引用本文： 叶维, 包倪荣, 赵建宁. 犬肩袖损伤愈合模型的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(4): 461-465. doi: 10.7507/1002-1892.20160093 复制
肩袖是覆盖于肩关节前、上、后方的肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、小圆肌等肌腱的总称，与关节囊紧密相连，肩袖断裂后将严重影响上肢外展功能。尽管外科治疗手段不断发展，但是肩袖损伤修复失败率仍较高[1-4]，成为临床关注焦点之一。动物模型是各种新型修复材料及术式研究的基础，目前用于制备肩袖损伤修复模型的动物包括小鼠、羊、犬[5-9]。与其他动物相比，犬体型及肩袖结构与人相似，因而相关研究多选择犬来制备模型。分析既往相关研究报道，我们发现犬肩袖损伤修复模型未使用外固定支架进行制动处理，从而影响了肩袖损伤修复效果观察。为此，我们提出犬肩袖损伤修复制动模型，即在修复术后采用外固定架将肘关节屈曲90°位固定6周，以更客观观察肩袖修复进程；预实验结果显示制动可减少肩袖再次撕裂的不利因素，有利于肩袖愈合，能较准确模拟临床肩袖损伤修复术后情况。本研究基于犬肩袖损伤制动模型，比较研究不同损伤类型及修复方法的差异，为临床选择手术方法，以及提供能准确模拟临床肩袖损伤修复术后恢复进程的动物模型提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雄性比格犬12只，体质量10～15 kg，由南京军区南京总医院比较医学中心提供。速眠新2号（吉林省华牧动物保健品有限公司）；丙泊酚（西安力邦有限公司）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）；Masson染色试剂盒（北京索来宝科技有限公司）。外固定架（上海捷迈医疗有限公司）。生物力学测试机（Instron公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将12只犬随机分为3组（n=4），分别为急性肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复组（A组）、巨大肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复组（B组）及巨大肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复并自体半腱肌扩张部修复组（C组）。3组动物臀部肌肉注射速眠新2号（0.08～0.10 mg/kg），待四肢无力、不能行走时，于后肢小隐静脉注射丙泊酚注射液（0.1 mL/kg）麻醉，右侧卧位固定于手术架。作左侧肱骨大结节正中切口，长3～5 cm，钝性分离皮下、结缔组织层，牵开肱二头肌，充分暴露肱骨大结节-冈下肌腱连接部。用尖刀片在止点处游离冈下肌腱，修剪冈下肌腱末端。A组在肱骨大结节上清理残余的冈下肌腱末端，对肱骨大结节冈下肌止点骨皮质层进行去表面皮质化处理，再用1 mm克氏针在肱骨大结节上打2个骨孔，取爱惜邦缝合线以Mason-Allen缝合法经骨隧道重建冈下肌止点。B、C组用组织剪于离断冈下肌肌腱末端5 mm处剪断，模拟巨大肩袖损伤；然后B组同A组缝合方法修复冈下肌，C组在A组缝合修复基础上，取自体半腱肌扩张部覆盖于巨大肩袖损伤处。3组肩袖损伤修复后，于尺骨干和肱骨干上钻孔，置外固定架固定肘关节于屈曲90°位6周。见图 1。最后用不可吸收线依次关闭皮下组织层及皮肤，适当加压包扎。术后3 d内，每天臀部肌肉注射青霉素80万U预防感染；分笼正常喂养。
图1
动物模型制备 ⓐ A组急性肩袖损伤 ⓑ A组损伤缝合修复 ⓒ B组巨大肩袖损伤 ⓓ B组损伤缝合修复 ⓔ C组自体半腱肌扩张部修复后 ⓕ 术后外固定支架固定制动 图 2 术后6周各组冈下肌肌腱大体观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 3 术后6周各组组织学观察（Masson染色×20） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组
Figure1.
