引用本文： 张凯彬, 石晶, 李杨, 蒋逸秋, 丁朋, 杨晓霏, 桂鉴超. 大鼠软骨非全层损伤模型的建立及活化细胞与整合素β1表达关系的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(4): 432-439. doi: 10.7507/1002-1892.20160087 复制
骨关节炎是临床常见病，随着老龄化社会的到来，其发病率日趋升高。骨关节炎的早期组织改变是从软骨层表面的破坏开始，因此研究软骨的非全层损伤（未及软骨下骨）对骨关节炎的早期诊断和治疗具有重要意义[1]。有研究发现体外培养的软骨组织块表面可见一种不同于软骨细胞表型的软骨前体细胞，其活化可能与软骨损伤有关[2-3]。本研究采用软骨划痕的方法造成大鼠软骨非全层损伤模型，从组织形态学、免疫病理学等角度观察损伤周围软骨基质和细胞变化，并探究细胞活化与整合素β1表达间的关系，从而为骨关节炎的早期诊断和治疗提供新的临床思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级10周龄SD雄性大鼠45只，体质量300～400 g，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心提供。
HE染色试剂盒、番红O染色试剂盒、BrdU、鼠抗BrdU单克隆抗体、FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（南京凯基生物科技发展有限公司）；CD105兔抗鼠单克隆抗体、整合素β1兔抗鼠单克隆抗体（Abcam公司，英国）；0.25%胰蛋白酶、20%EDTA、链霉素、PBS（上海基星试剂公司）。眼科无菌手术刀片（上海浦东金环医疗用品公司）；RM 2135石蜡切片机、EG 1140H包埋机（Leica公司，德国）；光学显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 实验分组及造模方法
随机将45只大鼠分为手术组、假手术组和对照组3 组，每组15只。所有大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手术组和假手术组选取右膝关节，沿髌韧带内侧缘切开长约1 cm皮肤，切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，暴露股骨髁负重区。手术组用手术刀片在两侧股骨髁负重区沿矢状位分别划痕2次，深度以无出血为止（图 1）；假手术组不行划痕。两组髌骨复位及生理盐水清洗伤口后，用5-0可吸收线单独缝合关节囊，5-0丝线间断缝合皮肤。对照组未作任何处理。术后各组立即皮下注射5 mg/mL BrdU 1mL，待大鼠清醒后分笼饲养，让其自由活动及进食。术后腹腔注射青霉素（10万U/只） 抗感染，每天1次，连续注射3 d。
图1
手术组软骨非全层损伤模型造模过程 ⓐ 暴露股骨髁负重区 ⓑ 划痕2次造模 图 2 各组术后各时间点大体观察 ⓐ 手术组1d ⓑ 手术组7 d ⓒ 手术组14 d ⓓ 假手术组1 d ⓔ 假手术组7 d ⓕ 假手术组14 d ⓖ 对照组1 d ⓗ 对照组7 d ⓘ 对照组14 d 图 3 各组术后各时间点组织学观察（HE×400） ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组7 d ⓒ 手术组14 d ⓓ 假手术组7 d ⓔ 对照组14 d
Figure1.
