引用本文： 刘龙刚, 伍耀宏, 陶晖, 贾治伟, 李小川, 王德利, 何勍, 阮狄克. 修饰有BMP-7功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS制备及其生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(4): 491-498. doi: 10.7507/1002-1892.20160098 复制
近年来，组织工程技术为退变椎间盘的修复再生提供了新的临床思路。支架材料与生长因子是组织工程方法的两个必备因素，越来越多研究试图将生长因子直接复合于支架材料上，以实现生物材料的功能化；但大多数方法仅仅通过物理或化学方法将细胞因子复合于支架材料表面，存在半衰期短等问题。RADA16-Ⅰ是一种新型自组装多肽材料，具有良好的生物相容性[1-3]，其C末端可通过化学键结合具有细胞因子生物学活性的短肽片段，使材料具备生物学活性的同时延长细胞因子活性片段的作用时间[1]。大量研究显示[4-6]，BMP-7于体内外条件下均可促进髓核组织蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成，注射后还可改善新西兰大白兔椎间盘内的含水量、增加椎间盘高度，从而修复椎间盘退变。本研究利用RADA16-Ⅰ通过化学键作用于其C末端复合BMP-7活性短肽片段（KPSSAPTQLN），成功制备了功能化自组装多肽RADA-KPSS。RADA-KPSS对 RADA16-ⅠC末端的延长会降低自组装多肽RADA16-Ⅰ固有的凝胶性，但当RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合形成新的功能化自组装多肽RADKPS后，又可恢复原有的水凝胶特性[7]。本课题组前期体外实验结果显示，新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS有良好的成胶能力，且在体外对人退变髓核细胞的细胞活性、细胞增殖、分泌等具有明显促进作用[7]。理想的生物材料必须首先具备良好的生物相容性[8]，才能安全用于体内研究；故本实验进一步评价其生物相容性，为RADKPS用于退变椎间盘修复再生领域的进一步体内研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 ～ 8 周龄健康昆明种小鼠 36只，雌雄各半，体质量17 ～ 23 g；3月龄新西兰大白兔1只，体质量2.5 kg；6月龄新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量2.8～3.1kg；均由中国人民解放军海军总医院实验动物中心提供。
RADA16-Ⅰ（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2）与RADA-KPSS（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADAGGKPSSAPT-QLN-CONH）多肽粉末各100 mg（利用固相合成法合成，纯度>90%；上海生工生物工程有限公司）；兔淋巴细胞分离液（1.073×103 g/L；天津灏洋生物科技有限公司）；MTT、DMSO、青霉素、链霉素、PBS缓冲液（Sigma 公司，美国）；L-DMEM培养基、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物制品有限公司）。XFluor4酶标仪 （TECAN 公司，奥地利）；4300-S扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；Heraeus CO2 培养箱（Thermo公司，日本）；IME-Ⅱ倒置相差显微镜、IX71倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；SPM9600原子力学显微镜（岛津公司，日本）；培养瓶、培养板（Corning公司，美国）；Hamilton微量注射器（北京博朗宁科技有限公司）。
1.2 RADKPS制备及其性能检测
1.2.1 RADKPS的制备及成胶
将RADA16-Ⅰ和RADA-KPSS多肽粉末分别与10%蔗糖溶液配制成浓度为1%（m/v）的多肽溶液，4℃超声振荡30min以使多肽粉末充分溶解；然后将1%RADA16-Ⅰ溶液和1%RADA-KPSS溶液等体积混合形成1%RAD KPS；用孔径为0.22 μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒后置于4℃保存，备用。分别将3枚Transwell小室置于24孔培养板内，移液枪吸取备好的1%RADA16-Ⅰ、1%RADA-KPSS、1%RADKPS各100 μL分别移入3枚Transwell小室，然后分别向各Transwell小室中缓慢滴加L-DMEM并观察各组成胶情况。
1.2.2 原子力学显微镜观察
吸取5 μL 稀释至0.01%（m/v）的RADKPS滴在新鲜的云母片上，静置25～30 s后用100 μL PBS液轻轻冲洗，空气中晾干后室温放置3～4 h。用原子力显微镜釆用硅扫描探针接触模式观察RADKPS自组装纤维形貌，扫描区域1 μm×1 μm，扫描频率1.00 Hz；再以SPM-9700图像分析软件对RADKPS的自组装纤维直径和长度进行定量分析。
1.3 RADKPS细胞相容性实验
1.3.1 兔BMSCs分离培养