Establishment of the experimental canine model ⓐ Acute rotator cuff injury in group A ⓑ Suture repair in group A ⓒ Huge rotator cuff injury in group B ⓓ Suture repair in group B ⓔ Suture repair combined with autogenous semitendinosus expansion repair ⓕ External fixation for immobilization after operation Fig. 2 Gross observation of the infraspinatus tendon at 6 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 3 Histological observation at 6 weeks after operation (Masson staining×20) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察术后各组动物存活、切口愈合及行走等情况。
1.3.2 大体观察
术后6周取各组动物，腿部静脉空气栓塞处死，于原手术切口入路，大体观察冈下肌肌腱末端愈合情况。
1.3.3 生物力学测试
大体观察后切取修复后肩关节，钝性分离皮下、肌肉、结缔组织层，牵开肱二头肌及三角肌，保护修复后的冈下肌肌腱组织，手术刀剔除肩胛骨上的冈上肌、大圆肌、小圆肌和肩胛下肌以及附着于肱骨干的肌肉，最后于肩胛骨上游离冈下肌，获得冈下肌-肱骨复合体，用于生物力学测试。将样本肌肉端置于干冰盒内，肌腱止点处于常温中，待肌肉部分凝固成块状后放置于生物力学测试机上，标本固定后加载3 N前负荷，调整负荷为8～50N，固定往复位移1 mm，频率0.25 Hz，循环牵拉40周。然后以1 mm/s前进位移牵拉冈上肌肌腱至断裂，记录测试过程中的峰值，作为极限负荷。
1.3.4 组织学观察
生物力学测试后，取肌腱止点处组织固定于10%甲醛溶液，石蜡包埋后，2 μm厚切片，行Masson染色。光镜下观察肌腱细胞及纤维改变。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后各组动物均存活至实验完成。切口均愈合良好，无感染发生。术后患肢外固定支架在位，避免手术部位负重，通过其他3条腿能稳定行走，不影响其正常活动。
2.2 大体观察
A组：冈下肌肌腱末端瘢痕组织明显多于正常肌腱组织；B组：冈下肌肌腱末端未见明显肌腱组织，分离周围瘢痕组织仍未见明显肌腱成分；C组：冈下肌肌腱虽然部分覆盖瘢痕组织，但仍可观察到肌腱及其大致走向。见图 2。
2.3 生物力学测试
A、B、C组极限负荷分别为（223.75±24.28）、（159.25±34.87）、（233.25±14.24）N，B组显著低于A、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、C组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 组织学观察
镜下观察示，A组肌腱纤维排列大致正常，肌腱细胞数目较多；B组肌腱纤维排列较紊乱，并且肌腱细胞明显少于A组；C组肌腱纤维排列整齐，且肌腱细胞多于B组。见图 3。
3 讨论
猩猩的肩袖结构与人类最相似，是肩袖损伤研究理想的动物模型，但因价格昂贵、饲养条件要求高影响了其在研究中的应用[10-11]。既往用于制备肩袖损伤修复模型的动物包括小鼠、羊、犬，均为爬行动物。Derwin等[12]建立了犬肩袖损伤模型，经生物力学测试，该动物模型在模拟肩袖巨大全层撕裂以及部分撕裂方面具有优势。因此，本研究选取比格犬作为建模对象。