The establishing process of the partial-thickness articular cartilage injury model in operated group ⓐ Exposure of the weight-bearing area of femoral condyle ⓑ Model establishment of two linear cartilage defects using an ophthalmic knife Fig. 2 Macroscopic observation of each group at different time points ⓐ Operated group at 1 day ⓑ Operated group at 7 days ⓒ Operated group at 14 days ⓓ Sham-operated group at 1day ⓔ Sham-operated group at 7 days ⓕ Sham-operated group at 14 days ⓖ Control group at 1 day ⓗ Control group at 7days ⓘ Control group at 14 days Fig. 3 Histological observation of each group at different time points (HE×400) ⓐ Operated group at 1day ⓑ Operated group at 7 days ⓒ Operated group at 14 days ⓓ Sham-operated group at 7 days ⓔ Control group at 14 days
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后观察各组大鼠饮食、活动及伤口等情况。术后1、7、14 d各组分别处死5只大鼠，取右股骨下段，清除右膝关节周围的软组织及韧带，病理取材后大体观察关节面的光滑度及色泽，表面划痕是否明显，划痕周围软骨是否有软化、纤维化，及软骨下骨是否裸露等情况。
1.3.2 组织学观察
取各组各时间点样本，生理盐水冲洗，置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h；5%稀硝酸脱钙3～4 d，70%、80%、90%、100%乙醇逐级脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蜡包埋，沿膝关节横断面切片，制备5 μm厚组织切片。常规行HE染色和番红O染色，光镜下观察。采用改良组织学评分[4]评估HE染色结果，评价各时间点各组软骨损伤情况；每个标本随机选取4个区域，利用Photoshop CS分析软件分析番红O染色切片的灰度值。
1.3.3 免疫荧光染色观察
取各组各时间点切片，脱蜡至水，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min× 3 次。①部分切片加入2 mol/L HCl 50μL，37℃孵育30min，0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次；加入0.25%胰蛋白酶50 μL，37℃孵育10 min，室温下血清封闭10 min；加入鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200），37℃避光孵育30 min；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察BrdU染色情况。②部分切片加入3%H2O2 5min阻断内源性过氧化物酶活性，滴加0.4%胃蛋白酶（pH2）湿盒孵育10 min修复抗原，室温下血清封闭10 min；滴加CD105兔抗鼠单克隆抗体（1∶200）、4℃过夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察CD105染色情况。每张切片随机选取不同的4个区域，采用标准双盲法计数每高倍镜视野阳性细胞，取均值。③部分切片在抗原修复后，同时滴加CD105兔抗鼠单克隆抗体（1∶200）和整合素β1兔抗鼠单克隆抗体（1∶200），4℃过夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察CD105/整合素β1双标记染色情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后30 min～1 h所有大鼠苏醒，能自由活动右下肢，大鼠的饮食、活动、体质量增长等指标正常。术后未见伤口感染及关节肿胀、步态不对称等异常状况，各组均未见大鼠异常死亡。
手术组膝关节滑膜轻度充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈淡蓝白色，划痕明显，划痕周围软骨欠光滑，非透明，有软骨软化、纤维化改变，且随造模时间延长逐渐加重；未见关节面缺损，无骨赘形成。假手术组膝关节滑膜轻度充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈蓝白色透明状，关节面稍粗糙，无软化、纤维化改变，未见裂隙裂纹形成，各时间点基本一致；未见关节面缺损，无骨赘形成。对照组膝关节滑膜未见充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈透明白色，关节面平整，无软化、纤维化改变，未见裂隙裂纹形成；未见软骨面缺损，无骨赘形成。见图 2。
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
手术组在划痕底部见凋亡坏死软骨细胞，划痕周围见细胞数增多，大小不等，排列分布不均，且随造模时间延长逐渐明显；有细胞簇集现象，细胞核染色深浅不一；未划痕处软骨层表面光滑，软骨层变薄，潮线完整。假手术组各时间点均未见凋亡软骨细胞，软骨层变薄，表层完整无缺如，细胞大小均匀，细胞核染色均匀，排列有序，无软骨细胞簇集，潮线规则。对照组各时间点均未见凋亡坏死软骨细胞，细胞大小均匀，排列较整齐呈柱状，层次清楚，无簇集软骨细胞，细胞核染色均匀，潮线完整。见图 3。
手术组术后各时间点改良组织学评分均显著高于假手术组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。各组组内各时间点间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组术后各时间点HE染色改良组织学评分比较（n=5，2.2.2 番红O染色
手术组各时间点染色欠均匀，着色贯穿软骨全层，划痕周围区域着色较浅，随造模时间延长，着色深浅无显著变化；假手术组和对照组各时间点染色均匀，着色贯穿软骨全层，浓度适中，无失染。见图 4。术后各时间点各组间比较以及各组内各时间点间比较灰度值，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
图4
各组术后各时间点组织学观察（番红O×400 ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组14 d ⓒ 假手术组14 d ⓓ 对照组14 d 图 5 各组术后14 d BrdU免疫荧光染色观察（荧光显微镜 ×400） 箭头示BrdU 阳性细胞 ⓐ 手术组 ⓑ 假手术组 ⓒ 对照组 图 6 各组术后14 d CD105免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400） 箭头示CD105阳性细胞 ⓐ 手术组 ⓑ 假手术组 ⓒ 对照组 图 7 各组术后各时间点CD105/整合素β1双荧光标记染色观察（荧光显微镜×400） 箭头示CD105和整合素β1双染标记阳性细胞 ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组14 d ⓒ 假手术组14 d ⓓ 对照组14 d
Figure4.