取3月龄新西兰大白兔以氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，于胫骨平台下方穿刺抽取约3 mL骨髓，迅速置入预装有2 mL肝素钠的15 mL离心管，摇晃混匀，采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养兔BMSCs。等体积 PBS 混匀骨髓血，缓慢置于2倍体积淋巴细胞分离液上，以离心半径10 cm、2 000 r/min离心20 min；吸取中间白膜层骨髓单个核细胞，PBS离心洗涤（6mL PBS混悬细胞以离心半径10 cm、1 500 r/min 离心5min，弃上清）2遍后计数，以5 mL含20%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液重悬细胞，按1×106个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中行原代培养。48 h后换液，PBS冲洗3次弃去未贴壁细胞，此后每 2～3 天换液1次，待原代培养细胞达80%融合时行胰蛋白酶消化传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态，并取第3代细胞进行以下实验。
1.3.2 细胞-支架复合物制备
将Transwell小室置于每孔加入400 μL 10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液的24孔培养板内。用10%蔗糖溶液重悬第3代BMSCs制备浓度为2.5×106 个/mL的细胞悬液，取20 μL细胞悬液与100μL 1%RADKPS溶液迅速混匀，立即移入Transwell小室，向其表面缓慢滴加400 μL含10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液，置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育10 min；然后缓慢更换培养孔和水凝胶表面的培养基，再置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育30 min；之后每30分钟缓慢更换培养孔及水凝胶表面的培养液，至少更换2次以缓冲多肽水凝胶内的pH值。
1.3.3 扫描电镜观察
取培养12 h及7 d的细胞-支架复合物，2.5%戊二醛固定后，经20%、50%、70%、90%乙醇梯度脱水各15 min，无水乙醇脱水3 次，空气中干燥24 h，喷金处理，扫描电镜下观察。
1.3.4 细胞活性染色观察
取培养12 h及7 d的细胞-支架复合物，PBS冲洗3 min×3次，避光置于荧光素二乙酸盐/碘化丙啶（fluorescein diacetate/propidium iodide，FDA/PI；FDA浓度为5 mg/mL，PI为2 mg/ mL）溶液，37℃下孵育5 min，PBS冲洗3min×3 次，IX71倒置荧光显微镜下观察，100倍视野下每组随机选取6个视野分别计数死、活细胞数量，计算细胞活性。
1.3.5 MTT检测
取生长状态良好的第3代BM SCs，0.25%胰蛋白酶消化后，制成浓度为1×104 个 / mL的细胞悬液，接种于96 孔板培养（100µL/孔）；培养 24 h 后，各孔分别再加入 100 μL浓度为0.1%、0.05%、0.025%的RADKPS溶液（分别为实验组1、2、3），含10%FBS的L-DMEM培养液（阴性对照组）和10%无菌蔗糖溶液（空白对照组），每组设5个复孔。每2天换液1次，分别培养8 h及1、3、5、7 d，每孔加入20 µL MTT、5 mg/mL PBS液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养4 h后弃上清，每孔加入 150 µL DMSO，振荡10 min，酶标仪于570nm 处测吸光度（A）值，按以下公式计算相对增殖度（relative growth rate，RGR）：实验组A值/阴性对照组A值×100%。
1.3.6 兔离体椎间盘器官髓核内细胞活性观察
取6月龄新西兰大白兔10只，氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，6 000 U肝素钠静脉注射抗血栓。无菌条件下手术分离脊柱并获取椎间盘，尽可能剃去椎间盘两侧骨性终板，并剔除椎间盘的前后纵韧带及外层纤维环，生理盐水反复高压冲洗3遍。选取处理好的椎间盘，以10 mL注射器从椎间盘后外45°穿刺至髓核中心位置，维持10 mL负压抽吸15 s，随后于对侧后外45°以微量注射器注入25 μL 1%RADKPS多肽溶液作为实验组，未注射多肽椎间盘设为空白对照组（每组3枚椎间盘）。超净台无菌条件下，以含1%双抗（青霉素/链霉素）的PBS液冲洗椎间盘器官2遍后，两组分别置入有10 mL含10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）L-DMEM培养液的25 cm2透气培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中竖立培养瓶培养。1、3、7 d后取出髓核，避光条件下置于配备好的0.5%FDA/0.2%PI染液，并于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育5 min后，以PBS液反复冲洗髓核组织2 min。IX71倒置荧光显微镜下观察。于100倍视野下每枚椎间盘随机选取2个视野分别计数死、活细胞数量，计算细胞活性。
1.4 RADKPS血液相容性实验