Uezono等[13]以SD小鼠为模型，研究肩袖重建后制动对疗效的影响。研究将小鼠随机分为3组，均采用脱细胞真皮基质支架重建，重建后分别作不制动及制动2、6周处理，结果显示制动2周组小鼠胶原合成优于其他组，且承重负荷更大，提示在动物模型中患肢制动处理有利于肩袖愈合。但是小鼠体型小，安装制动装置较困难。我们采用外固定支架装置将比格犬患肢肘关节固定于屈曲90°位，预实验结果显示该处理方法能有效避免患肢负重等因素对修复过程的影响，能较准确模拟临床肩袖损伤修复后愈合过程。
临床上将肩袖损伤分为小、中、大度[14-16]，本实验我们制备了急性肩袖损伤和巨大肩袖损伤，均予以Mason-Allen缝合修复。经大体观察、生物力学测试及组织学观察显示，在相同修复方法下，急性肩袖损伤修复后的肌腱生物力学强度以及肌腱细胞数量、肌腱纤维排列均优于巨大肩袖损伤，与临床上巨大肩袖损伤修复失败率高于小、中度肩袖损伤结果类似[17]。
临床上肩袖损伤多采用关节镜下单纯单排或双排缝合修复，理论上双排缝合可以提供更好的强度支持，有利于腱-骨贴附，但这种理论上的优势并未在临床实践中得到体现。提示在单纯缝合基础上联合支架材料进行修复可能会获得更好疗效，因此用于肩袖修补的支架材料也逐渐成为研究热点[18-19]。Ide等[20]应用脱细胞真皮支架（GraftJacket）修复SD小鼠肩袖损伤模型，组织学及生物力学测试结果显示GraftJacket修复后效果优于未使用脱细胞真皮支架修复的对照组。但也有研究表明[21]生物支架难以提供足够的生物力学强度，且可能导致炎性反应。为避免以上问题，我们选择自体半腱肌扩张部组织增强肩袖修复。本结果显示，巨大肩袖损伤后，Mason-Allen缝合并自体半腱肌扩张部修复后，肌腱生物力学强度以及肌腱细胞数量、肌腱纤维排列显著优于单纯Mason-Allen缝合修复。我们认为，自体半腱肌扩张部修补巨大肩袖损伤不仅能提高肩袖愈合，达到满意生物力学强度，还可提供一个支架结构有助于肩袖肌腱细胞的增殖与吸附。
综上述，犬巨大肩袖损伤缝合并自体半腱肌扩张部修复的制动模型，可为肩袖损伤相关研究提供合适的动物模型。但本研究也存在不足之处：①样本量太少，缺乏大样本数据分析，对结果的预判可能存在偏差；②观察时间仅6周，远期腱-骨愈合疗效有待验证；③缺少更多的定量分析指标。以上不足均有待进一步研究完善。
肩袖是覆盖于肩关节前、上、后方的肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、小圆肌等肌腱的总称，与关节囊紧密相连，肩袖断裂后将严重影响上肢外展功能。尽管外科治疗手段不断发展，但是肩袖损伤修复失败率仍较高[1-4]，成为临床关注焦点之一。动物模型是各种新型修复材料及术式研究的基础，目前用于制备肩袖损伤修复模型的动物包括小鼠、羊、犬[5-9]。与其他动物相比，犬体型及肩袖结构与人相似，因而相关研究多选择犬来制备模型。分析既往相关研究报道，我们发现犬肩袖损伤修复模型未使用外固定支架进行制动处理，从而影响了肩袖损伤修复效果观察。为此，我们提出犬肩袖损伤修复制动模型，即在修复术后采用外固定架将肘关节屈曲90°位固定6周，以更客观观察肩袖修复进程；预实验结果显示制动可减少肩袖再次撕裂的不利因素，有利于肩袖愈合，能较准确模拟临床肩袖损伤修复术后情况。本研究基于犬肩袖损伤制动模型，比较研究不同损伤类型及修复方法的差异，为临床选择手术方法，以及提供能准确模拟临床肩袖损伤修复术后恢复进程的动物模型提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雄性比格犬12只，体质量10～15 kg，由南京军区南京总医院比较医学中心提供。速眠新2号（吉林省华牧动物保健品有限公司）；丙泊酚（西安力邦有限公司）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）；Masson染色试剂盒（北京索来宝科技有限公司）。外固定架（上海捷迈医疗有限公司）。生物力学测试机（Instron公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将12只犬随机分为3组（n=4），分别为急性肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复组（A组）、巨大肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复组（B组）及巨大肩袖损伤+Mason-Allen缝合修复并自体半腱肌扩张部修复组（C组）。