Histological observation of each group at different time points (Safranin O×400) ⓐ Operated group at 1 day ⓑ Operated group at 14 days ⓒ Sham-operated group at 14 days ⓓ Control group at 14 days Fig. 5 BrdU immunofluorescence staining in 3 groups at 14days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated BrdU-positive cells ⓐ Operated group ⓑ Sham-operated group ⓒ Control group Fig. 6 CD105 immunofluorescence staining in 3 groups at 14 days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105-positive cells ⓐ Operated group ⓑ Sham-operated group ⓒ Control group Fig. 7 CD105/integrin β1 double immunofluorescence staining in 3groups at different time points (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105/integrin β1 double positive cells Operated group at 1day ⓐ Operated group at 14 days ⓑ Sham-operated group at 14 days ⓒ Control group at 14 days
表2
各组术后各时间点番红O染色灰度值比较（n=5，2.3 免疫荧光染色观察
BrdU免疫荧光染色示，手术组可见软骨层绿色荧光反应强烈，划痕周围稍多，有向划痕聚集倾向，阳性细胞排列紊乱、分布不均，随造模时间延长更加显著；假手术组及对照组各时间点绿色荧光反应强烈，无明显聚集现象，阳性细胞排列分布均匀。见图 5。
CD105免疫荧光染色示，手术组在划痕周围有较多颗粒状绿色荧光，阳性细胞聚集、大小不一、分布不均，随造模时间延长细胞聚集现象更加明显，位置与HE染色标本细胞聚集位置基本一致；假手术组及对照组各时间点均见软骨层少量绿色荧光，反应较弱，阳性细胞排列均匀。见图 6。手术组术后各时间点CD105阳性细胞数均显著多于假手术组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。手术组随造模时间延长，CD105阳性细胞数逐渐增多，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组内各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
各组术后各时间点CD105阳性细胞数比较（n=5，个/HP ，CD105/整合素β1双荧光标记染色示，手术组有大量细胞共表达CD105和整合素β1，以划痕周围处明显，双染标记阳性细胞大小不一、分布不均，随造模时间延长阳性细胞聚集现象更加明显。假手术组和对照组各时间点均未观察到双染标记阳性细胞。见图 7。
3 讨论
本研究在大鼠膝关节软骨上运用刀片划痕实验建立了关节软骨非全层损伤动物模型，并通过HE染色、番红O染色、BrdU、CD105、CD105/整合素β1免疫荧光染色等方法，评估了划痕周围软骨的宏观改变和组织学变化，以及划痕周围细胞的某些分子学标志物表达特征。通过大体观察发现划痕周围软骨欠光滑，有软化和纤维化改变；HE组织学染色发现划痕周围有细胞簇集现象，细胞分布不均，改良组织学评分随造模时间延长未发生显著变化，说明损伤的软骨未得到修复。关节软骨属于透明软骨，是一种特殊的结缔组织，软骨内无血管、淋巴管和神经，其营养主要由滑液供应，这些结构特点决定了其损伤后自愈能力有限[5]。关节软骨损伤根据损伤深度分为穿透软骨下骨的骨软骨损伤（软骨全层损伤）和局限于软骨内的部分软骨损伤（软骨非全层损伤）。Namba等[6]研究发现，在胚胎羊膝关节软骨造成深度为100 μm的表浅损伤，出生时已形成透明软骨修复。而对于成年动物，未穿透软骨下骨的部分软骨损伤仅引起机体局限的损伤反应，关节软骨不能得到修复[7]。本实验结果与既往研究结论相符，即在成年动物上未观察到关节软骨损伤后的明显修复。Sandell[8]发现轻度骨性关节炎时会出现软骨细胞代谢活跃导致细胞簇集现象。本实验中发现的划痕周围细胞簇集现象提示划痕造成的软骨损伤活化了某些细胞，引起局部细胞簇集。番红O染色灰度值分析显示3组组间和组内各时间点间比较，差异均无统计学意义。正常关节软骨内蛋白多糖主要分布于软骨基质内，软骨囊区染色最深。关节软骨番红O染色后，蛋白多糖的变化主要表现为染色程度的变化，着色深浅用平均灰度值，在分析软件上染色程度越深，其灰度值越低[9]。因此番红O染色结果提示，划痕损伤并未造成软骨基质的改变，发生的划痕周围细胞活化和簇集现象可能与软骨基质的关系不密切。