根据ISO 10993.4[9]标准及文献[10-11]方法进行功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS溶液血液相容性检测。取兔肝素抗凝静脉血10 mL，按血∶生理盐水为4∶5的比例稀释；向各试管分别加入0.1%（A组）、0.05%（B组）、0.025%（C组）RADKPS溶液及10%蔗糖溶液（D组）、生理盐水（E组，阴性对照）、蒸馏水（F组，阳性对照）各5 mL，再向各管中加入稀释后的全血0.1 mL，37℃水浴保温60 min；然后以离心半径10 cm、3 000 r/min离心5min，取上清液于波长545 nm处测定各管A值，按以下公式计算相对溶血率：（样本A值－阴性对照A值）/（阳性对照A值－阴性对照A值） ×100%，实验重复 3 次，取均值。相对溶血率<5%为不发生溶血，符合医用生物材料的溶血实验要求。
1.5 RADKPS组织相容性实验
取6～8周龄健康昆明小鼠36只，5%水合氯醛100 μL麻醉，于双侧脊柱旁1 cm、头端距髋关节1cm处以微量注射器分别注射1%RADKPS溶液0.1mL，注射完毕后针头滞留30 s后缓慢拔出。常规饲养7、14、28 d观察小鼠存活情况及注射局部有无水疱、红斑及焦痂形成；各时间点分别处死12只小鼠，取出未完全降解的支架材料及部分周围组织，经固定、石蜡包埋、切片后行HE染色，倒置显微镜下观察支架降解情况及局部炎性反应情况。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RADKPS支架性能观察
在Transwell小室中缓慢滴加L-DMEM后，单纯RADA16-Ⅰ多肽溶液和RADKPS多肽溶液从底部开始逐渐变成水凝胶状，5 min后小室内的多肽溶液均呈水凝胶状，从小室中取出后可见均匀透明、光亮的水凝胶圆柱体；而单纯RADA-KPSS多肽溶液成胶能力较前二者差。见图 1。原子力学显微镜示RADKPS自组装纳米纤维相互连接呈三维网状结构，纤维直径（25.68±4.62）nm，纤维长度（512.42±32.22）nm。见图 2。
图1
功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架大体观察 ⓐ 单纯RADA-KPSS ⓑ 单纯RADA16-Ⅰ ⓒ RADKPS 图 2 RADKPS原子力学显微镜观察（×50 k） 图 3 第3代兔BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜 ×100） 图 4 细胞-支架复合物培养不同时间点扫描电镜观察（×1 000） 箭头示支架内附着的 BMSCs ⓐ 12 h ⓑ 7 d 图 5 细胞-支架复合物培养不同时间点FDA/PI染色观察细胞活性 ⓐ 12 h（倒置荧光显微镜×100） ⓑ 7 d（倒置荧光显微镜×40） 图 6 MTT检测各组培养各时间点细胞增殖情况 图 7 兔离体椎间盘器官培养各时间点髓核细胞活性观察 ⓐ 实验组1 d（倒置荧光显微镜×40） ⓑ 空白对照组1 d（倒置荧光显微镜×40） ⓒ 实验组3 d（倒置荧光显微镜×100） ⓓ 空白对照组3 d（倒置荧光显微镜×100） ⓔ 实验组7 d（倒置荧光显微镜×100） ⓕ 空白对照组7 d（倒置荧光显微镜×100）
Figure1.
General observation of the functional self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold ⓐ RADA-KPSS ⓑ RADA16-I ⓒ RADKPS Fig. 2 Atomic force microscopy image of RADKPS (×50 k) Fig. 3 Morphologic observation of the 3rd generation rabbit BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) Fig. 4 Scanning electron microscope observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point (×1 000) Arrow indicated BMSCs which tightly attached to RADKPS ⓐ At 12 hours ⓑ At 7 days Fig. 5 Cellular activity observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point after cultured through fluorescein diacetate/propidium iodide staining ⓐ At 12 hours (Inverted fluorescence microscope×100) ⓑ At 7 days (Inverted fluorescence microscope×40) Fig. 6 Cell proliferation by MTT in each group at each time point Fig. 7 Cellular activity observation of nucleus pulposus cells from isolated rabbit intervertebral disc organs cultured at each time point ⓐ Experimental group at 1 day (Inverted fluorescence microscope×40) ⓑ Blank control group at 1day (Inverted fluorescence microscope×40) ⓒ Experimental group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓓ Blank control group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓔ Experimental group at 7 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓕ Blank control group at 7days (Inverted fluorescence microscope×100)