3组动物臀部肌肉注射速眠新2号（0.08～0.10 mg/kg），待四肢无力、不能行走时，于后肢小隐静脉注射丙泊酚注射液（0.1 mL/kg）麻醉，右侧卧位固定于手术架。作左侧肱骨大结节正中切口，长3～5 cm，钝性分离皮下、结缔组织层，牵开肱二头肌，充分暴露肱骨大结节-冈下肌腱连接部。用尖刀片在止点处游离冈下肌腱，修剪冈下肌腱末端。A组在肱骨大结节上清理残余的冈下肌腱末端，对肱骨大结节冈下肌止点骨皮质层进行去表面皮质化处理，再用1 mm克氏针在肱骨大结节上打2个骨孔，取爱惜邦缝合线以Mason-Allen缝合法经骨隧道重建冈下肌止点。B、C组用组织剪于离断冈下肌肌腱末端5 mm处剪断，模拟巨大肩袖损伤；然后B组同A组缝合方法修复冈下肌，C组在A组缝合修复基础上，取自体半腱肌扩张部覆盖于巨大肩袖损伤处。3组肩袖损伤修复后，于尺骨干和肱骨干上钻孔，置外固定架固定肘关节于屈曲90°位6周。见图 1。最后用不可吸收线依次关闭皮下组织层及皮肤，适当加压包扎。术后3 d内，每天臀部肌肉注射青霉素80万U预防感染；分笼正常喂养。
图1
动物模型制备 ⓐ A组急性肩袖损伤 ⓑ A组损伤缝合修复 ⓒ B组巨大肩袖损伤 ⓓ B组损伤缝合修复 ⓔ C组自体半腱肌扩张部修复后 ⓕ 术后外固定支架固定制动 图 2 术后6周各组冈下肌肌腱大体观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 3 术后6周各组组织学观察（Masson染色×20） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组
Figure1.
Establishment of the experimental canine model ⓐ Acute rotator cuff injury in group A ⓑ Suture repair in group A ⓒ Huge rotator cuff injury in group B ⓓ Suture repair in group B ⓔ Suture repair combined with autogenous semitendinosus expansion repair ⓕ External fixation for immobilization after operation Fig. 2 Gross observation of the infraspinatus tendon at 6 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 3 Histological observation at 6 weeks after operation (Masson staining×20) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察术后各组动物存活、切口愈合及行走等情况。
1.3.2 大体观察
术后6周取各组动物，腿部静脉空气栓塞处死，于原手术切口入路，大体观察冈下肌肌腱末端愈合情况。
1.3.3 生物力学测试
大体观察后切取修复后肩关节，钝性分离皮下、肌肉、结缔组织层，牵开肱二头肌及三角肌，保护修复后的冈下肌肌腱组织，手术刀剔除肩胛骨上的冈上肌、大圆肌、小圆肌和肩胛下肌以及附着于肱骨干的肌肉，最后于肩胛骨上游离冈下肌，获得冈下肌-肱骨复合体，用于生物力学测试。将样本肌肉端置于干冰盒内，肌腱止点处于常温中，待肌肉部分凝固成块状后放置于生物力学测试机上，标本固定后加载3 N前负荷，调整负荷为8～50N，固定往复位移1 mm，频率0.25 Hz，循环牵拉40周。然后以1 mm/s前进位移牵拉冈上肌肌腱至断裂，记录测试过程中的峰值，作为极限负荷。
1.3.4 组织学观察