BrdU是一种人工合成的核苷酸类似物，常用于标记活体组织的增殖细胞。其结构类似于胸腺嘧啶，在细胞分裂的S期可取代胸腺嘧啶插入正在复制的细胞DNA中[10-11]。通过免疫组织化学方法，用BrdU抗体检测整合在细胞DNA中的BrdU分子，可以反映出细胞周期的活力。本实验中BrdU免疫荧光染色结果显示在划痕损伤周围有大量阳性细胞聚集，提示这些细胞处于增殖活跃状态。
本实验CD105免疫荧光染色显示，划痕周围有较多CD105阳性细胞，手术组CD105阳性细胞数多于假手术组和对照组，且随造模时间延长，划痕周围的CD105阳性细胞数逐渐增多。CD105是一种前体细胞标志物，研究发现软骨组织中CD105阳性细胞有软骨分化潜能[12-14]。有研究发现[3]，在体外培养的软骨组织块表面可见一种不同于软骨细胞表型的软骨前体细胞。软骨前体细胞一般存在于软骨层表面，Seol等[11]发现在软骨损伤和软骨细胞死亡时，软骨前体细胞会激活并迁徙至受损区域，在软骨全层损伤模型中很可能参与其修复过程。因此我们推测本实验中观察到的损伤部位周围的活化细胞可能是软骨前体细胞，而在假手术组未观察到大量阳性细胞，表明该细胞的活化与软骨膜损伤及周围组织炎症关系不大，而只与软骨层的破坏损伤有关。但还需要进一步分离和培养细胞，并进行体外分化实验来确认活化细胞是软骨前体细胞。
本实验CD105和整合素β1免疫双荧光标记结果显示，在划痕损伤周围有双标阳性细胞，而假手术组和对照组未观察到双标阳性细胞。整合素是黏附分子中的一类，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质黏附的一类细胞膜表面的糖蛋白，由不同的α与β亚单位组成，是许多细胞增生和迁移的基础。研究表明，软骨细胞中表达的整合素包括以胶原为配体的α1β1、α2β1、α10β1、α11β1，以纤维粘连蛋白为配体的α5β1、αVβ3、αVβ5。其中与胶原结合的整合素均含有β1亚基，且绝大多数β1亚基参与形成了以胶原为配体的整合素[15-17]。研究报道，许多激活的干细胞表面整合素β1的表达量上升，例如造血干细胞、表皮干细胞、BMSCs等[1, 18-21]；整合素β1的表达上升使其能够快速介导活化的干细胞与周围基质中的蛋白成分结合，进而促进干细胞增殖分化，以适应应激状态或组织损伤[22-23]。Zwolanek等[16]通过体外实验研究得出结论，整合素β1能介导BMSCs与细胞外基质中胶原的黏附作用，尤其是Ⅱ型胶原；运用单克隆整合素β1封闭抗体，能够抑制BMSCs与细胞外基质中的胶原结合，从而阻断整合素介导的信号传导过程，抑制细胞发挥生物学作用。
因此我们认为，划痕造成的软骨损伤激活了某些细胞，使其细胞膜上的整合素β1表达升高，进而介导活化细胞的黏附作用，促进其增殖分化，以适应损伤后的应激状态，这与Gottschling等[1]的研究结论相符。此外我们可以推断与BMSCs类似，整合素β1作为可能的软骨前体细胞膜表面重要的蛋白，能够介导细胞与细胞外基质中胶原的黏附，从而促进增殖分化及发挥生物学作用。当然，还需要进一步研究证实整合素β1对细胞功能的调节机制。尽管如此，本实验结果提示可通过早期检测整合素β1的高表达，发现软骨损伤早期某些细胞的活化；并结合其他诊断指标和方法，如Ⅱ型胶原羧基端端肽[24]，为早期诊断骨性关节炎提供线索。此外，将来对整合素β1调节细胞和细胞外基质黏附机制的深入研究，将有助于软骨损伤修复方法的发展和进步。
综上述，划痕造成的软骨非全层损伤不能得到完整修复，但引发了损伤病灶周围的细胞改变，包括软骨细胞的坏死和某些细胞的活化，这些活化细 胞 增殖活跃，表达前体细胞标志物CD105以及整合素β1；而细胞的活化与软骨基质的改变和周围组织炎症关系不大。本研究为软骨缺损的治疗及骨性关节炎的早期发现提供了新的临床思路及线索。但本研究还有一些局限，例如关于整合素β1介导活化细胞与细胞外基质的黏附作用机制，以及相关信号通路还不清楚；并且需要进行更深入的体外研究，证实划痕导致的活化细胞是软骨前体细胞。
骨关节炎是临床常见病，随着老龄化社会的到来，其发病率日趋升高。骨关节炎的早期组织改变是从软骨层表面的破坏开始，因此研究软骨的非全层损伤（未及软骨下骨）对骨关节炎的早期诊断和治疗具有重要意义[1]。有研究发现体外培养的软骨组织块表面可见一种不同于软骨细胞表型的软骨前体细胞，其活化可能与软骨损伤有关[2-3]。本研究采用软骨划痕的方法造成大鼠软骨非全层损伤模型，从组织形态学、免疫病理学等角度观察损伤周围软骨基质和细胞变化，并探究细胞活化与整合素β1表达间的关系，从而为骨关节炎的早期诊断和治疗提供新的临床思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级10周龄SD雄性大鼠45只，体质量300～400 g，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心提供。