2.2 RADKPS细胞相容性实验
①倒置相差显微镜观察示，第3代新西兰大白兔BMSCs呈长梭形，漩涡样生长（图 3）。②扫描电镜观察示，细胞-支架复合物培养12 h，BMSCs呈球形黏附于支架材料内；7 d，支架材料内可见大量BMSCs，细胞伸出大量伪足与支架材料的纳米纤维紧紧黏附，其形态呈现三维立体结构，表面可见大量类细胞外基质样分泌物。见图 4。③细胞活性染色示，细胞-支架复合物培养12 h及7 d，细胞活性分别为93.3%±1.6%和91.2%±1.9%，7 d时细胞数量显著多于12 h时，但细胞活性低于12h时，比较差异有统计学意义（t=4.706，P=0.001）。见图 5。④MTT检测示，实验组1、2、3的RGR分别为115.0%±1.1%、105.3%±1.6%、102.9%±0.9%，BMSCs增殖能力随多肽溶液浓度增加呈递增趋势，但差异无统计学意义（F=3.146，P=0.112）。见图 6。⑤兔离体椎间盘器官培养过程中，实验组与空白对照组椎间盘内髓核细胞活性均在85%以上。培养1、3 d，实验组与空白对照组椎间盘内髓核细胞活性比较差异无统计学意义（P>0.05）；7 d时实验组细胞活性明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=4.287，P=0.006）。见表 1、图 7。
表1
两组兔离体椎间盘器官培养各时间点髓核细胞活性比较（n=36，%，2.3 RADKPS血液相容性实验
A、B、C、D、E组可见红细胞沉积，上层液体颜色接近无色；F组未见红细胞沉积，上层液体颜色为红色。A、B、C组相对溶血率分别为3.6%、0.8%、0.6%，均<5%，符合医用生物材料的溶血实验要求。
2.4 RADKPS组织相容性实验
所有小鼠注射区皮肤无明显水疱、红斑及焦痂形成；饲养24 h内无发热、惊厥、死亡现象。注射局部皮肤取材后可见10 d内皮下呈明显隆起，后隆起逐渐扁平，28 d时局部隆起基本消失。见图 8。
图8
小鼠皮下注射RADKPS溶液后各时间点大体观察 ⓐ 7 d ⓑ 14 d ⓒ 28 d 图 9 小鼠皮下注射RADKPS溶液后各时间点HE染色观察 ⓐ 7 d（×40） ⓑ 7 d （×100） ⓒ 7 d （×200） ⓓ 14 d（×40） ⓔ 14 d（×100） ⓕ 14 d（×200） ⓖ 28 d（×40） ⓗ 28 d（×100） ⓘ 28d（×200）
Figure8.
General observation at each time point after subcutaneous implantation ⓐ At 7 days ⓑ At 14 days ⓒ At 28 days Fig. 9 HE staining observation at each time point after subcutaneous implantation ⓐ At 7 days (×40) ⓑ At 7 days (×100) ⓒ At 7 days (×200) ⓓ At 14 days (×40) ⓔ At 14 days (×100) ⓕ At 14 days (×200) ⓖ At 28 days (×40) ⓗ At 28 days (×100) ⓘ At 28 days (×200)
HE染色示，RADKPS溶液植入部位皮肤层次清晰，结构正常。植入7 d，水凝胶于皮下形成均匀的网格状支架结构，有少量中性粒细胞浸润；14 d，较多成纤维细胞长入并伴支架周围部分降解；28 d，支架结构进一步降解，局部被正常纤维组织替代，以成纤维细胞和单核细胞浸润为主。见图 9。
3 讨论
自组装多肽纳米纤维RADA16-Ⅰ具有含水量高（可达99%）、可注射、良好的生物相容性及可于体内自组装成与细胞外基质结构相似的纳米纤维支架等特征[12-14]，因此被认为是一种理想的组织工程生物支架材料。RADA16-Ⅰ的C末端可通过化学键插入短肽活性片段，使该多肽纳米材料具有生物学活性。目前各种短肽活性片段修饰的RADA16-Ⅰ已在神经、软骨、血管、心肌再生修复中应用，并获得了满意效果[3, 13, 15-16]。BMP-7是目前为止促进髓核细胞分泌蛋白多糖能力最强的生长因子之一[17-18]。Chen等[19]研究发现BMP-7具有3个功能活性片段——KPSS、SNVI、KAIS。本课题组前期研究结果表明，载有活性片段KPSS的功能化自组装多肽RADA-KPSS较载有活性片段SNVI、KAIS的功能化自组装多肽RADA-SNVI、RADA-KAIS更能促进人髓核细胞增殖、迁移及表达细胞外基质成分（Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9）[20]。但单纯的RADA-KPSS成胶性能较差，而将RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合后不但能够明显改善成胶性能，同时在体外条件下可显著促进人退变髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达[7]。故将RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合制成的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS，可能为髓核组织工程内源性修复提供更优良的材 料。