生物力学测试后，取肌腱止点处组织固定于10%甲醛溶液，石蜡包埋后，2 μm厚切片，行Masson染色。光镜下观察肌腱细胞及纤维改变。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后各组动物均存活至实验完成。切口均愈合良好，无感染发生。术后患肢外固定支架在位，避免手术部位负重，通过其他3条腿能稳定行走，不影响其正常活动。
2.2 大体观察
A组：冈下肌肌腱末端瘢痕组织明显多于正常肌腱组织；B组：冈下肌肌腱末端未见明显肌腱组织，分离周围瘢痕组织仍未见明显肌腱成分；C组：冈下肌肌腱虽然部分覆盖瘢痕组织，但仍可观察到肌腱及其大致走向。见图 2。
2.3 生物力学测试
A、B、C组极限负荷分别为（223.75±24.28）、（159.25±34.87）、（233.25±14.24）N，B组显著低于A、C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、C组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 组织学观察
镜下观察示，A组肌腱纤维排列大致正常，肌腱细胞数目较多；B组肌腱纤维排列较紊乱，并且肌腱细胞明显少于A组；C组肌腱纤维排列整齐，且肌腱细胞多于B组。见图 3。
3 讨论
猩猩的肩袖结构与人类最相似，是肩袖损伤研究理想的动物模型，但因价格昂贵、饲养条件要求高影响了其在研究中的应用[10-11]。既往用于制备肩袖损伤修复模型的动物包括小鼠、羊、犬，均为爬行动物。Derwin等[12]建立了犬肩袖损伤模型，经生物力学测试，该动物模型在模拟肩袖巨大全层撕裂以及部分撕裂方面具有优势。因此，本研究选取比格犬作为建模对象。
Uezono等[13]以SD小鼠为模型，研究肩袖重建后制动对疗效的影响。研究将小鼠随机分为3组，均采用脱细胞真皮基质支架重建，重建后分别作不制动及制动2、6周处理，结果显示制动2周组小鼠胶原合成优于其他组，且承重负荷更大，提示在动物模型中患肢制动处理有利于肩袖愈合。但是小鼠体型小，安装制动装置较困难。我们采用外固定支架装置将比格犬患肢肘关节固定于屈曲90°位，预实验结果显示该处理方法能有效避免患肢负重等因素对修复过程的影响，能较准确模拟临床肩袖损伤修复后愈合过程。
临床上将肩袖损伤分为小、中、大度[14-16]，本实验我们制备了急性肩袖损伤和巨大肩袖损伤，均予以Mason-Allen缝合修复。经大体观察、生物力学测试及组织学观察显示，在相同修复方法下，急性肩袖损伤修复后的肌腱生物力学强度以及肌腱细胞数量、肌腱纤维排列均优于巨大肩袖损伤，与临床上巨大肩袖损伤修复失败率高于小、中度肩袖损伤结果类似[17]。
临床上肩袖损伤多采用关节镜下单纯单排或双排缝合修复，理论上双排缝合可以提供更好的强度支持，有利于腱-骨贴附，但这种理论上的优势并未在临床实践中得到体现。提示在单纯缝合基础上联合支架材料进行修复可能会获得更好疗效，因此用于肩袖修补的支架材料也逐渐成为研究热点[18-19]。Ide等[20]应用脱细胞真皮支架（GraftJacket）修复SD小鼠肩袖损伤模型，组织学及生物力学测试结果显示GraftJacket修复后效果优于未使用脱细胞真皮支架修复的对照组。但也有研究表明[21]生物支架难以提供足够的生物力学强度，且可能导致炎性反应。为避免以上问题，我们选择自体半腱肌扩张部组织增强肩袖修复。本结果显示，巨大肩袖损伤后，Mason-Allen缝合并自体半腱肌扩张部修复后，肌腱生物力学强度以及肌腱细胞数量、肌腱纤维排列显著优于单纯Mason-Allen缝合修复。我们认为，自体半腱肌扩张部修补巨大肩袖损伤不仅能提高肩袖愈合，达到满意生物力学强度，还可提供一个支架结构有助于肩袖肌腱细胞的增殖与吸附。
综上述，犬巨大肩袖损伤缝合并自体半腱肌扩张部修复的制动模型，可为肩袖损伤相关研究提供合适的动物模型。但本研究也存在不足之处：①样本量太少，缺乏大样本数据分析，对结果的预判可能存在偏差；②观察时间仅6周，远期腱-骨愈合疗效有待验证；③缺少更多的定量分析指标。以上不足均有待进一步研究完善。