HE染色试剂盒、番红O染色试剂盒、BrdU、鼠抗BrdU单克隆抗体、FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（南京凯基生物科技发展有限公司）；CD105兔抗鼠单克隆抗体、整合素β1兔抗鼠单克隆抗体（Abcam公司，英国）；0.25%胰蛋白酶、20%EDTA、链霉素、PBS（上海基星试剂公司）。眼科无菌手术刀片（上海浦东金环医疗用品公司）；RM 2135石蜡切片机、EG 1140H包埋机（Leica公司，德国）；光学显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 实验分组及造模方法
随机将45只大鼠分为手术组、假手术组和对照组3 组，每组15只。所有大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手术组和假手术组选取右膝关节，沿髌韧带内侧缘切开长约1 cm皮肤，切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，暴露股骨髁负重区。手术组用手术刀片在两侧股骨髁负重区沿矢状位分别划痕2次，深度以无出血为止（图 1）；假手术组不行划痕。两组髌骨复位及生理盐水清洗伤口后，用5-0可吸收线单独缝合关节囊，5-0丝线间断缝合皮肤。对照组未作任何处理。术后各组立即皮下注射5 mg/mL BrdU 1mL，待大鼠清醒后分笼饲养，让其自由活动及进食。术后腹腔注射青霉素（10万U/只） 抗感染，每天1次，连续注射3 d。
图1
手术组软骨非全层损伤模型造模过程 ⓐ 暴露股骨髁负重区 ⓑ 划痕2次造模 图 2 各组术后各时间点大体观察 ⓐ 手术组1d ⓑ 手术组7 d ⓒ 手术组14 d ⓓ 假手术组1 d ⓔ 假手术组7 d ⓕ 假手术组14 d ⓖ 对照组1 d ⓗ 对照组7 d ⓘ 对照组14 d 图 3 各组术后各时间点组织学观察（HE×400） ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组7 d ⓒ 手术组14 d ⓓ 假手术组7 d ⓔ 对照组14 d
Figure1.
The establishing process of the partial-thickness articular cartilage injury model in operated group ⓐ Exposure of the weight-bearing area of femoral condyle ⓑ Model establishment of two linear cartilage defects using an ophthalmic knife Fig. 2 Macroscopic observation of each group at different time points ⓐ Operated group at 1 day ⓑ Operated group at 7 days ⓒ Operated group at 14 days ⓓ Sham-operated group at 1day ⓔ Sham-operated group at 7 days ⓕ Sham-operated group at 14 days ⓖ Control group at 1 day ⓗ Control group at 7days ⓘ Control group at 14 days Fig. 3 Histological observation of each group at different time points (HE×400) ⓐ Operated group at 1day ⓑ Operated group at 7 days ⓒ Operated group at 14 days ⓓ Sham-operated group at 7 days ⓔ Control group at 14 days
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后观察各组大鼠饮食、活动及伤口等情况。术后1、7、14 d各组分别处死5只大鼠，取右股骨下段，清除右膝关节周围的软组织及韧带，病理取材后大体观察关节面的光滑度及色泽，表面划痕是否明显，划痕周围软骨是否有软化、纤维化，及软骨下骨是否裸露等情况。
1.3.2 组织学观察
取各组各时间点样本，生理盐水冲洗，置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h；5%稀硝酸脱钙3～4 d，70%、80%、90%、100%乙醇逐级脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蜡包埋，沿膝关节横断面切片，制备5 μm厚组织切片。常规行HE染色和番红O染色，光镜下观察。采用改良组织学评分[4]评估HE染色结果，评价各时间点各组软骨损伤情况；每个标本随机选取4个区域，利用Photoshop CS分析软件分析番红O染色切片的灰度值。
1.3.3 免疫荧光染色观察