本研究结果显示，原子力显微镜观察RADKPS支架材料具备纳米级的纤维直径以及孔径结构，可为细胞提供良好的三维环境。理想的髓核组织工程支架复合材料应具有良好的生物相容性，以确保临床应用的安全性。细胞相容性包括细胞在支架上的黏附、活性，以及不同浓度多肽支架溶液对细胞增殖的影响。扫描电镜结果示，细胞在接种12 h时开始黏附，呈球状，无伪足伸出；7 d时细胞已经展开，呈卵圆形，其表面附着大量颗粒，表明细胞已开始分泌细胞外基质，并与邻近细胞多平面立体接触。细胞活性染色结果示，细胞在接种12 h及7 d后活性均良好，表明多肽水凝胶成胶过程未产生具有明显细胞毒性的物质。细胞增殖实验结果示，兔BMSCs在不同浓度RADKPS溶液中生长良好，且数量均多于单纯10%FBS培养液组，但无统计学差异，这可能是由于实验组RADKPS溶液浓度均较低而不能形成三维孔隙结构，不能发挥支架材料三维培养细胞的优势。而支架材料中复合的KPSS片段发挥了BMP-7的促细胞增殖效应，侧面说明了该功能片段的有效 性。
多种离体椎间盘器官模型已被成功用于椎间盘早期退变及生物力学等研究[21-23]，本实验选择新西兰大白兔离体椎间盘器官培养模型，能够维持椎间盘内髓核细胞所固有的低氧、高渗和低pH环境，减少培养条件的变化对椎间盘髓核内细胞的影响，而反映RADKPS对髓核内细胞的作用。通过肝素化、尽可能修除骨性终板、剔去前后纵韧带及外层纤维环，尽可能保证了椎间盘器官营养通道的通畅；以微量注射器注射方法有效防止了注入水凝胶材料的泄露，并尽可能降低对髓核内细胞的损伤。通过7 d的培养可定性观察到注射组离体椎间盘器官内髓核细胞活性高于空白对照组。说明该新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS对椎间盘器官内的髓核细胞无毒性反应。
支架本身或其在体内降解后产生的代谢产物不可避免地会进入血液循环中，有产生溶血副作用的风险，本研究溶血实验结果显示，不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均<5%，完全符合医用材料对溶血实验的要求。
支架植入小鼠皮下观察主要是评价其局部炎性反应以及降解速度情况。组织学结果显示在14 d内以少量中性粒细胞浸润为主，28 d时以成纤维细胞浸润为主，成纤维细胞分泌大量胶原纤维，已逐步取代原支架结构，表明支架的降解速度符合人体内新生组织再生长入的速度，具有良好的组织相容性。
综上述，修饰有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS具有良好的细胞相容性、血液相容性及组织相容性，为进一步动物实验验证其修复椎间盘的作用奠定了实验基础。
近年来，组织工程技术为退变椎间盘的修复再生提供了新的临床思路。支架材料与生长因子是组织工程方法的两个必备因素，越来越多研究试图将生长因子直接复合于支架材料上，以实现生物材料的功能化；但大多数方法仅仅通过物理或化学方法将细胞因子复合于支架材料表面，存在半衰期短等问题。RADA16-Ⅰ是一种新型自组装多肽材料，具有良好的生物相容性[1-3]，其C末端可通过化学键结合具有细胞因子生物学活性的短肽片段，使材料具备生物学活性的同时延长细胞因子活性片段的作用时间[1]。大量研究显示[4-6]，BMP-7于体内外条件下均可促进髓核组织蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成，注射后还可改善新西兰大白兔椎间盘内的含水量、增加椎间盘高度，从而修复椎间盘退变。本研究利用RADA16-Ⅰ通过化学键作用于其C末端复合BMP-7活性短肽片段（KPSSAPTQLN），成功制备了功能化自组装多肽RADA-KPSS。RADA-KPSS对 RADA16-ⅠC末端的延长会降低自组装多肽RADA16-Ⅰ固有的凝胶性，但当RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合形成新的功能化自组装多肽RADKPS后，又可恢复原有的水凝胶特性[7]。本课题组前期体外实验结果显示，新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS有良好的成胶能力，且在体外对人退变髓核细胞的细胞活性、细胞增殖、分泌等具有明显促进作用[7]。理想的生物材料必须首先具备良好的生物相容性[8]，才能安全用于体内研究；故本实验进一步评价其生物相容性，为RADKPS用于退变椎间盘修复再生领域的进一步体内研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 ～ 8 周龄健康昆明种小鼠 36只，雌雄各半，体质量17 ～ 23 g；3月龄新西兰大白兔1只，体质量2.5 kg；6月龄新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量2.8～3.1kg；均由中国人民解放军海军总医院实验动物中心提供。
