱趋势。见图 1。根据Pfirrmann分级法评价椎间盘退变程度显示，随时间延长，两组椎间盘退变程度均逐渐加重，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。两组间比较除术后4周差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余术后各时间点实验组椎间盘退变程度均重于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
图1
术后各时间点两组MRI观察 箭头示实验节段 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周
Figure1.
MRI results of 2 groups at each time point postoperatively Arrow indicated experimental disc ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks
表1
术后各时间点两组Pfirrmann分级比较
Table1.
Pfirrmann grading comparison between 2 groups after operation
2.3 大体观察
术后4周，对照组髓核透亮、含水量丰富，实验组髓核颜色稍暗淡。8、12周时对照组髓核含水量略减少，颜色稍暗淡；实验组髓核含水量明显减少，颜色呈淡黄色。16周时对照组髓核含水量减少，实验组髓核含水量较对照组明显减少，呈干瘪样。
2.4 组织学观察
2.4.1 Masson染色
对照组术后4、8周时椎间盘纤维环是以髓核为中心的同心圆形分层结构，排列整齐；12、16周纤维环出现排列不规整，但分层结构仍完整。实验组术后4周椎间盘纤维环的同心圆形分层结构尚排列规整；8周排列出现部分紊乱，有少量裂隙存在；12周纤维环排列紊乱加重，裂隙增多；16周纤维环排列紊乱程度进一步加重，甚至出现断裂不能连续现象。见图 2。
图2
各时间点两组椎间盘纤维环Masson染色观察（×200）箭头示纤维环排列情况 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周 图 3各时间点两组椎间盘髓核番红O染色观察（×400）箭头示髓核细胞 ⓐ 实验组4周 ⓑ 实验组8周 ⓒ 实验组12周 ⓓ 实验组16周 ⓔ 对照组4周 ⓕ 对照组8周 ⓖ 对照组12周 ⓗ 对照组16周
Figure2.
Masson staining observations of annulus in 2 groups at each time point postoperatively (×200) Arrow indicated the arrangement of the annulus ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks Fig. 3 Safranin O staining observations of nucleus pulposus in 2 groups at each time point postoperatively (×400) Arrow indicated the nucleus pulposus cells ⓐ Experimental group at 4 weeks ⓑ Experimental group at 8 weeks ⓒ Experimental group at 12 weeks ⓓ Experimental group at 16 weeks ⓔ Control group at 4 weeks ⓕ Control group at 8 weeks ⓖ Control group at 12 weeks ⓗ Control group at 16 weeks
2.4.2 番红O染色
对照组术后4、8、12周椎间盘髓核细胞呈紫红色，分布均匀，染色均一；16周髓核细胞略减少。实验组术后4周椎间盘髓核细胞呈紫红色，分布情况尚可；8周髓核细胞略减少，仍呈紫红色；12周髓核细胞染色变淡，并出现分布不均；16周髓核细胞明显减少，染色更淡。见图 3。
3 讨论
随着人们生活方式的改变，临床上LDH患者急剧增加，并向低龄化发展。因LDH不易治愈，且易反复发作，成为了临床一大难题。对其发病机制，目前多认为是IDD导致髓核突出或脱出，压迫神经根而产生疼痛麻木等不适，亦可能是炎性反应所致，但确切机制尚未明了。动物模型是研究IDD发生机制及LDH发病机制的实验基础，目前制作IDD动物模型的方法主要分为自然退变和实验诱导。自然退变有高盐饮食制造地中海沙鼠IDD模型[5]、采用截除双前肢建立双后肢大鼠IDD模型[6]、随年龄增长椎间盘自发性退变改变[7]等。实验诱导包括改变脊柱力学特性和破坏椎间盘组织模型，具体方法有增加椎体间剪切应力[8]或改变椎间盘血供[9]以促使椎间盘退变，其中以纤维穿刺法较为常用[10-11]。既往多采用腹部切开直视下进行纤维环穿刺破坏，这种方法创伤较大，与人类椎间盘的自然退变不相符，不能体现IDD的客观规律[12-13]。因此，近年来有学者研究通过微创手术建立IDD模型[3, 14]，主要通过针刺后抽吸髓核组织来促使其退变[1-2]，但此方法需将髓核组织部分抽出，不能体现髓核组织的退变过程。
Kim等[15]分别使用16G、18G、21G穿刺针穿刺纤维环制备IDD动物模型，发现21G穿刺针造模后未能引起椎间盘退变，而18G和16G穿刺针穿刺均成功制备模型，提示穿刺针直径会影响模型制备。吴健等[16]采用21G穿刺针穿刺并抽吸部分髓核组织方法成功制备IDD动物模型。本实验采用18G穿刺针穿刺纤维环后，不抽吸髓核组织，而是在C臂X线机定位监测下使穿刺针进入椎间隙，穿过纤维环到达髓核组织，然后旋转针体，使针尖切割髓核组织以促使其退变，术后MRI和组织学观察提示，IDD模型制备成功。我们认为本实验采用的方法解决了切开暴露范围较大的问题，减少了手术时间，减轻对实验动物的创伤，降低死亡率和感染风险。术后实验组动物均存活至实验完成。
正常椎间盘由外围的纤维环、内部的髓核及上、下软骨终板构成。MRI T2加权像能够清晰显示椎间盘信号强度，以反映髓核内的水分及蛋白多糖含量[2]，故临床上常将MRI检测作为诊断IDD的金标准。有研究[3]采用经皮微创穿刺L3、4、L4、5、L5、6纤维环制备兔IDD模型，以自身L2、3、L6、7作对照，处理后4、8、12周行MRI检测，结果也发现造模组椎间盘信号强度明显降低，且随时间延长，降低强度呈加重趋势。参考文献[17]方法，本实验以术后4周作为观察起始点，通过MRI观察术后不同时间点IDD情况。结果显示，随时间延长，实验组椎间盘在MRI T2加权像上信号呈现逐渐降低趋势，而对照组信号强度降低不明显，与以上研究报道结果相同。
本实验选用Masson染色和番红O染色行组织学观察，Masson染色可使胶原纤维、软骨染成蓝色，肌纤维、细胞质染成红色，细胞核染成蓝褐色，可清晰观察纤维环胶原纤维的变化；番红O染色可以反映蛋白聚糖含量及其分布[18-19]。Masson染色示实验组术后4周胶原纤维排列尚整齐，呈同心圆状；8周开始即出现少许紊乱现象，说明椎间盘开始退变；12周时退变进一步加重，纤维环排列紊乱，层次开始模糊不清，裂隙增大增宽；至16周时已无明显分层现象，纤维环胶原纤维甚至断裂，提示退变严重。而对照组纤维环至16周时仍可见同心圆状排列，部分胶原纤维出现小裂隙，提示椎间盘仅有部分退变，与MRI检测结果相符。番红O染色示实验组髓核细胞在术后4周染色仍呈深红色，从8周开始染色逐渐变浅，12、16周染色明显变浅；而对照组至16周才有部分髓核细胞减少。
综上述，C臂X线机引导下采用微创针刺旋切法可成功建立兔IDD模型。其局限在于操作者经皮穿刺纤维环有一定难度，正确穿刺、避免反复操作是减少创伤、降低脊髓神经误伤率和实验动物死亡率的关键。