取各组各时间点切片，脱蜡至水，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min× 3 次。①部分切片加入2 mol/L HCl 50μL，37℃孵育30min，0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次；加入0.25%胰蛋白酶50 μL，37℃孵育10 min，室温下血清封闭10 min；加入鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200），37℃避光孵育30 min；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察BrdU染色情况。②部分切片加入3%H2O2 5min阻断内源性过氧化物酶活性，滴加0.4%胃蛋白酶（pH2）湿盒孵育10 min修复抗原，室温下血清封闭10 min；滴加CD105兔抗鼠单克隆抗体（1∶200）、4℃过夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01mol/ L PBS（pH7.4）漂洗5min×3 次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察CD105染色情况。每张切片随机选取不同的4个区域，采用标准双盲法计数每高倍镜视野阳性细胞，取均值。③部分切片在抗原修复后，同时滴加CD105兔抗鼠单克隆抗体（1∶200）和整合素β1兔抗鼠单克隆抗体（1∶200），4℃过夜；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5 min×3次，滴加二抗FITC标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG（1∶100），37℃避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗5min×3次，防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察CD105/整合素β1双标记染色情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后30 min～1 h所有大鼠苏醒，能自由活动右下肢，大鼠的饮食、活动、体质量增长等指标正常。术后未见伤口感染及关节肿胀、步态不对称等异常状况，各组均未见大鼠异常死亡。
手术组膝关节滑膜轻度充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈淡蓝白色，划痕明显，划痕周围软骨欠光滑，非透明，有软骨软化、纤维化改变，且随造模时间延长逐渐加重；未见关节面缺损，无骨赘形成。假手术组膝关节滑膜轻度充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈蓝白色透明状，关节面稍粗糙，无软化、纤维化改变，未见裂隙裂纹形成，各时间点基本一致；未见关节面缺损，无骨赘形成。对照组膝关节滑膜未见充血增生，无纤维素性渗出，滑液分泌量正常，透明；软骨呈透明白色，关节面平整，无软化、纤维化改变，未见裂隙裂纹形成；未见软骨面缺损，无骨赘形成。见图 2。
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
手术组在划痕底部见凋亡坏死软骨细胞，划痕周围见细胞数增多，大小不等，排列分布不均，且随造模时间延长逐渐明显；有细胞簇集现象，细胞核染色深浅不一；未划痕处软骨层表面光滑，软骨层变薄，潮线完整。假手术组各时间点均未见凋亡软骨细胞，软骨层变薄，表层完整无缺如，细胞大小均匀，细胞核染色均匀，排列有序，无软骨细胞簇集，潮线规则。对照组各时间点均未见凋亡坏死软骨细胞，细胞大小均匀，排列较整齐呈柱状，层次清楚，无簇集软骨细胞，细胞核染色均匀，潮线完整。见图 3。
手术组术后各时间点改良组织学评分均显著高于假手术组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。各组组内各时间点间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组术后各时间点HE染色改良组织学评分比较（n=5，2.2.2 番红O染色
手术组各时间点染色欠均匀，着色贯穿软骨全层，划痕周围区域着色较浅，随造模时间延长，着色深浅无显著变化；假手术组和对照组各时间点染色均匀，着色贯穿软骨全层，浓度适中，无失染。见图 4。术后各时间点各组间比较以及各组内各时间点间比较灰度值，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
图4
各组术后各时间点组织学观察（番红O×400 ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组14 d ⓒ 假手术组14 d ⓓ 对照组14 d 图 5 各组术后14 d BrdU免疫荧光染色观察（荧光显微镜 ×400） 箭头示BrdU 阳性细胞 ⓐ 手术组 ⓑ 假手术组 ⓒ 对照组 图 6 各组术后14 d CD105免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400） 箭头示CD105阳性细胞 ⓐ 手术组 ⓑ 假手术组 ⓒ 对照组 图 7 各组术后各时间点CD105/整合素β1双荧光标记染色观察（荧光显微镜×400） 箭头示CD105和整合素β1双染标记阳性细胞 ⓐ 手术组1 d ⓑ 手术组14 d ⓒ 假手术组14 d ⓓ 对照组14 d
Figure4.