RADA16-Ⅰ（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2）与RADA-KPSS（氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADAGGKPSSAPT-QLN-CONH）多肽粉末各100 mg（利用固相合成法合成，纯度>90%；上海生工生物工程有限公司）；兔淋巴细胞分离液（1.073×103 g/L；天津灏洋生物科技有限公司）；MTT、DMSO、青霉素、链霉素、PBS缓冲液（Sigma 公司，美国）；L-DMEM培养基、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物制品有限公司）。XFluor4酶标仪 （TECAN 公司，奥地利）；4300-S扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；Heraeus CO2 培养箱（Thermo公司，日本）；IME-Ⅱ倒置相差显微镜、IX71倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；SPM9600原子力学显微镜（岛津公司，日本）；培养瓶、培养板（Corning公司，美国）；Hamilton微量注射器（北京博朗宁科技有限公司）。
1.2 RADKPS制备及其性能检测
1.2.1 RADKPS的制备及成胶
将RADA16-Ⅰ和RADA-KPSS多肽粉末分别与10%蔗糖溶液配制成浓度为1%（m/v）的多肽溶液，4℃超声振荡30min以使多肽粉末充分溶解；然后将1%RADA16-Ⅰ溶液和1%RADA-KPSS溶液等体积混合形成1%RAD KPS；用孔径为0.22 μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒后置于4℃保存，备用。分别将3枚Transwell小室置于24孔培养板内，移液枪吸取备好的1%RADA16-Ⅰ、1%RADA-KPSS、1%RADKPS各100 μL分别移入3枚Transwell小室，然后分别向各Transwell小室中缓慢滴加L-DMEM并观察各组成胶情况。
1.2.2 原子力学显微镜观察
吸取5 μL 稀释至0.01%（m/v）的RADKPS滴在新鲜的云母片上，静置25～30 s后用100 μL PBS液轻轻冲洗，空气中晾干后室温放置3～4 h。用原子力显微镜釆用硅扫描探针接触模式观察RADKPS自组装纤维形貌，扫描区域1 μm×1 μm，扫描频率1.00 Hz；再以SPM-9700图像分析软件对RADKPS的自组装纤维直径和长度进行定量分析。
1.3 RADKPS细胞相容性实验
1.3.1 兔BMSCs分离培养
取3月龄新西兰大白兔以氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，于胫骨平台下方穿刺抽取约3 mL骨髓，迅速置入预装有2 mL肝素钠的15 mL离心管，摇晃混匀，采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养兔BMSCs。等体积 PBS 混匀骨髓血，缓慢置于2倍体积淋巴细胞分离液上，以离心半径10 cm、2 000 r/min离心20 min；吸取中间白膜层骨髓单个核细胞，PBS离心洗涤（6mL PBS混悬细胞以离心半径10 cm、1 500 r/min 离心5min，弃上清）2遍后计数，以5 mL含20%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液重悬细胞，按1×106个/cm2密度接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中行原代培养。48 h后换液，PBS冲洗3次弃去未贴壁细胞，此后每 2～3 天换液1次，待原代培养细胞达80%融合时行胰蛋白酶消化传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态，并取第3代细胞进行以下实验。
1.3.2 细胞-支架复合物制备
将Transwell小室置于每孔加入400 μL 10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液的24孔培养板内。用10%蔗糖溶液重悬第3代BMSCs制备浓度为2.5×106 个/mL的细胞悬液，取20 μL细胞悬液与100μL 1%RADKPS溶液迅速混匀，立即移入Transwell小室，向其表面缓慢滴加400 μL含10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的L-DMEM培养液，置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育10 min；然后缓慢更换培养孔和水凝胶表面的培养基，再置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育30 min；之后每30分钟缓慢更换培养孔及水凝胶表面的培养液，至少更换2次以缓冲多肽水凝胶内的pH值。
1.3.3 扫描电镜观察
取培养12 h及7 d的细胞-支架复合物，2.5%戊二醛固定后，经20%、50%、70%、90%乙醇梯度脱水各15 min，无水乙醇脱水3 次，空气中干燥24 h，喷金处理，扫描电镜下观察。
1.3.4 细胞活性染色观察
取培养12 h及7 d的细胞-支架复合物，PBS冲洗3 min×3次，避光置于荧光素二乙酸盐/碘化丙啶（fluorescein diacetate/propidium iodide，FDA/PI；FDA浓度为5 mg/mL，PI为2 mg/ mL）溶液，37℃下孵育5 min，PBS冲洗3min×3 次，IX71倒置荧光显微镜下观察，100倍视野下每组随机选取6个视野分别计数死、活细胞数量，计算细胞活性。
1.3.5 MTT检测
取生长状态良好的第3代BM SCs，0.25%胰蛋白酶消化后，制成浓度为1×104 个 / mL的细胞悬液，接种于96 孔板培养（100µL/孔）；培养 24 h 后，各孔分别再加入 100 μL浓度为0.1%、0.05%、0.025%的RADKPS溶液（分别为实验组1、2、3），含10%FBS的L-DMEM培养液（阴性对照组）和10%无菌蔗糖溶液（空白对照组），每组设5个复孔。每2天换液1次，分别培养8 h及1、3、5、7 d，每孔加入20 µL MTT、5 mg/mL PBS液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养4 h后弃上清，每孔加入 150 µL DMSO，振荡10 min，酶标仪于570nm 处测吸光度（A）值，按以下公式计算相对增殖度（relative growth rate，RGR）：实验组A值/阴性对照组A值×100%。
1.3.6 兔离体椎间盘器官髓核内细胞活性观察
取6月龄新西兰大白兔10只，氯胺酮+速眠新0.5 mL肌肉注射麻醉后，6 000 U肝素钠静脉注射抗血栓。无菌条件下手术分离脊柱并获取椎间盘，尽可能剃去椎间盘两侧骨性终板，并剔除椎间盘的前后纵韧带及外层纤维环，生理盐水反复高压冲洗3遍。选取处理好的椎间盘，以10 mL注射器从椎间盘后外45°穿刺至髓核中心位置，维持10 mL负压抽吸15 s，随后于对侧后外45°以微量注射器注入25 μL 1%RADKPS多肽溶液作为实验组，未注射多肽椎间盘设为空白对照组（每组3枚椎间盘）。超净台无菌条件下，以含1%双抗（青霉素/链霉素）的PBS液冲洗椎间盘器官2遍后，两组分别置入有10 mL含10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）L-DMEM培养液的25 cm2透气培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中竖立培养瓶培养。1、3、7 d后取出髓核，避光条件下置于配备好的0.5%FDA/0.2%PI染液，并于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育5 min后，以PBS液反复冲洗髓核组织2 min。IX71倒置荧光显微镜下观察。于100倍视野下每枚椎间盘随机选取2个视野分别计数死、活细胞数量，计算细胞活性。
1.4 RADKPS血液相容性实验
根据ISO 10993.4[9]标准及文献[10-11]方法进行功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS溶液血液相容性检测。取兔肝素抗凝静脉血10 mL，按血∶生理盐水为4∶5的比例稀释；向各试管分别加入0.1%（A组）、0.05%（B组）、0.025%（C组）RADKPS溶液及10%蔗糖溶液（D组）、生理盐水（E组，阴性对照）、蒸馏水（F组，阳性对照）各5 mL，再向各管中加入稀释后的全血0.1 mL，37℃水浴保温60 min；然后以离心半径10 cm、3 000 r/min离心5min，取上清液于波长545 nm处测定各管A值，按以下公式计算相对溶血率：（样本A值－阴性对照A值）/（阳性对照A值－阴性对照A值） ×100%，实验重复 3 次，取均值。相对溶血率<5%为不发生溶血，符合医用生物材料的溶血实验要求。
1.5 RADKPS组织相容性实验
取6～8周龄健康昆明小鼠36只，5%水合氯醛100 μL麻醉，于双侧脊柱旁1 cm、头端距髋关节1cm处以微量注射器分别注射1%RADKPS溶液0.1mL，注射完毕后针头滞留30 s后缓慢拔出。常规饲养7、14、28 d观察小鼠存活情况及注射局部有无水疱、红斑及焦痂形成；各时间点分别处死12只小鼠，取出未完全降解的支架材料及部分周围组织，经固定、石蜡包埋、切片后行HE染色，倒置显微镜下观察支架降解情况及局部炎性反应情况。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RADKPS支架性能观察
在Transwell小室中缓慢滴加L-DMEM后，单纯RADA16-Ⅰ多肽溶液和RADKPS多肽溶液从底部开始逐渐变成水凝胶状，5 min后小室内的多肽溶液均呈水凝胶状，从小室中取出后可见均匀透明、光亮的水凝胶圆柱体；而单纯RADA-KPSS多肽溶液成胶能力较前二者差。见图 1。原子力学显微镜示RADKPS自组装纳米纤维相互连接呈三维网状结构，纤维直径（25.68±4.62）nm，纤维长度（512.42±32.22）nm。见图 2。
图1
功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架大体观察 ⓐ 单纯RADA-KPSS ⓑ 单纯RADA16-Ⅰ ⓒ RADKPS 图 2 RADKPS原子力学显微镜观察（×50 k） 图 3 第3代兔BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜 ×100） 图 4 细胞-支架复合物培养不同时间点扫描电镜观察（×1 000） 箭头示支架内附着的 BMSCs ⓐ 12 h ⓑ 7 d 图 5 细胞-支架复合物培养不同时间点FDA/PI染色观察细胞活性 ⓐ 12 h（倒置荧光显微镜×100） ⓑ 7 d（倒置荧光显微镜×40） 图 6 MTT检测各组培养各时间点细胞增殖情况 图 7 兔离体椎间盘器官培养各时间点髓核细胞活性观察 ⓐ 实验组1 d（倒置荧光显微镜×40） ⓑ 空白对照组1 d（倒置荧光显微镜×40） ⓒ 实验组3 d（倒置荧光显微镜×100） ⓓ 空白对照组3 d（倒置荧光显微镜×100） ⓔ 实验组7 d（倒置荧光显微镜×100） ⓕ 空白对照组7 d（倒置荧光显微镜×100）
Figure1.