Histological observation of each group at different time points (Safranin O×400) ⓐ Operated group at 1 day ⓑ Operated group at 14 days ⓒ Sham-operated group at 14 days ⓓ Control group at 14 days Fig. 5 BrdU immunofluorescence staining in 3 groups at 14days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated BrdU-positive cells ⓐ Operated group ⓑ Sham-operated group ⓒ Control group Fig. 6 CD105 immunofluorescence staining in 3 groups at 14 days (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105-positive cells ⓐ Operated group ⓑ Sham-operated group ⓒ Control group Fig. 7 CD105/integrin β1 double immunofluorescence staining in 3groups at different time points (Fluorescence microscope×400) Arrow indicated CD105/integrin β1 double positive cells Operated group at 1day ⓐ Operated group at 14 days ⓑ Sham-operated group at 14 days ⓒ Control group at 14 days
表2
各组术后各时间点番红O染色灰度值比较（n=5，2.3 免疫荧光染色观察
BrdU免疫荧光染色示，手术组可见软骨层绿色荧光反应强烈，划痕周围稍多，有向划痕聚集倾向，阳性细胞排列紊乱、分布不均，随造模时间延长更加显著；假手术组及对照组各时间点绿色荧光反应强烈，无明显聚集现象，阳性细胞排列分布均匀。见图 5。
CD105免疫荧光染色示，手术组在划痕周围有较多颗粒状绿色荧光，阳性细胞聚集、大小不一、分布不均，随造模时间延长细胞聚集现象更加明显，位置与HE染色标本细胞聚集位置基本一致；假手术组及对照组各时间点均见软骨层少量绿色荧光，反应较弱，阳性细胞排列均匀。见图 6。手术组术后各时间点CD105阳性细胞数均显著多于假手术组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。手术组随造模时间延长，CD105阳性细胞数逐渐增多，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；假手术组和对照组内各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
各组术后各时间点CD105阳性细胞数比较（n=5，个/HP ，CD105/整合素β1双荧光标记染色示，手术组有大量细胞共表达CD105和整合素β1，以划痕周围处明显，双染标记阳性细胞大小不一、分布不均，随造模时间延长阳性细胞聚集现象更加明显。假手术组和对照组各时间点均未观察到双染标记阳性细胞。见图 7。
3 讨论
本研究在大鼠膝关节软骨上运用刀片划痕实验建立了关节软骨非全层损伤动物模型，并通过HE染色、番红O染色、BrdU、CD105、CD105/整合素β1免疫荧光染色等方法，评估了划痕周围软骨的宏观改变和组织学变化，以及划痕周围细胞的某些分子学标志物表达特征。通过大体观察发现划痕周围软骨欠光滑，有软化和纤维化改变；HE组织学染色发现划痕周围有细胞簇集现象，细胞分布不均，改良组织学评分随造模时间延长未发生显著变化，说明损伤的软骨未得到修复。关节软骨属于透明软骨，是一种特殊的结缔组织，软骨内无血管、淋巴管和神经，其营养主要由滑液供应，这些结构特点决定了其损伤后自愈能力有限[5]。关节软骨损伤根据损伤深度分为穿透软骨下骨的骨软骨损伤（软骨全层损伤）和局限于软骨内的部分软骨损伤（软骨非全层损伤）。Namba等[6]研究发现，在胚胎羊膝关节软骨造成深度为100 μm的表浅损伤，出生时已形成透明软骨修复。而对于成年动物，未穿透软骨下骨的部分软骨损伤仅引起机体局限的损伤反应，关节软骨不能得到修复[7]。本实验结果与既往研究结论相符，即在成年动物上未观察到关节软骨损伤后的明显修复。Sandell[8]发现轻度骨性关节炎时会出现软骨细胞代谢活跃导致细胞簇集现象。本实验中发现的划痕周围细胞簇集现象提示划痕造成的软骨损伤活化了某些细胞，引起局部细胞簇集。番红O染色灰度值分析显示3组组间和组内各时间点间比较，差异均无统计学意义。正常关节软骨内蛋白多糖主要分布于软骨基质内，软骨囊区染色最深。关节软骨番红O染色后，蛋白多糖的变化主要表现为染色程度的变化，着色深浅用平均灰度值，在分析软件上染色程度越深，其灰度值越低[9]。因此番红O染色结果提示，划痕损伤并未造成软骨基质的改变，发生的划痕周围细胞活化和簇集现象可能与软骨基质的关系不密切。
BrdU是一种人工合成的核苷酸类似物，常用于标记活体组织的增殖细胞。其结构类似于胸腺嘧啶，在细胞分裂的S期可取代胸腺嘧啶插入正在复制的细胞DNA中[10-11]。通过免疫组织化学方法，用BrdU抗体检测整合在细胞DNA中的BrdU分子，可以反映出细胞周期的活力。本实验中BrdU免疫荧光染色结果显示在划痕损伤周围有大量阳性细胞聚集，提示这些细胞处于增殖活跃状态。
本实验CD105免疫荧光染色显示，划痕周围有较多CD105阳性细胞，手术组CD105阳性细胞数多于假手术组和对照组，且随造模时间延长，划痕周围的CD105阳性细胞数逐渐增多。CD105是一种前体细胞标志物，研究发现软骨组织中CD105阳性细胞有软骨分化潜能[12-14]。有研究发现[3]，在体外培养的软骨组织块表面可见一种不同于软骨细胞表型的软骨前体细胞。软骨前体细胞一般存在于软骨层表面，Seol等[11]发现在软骨损伤和软骨细胞死亡时，软骨前体细胞会激活并迁徙至受损区域，在软骨全层损伤模型中很可能参与其修复过程。因此我们推测本实验中观察到的损伤部位周围的活化细胞可能是软骨前体细胞，而在假手术组未观察到大量阳性细胞，表明该细胞的活化与软骨膜损伤及周围组织炎症关系不大，而只与软骨层的破坏损伤有关。但还需要进一步分离和培养细胞，并进行体外分化实验来确认活化细胞是软骨前体细胞。
本实验CD105和整合素β1免疫双荧光标记结果显示，在划痕损伤周围有双标阳性细胞，而假手术组和对照组未观察到双标阳性细胞。整合素是黏附分子中的一类，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质黏附的一类细胞膜表面的糖蛋白，由不同的α与β亚单位组成，是许多细胞增生和迁移的基础。研究表明，软骨细胞中表达的整合素包括以胶原为配体的α1β1、α2β1、α10β1、α11β1，以纤维粘连蛋白为配体的α5β1、αVβ3、αVβ5。其中与胶原结合的整合素均含有β1亚基，且绝大多数β1亚基参与形成了以胶原为配体的整合素[15-17]。研究报道，许多激活的干细胞表面整合素β1的表达量上升，例如造血干细胞、表皮干细胞、BMSCs等[1, 18-21]；整合素β1的表达上升使其能够快速介导活化的干细胞与周围基质中的蛋白成分结合，进而促进干细胞增殖分化，以适应应激状态或组织损伤[22-23]。Zwolanek等[16]通过体外实验研究得出结论，整合素β1能介导BMSCs与细胞外基质中胶原的黏附作用，尤其是Ⅱ型胶原；运用单克隆整合素β1封闭抗体，能够抑制BMSCs与细胞外基质中的胶原结合，从而阻断整合素介导的信号传导过程，抑制细胞发挥生物学作用。
因此我们认为，划痕造成的软骨损伤激活了某些细胞，使其细胞膜上的整合素β1表达升高，进而介导活化细胞的黏附作用，促进其增殖分化，以适应损伤后的应激状态，这与Gottschling等[1]的研究结论相符。此外我们可以推断与BMSCs类似，整合素β1作为可能的软骨前体细胞膜表面重要的蛋白，能够介导细胞与细胞外基质中胶原的黏附，从而促进增殖分化及发挥生物学作用。当然，还需要进一步研究证实整合素β1对细胞功能的调节机制。尽管如此，本实验结果提示可通过早期检测整合素β1的高表达，发现软骨损伤早期某些细胞的活化；并结合其他诊断指标和方法，如Ⅱ型胶原羧基端端肽[24]，为早期诊断骨性关节炎提供线索。此外，将来对整合素β1调节细胞和细胞外基质黏附机制的深入研究，将有助于软骨损伤修复方法的发展和进步。
综上述，划痕造成的软骨非全层损伤不能得到完整修复，但引发了损伤病灶周围的细胞改变，包括软骨细胞的坏死和某些细胞的活化，这些活化细 胞 增殖活跃，表达前体细胞标志物CD105以及整合素β1；而细胞的活化与软骨基质的改变和周围组织炎症关系不大。本研究为软骨缺损的治疗及骨性关节炎的早期发现提供了新的临床思路及线索。但本研究还有一些局限，例如关于整合素β1介导活化细胞与细胞外基质的黏附作用机制，以及相关信号通路还不清楚；并且需要进行更深入的体外研究，证实划痕导致的活化细胞是软骨前体细胞。