General observation of the functional self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold ⓐ RADA-KPSS ⓑ RADA16-I ⓒ RADKPS Fig. 2 Atomic force microscopy image of RADKPS (×50 k) Fig. 3 Morphologic observation of the 3rd generation rabbit BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) Fig. 4 Scanning electron microscope observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point (×1 000) Arrow indicated BMSCs which tightly attached to RADKPS ⓐ At 12 hours ⓑ At 7 days Fig. 5 Cellular activity observation of BMSCs-RADKPS scaffold composite at each time point after cultured through fluorescein diacetate/propidium iodide staining ⓐ At 12 hours (Inverted fluorescence microscope×100) ⓑ At 7 days (Inverted fluorescence microscope×40) Fig. 6 Cell proliferation by MTT in each group at each time point Fig. 7 Cellular activity observation of nucleus pulposus cells from isolated rabbit intervertebral disc organs cultured at each time point ⓐ Experimental group at 1 day (Inverted fluorescence microscope×40) ⓑ Blank control group at 1day (Inverted fluorescence microscope×40) ⓒ Experimental group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓓ Blank control group at 3 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓔ Experimental group at 7 days (Inverted fluorescence microscope×100) ⓕ Blank control group at 7days (Inverted fluorescence microscope×100)
2.2 RADKPS细胞相容性实验
①倒置相差显微镜观察示，第3代新西兰大白兔BMSCs呈长梭形，漩涡样生长（图 3）。②扫描电镜观察示，细胞-支架复合物培养12 h，BMSCs呈球形黏附于支架材料内；7 d，支架材料内可见大量BMSCs，细胞伸出大量伪足与支架材料的纳米纤维紧紧黏附，其形态呈现三维立体结构，表面可见大量类细胞外基质样分泌物。见图 4。③细胞活性染色示，细胞-支架复合物培养12 h及7 d，细胞活性分别为93.3%±1.6%和91.2%±1.9%，7 d时细胞数量显著多于12 h时，但细胞活性低于12h时，比较差异有统计学意义（t=4.706，P=0.001）。见图 5。④MTT检测示，实验组1、2、3的RGR分别为115.0%±1.1%、105.3%±1.6%、102.9%±0.9%，BMSCs增殖能力随多肽溶液浓度增加呈递增趋势，但差异无统计学意义（F=3.146，P=0.112）。见图 6。⑤兔离体椎间盘器官培养过程中，实验组与空白对照组椎间盘内髓核细胞活性均在85%以上。培养1、3 d，实验组与空白对照组椎间盘内髓核细胞活性比较差异无统计学意义（P>0.05）；7 d时实验组细胞活性明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=4.287，P=0.006）。见表 1、图 7。
表1
两组兔离体椎间盘器官培养各时间点髓核细胞活性比较（n=36，%，2.3 RADKPS血液相容性实验
A、B、C、D、E组可见红细胞沉积，上层液体颜色接近无色；F组未见红细胞沉积，上层液体颜色为红色。A、B、C组相对溶血率分别为3.6%、0.8%、0.6%，均<5%，符合医用生物材料的溶血实验要求。
2.4 RADKPS组织相容性实验
所有小鼠注射区皮肤无明显水疱、红斑及焦痂形成；饲养24 h内无发热、惊厥、死亡现象。注射局部皮肤取材后可见10 d内皮下呈明显隆起，后隆起逐渐扁平，28 d时局部隆起基本消失。见图 8。
图8
小鼠皮下注射RADKPS溶液后各时间点大体观察 ⓐ 7 d ⓑ 14 d ⓒ 28 d 图 9 小鼠皮下注射RADKPS溶液后各时间点HE染色观察 ⓐ 7 d（×40） ⓑ 7 d （×100） ⓒ 7 d （×200） ⓓ 14 d（×40） ⓔ 14 d（×100） ⓕ 14 d（×200） ⓖ 28 d（×40） ⓗ 28 d（×100） ⓘ 28d（×200）
Figure8.
General observation at each time point after subcutaneous implantation ⓐ At 7 days ⓑ At 14 days ⓒ At 28 days Fig. 9 HE staining observation at each time point after subcutaneous implantation ⓐ At 7 days (×40) ⓑ At 7 days (×100) ⓒ At 7 days (×200) ⓓ At 14 days (×40) ⓔ At 14 days (×100) ⓕ At 14 days (×200) ⓖ At 28 days (×40) ⓗ At 28 days (×100) ⓘ At 28 days (×200)
HE染色示，RADKPS溶液植入部位皮肤层次清晰，结构正常。植入7 d，水凝胶于皮下形成均匀的网格状支架结构，有少量中性粒细胞浸润；14 d，较多成纤维细胞长入并伴支架周围部分降解；28 d，支架结构进一步降解，局部被正常纤维组织替代，以成纤维细胞和单核细胞浸润为主。见图 9。
3 讨论
自组装多肽纳米纤维RADA16-Ⅰ具有含水量高（可达99%）、可注射、良好的生物相容性及可于体内自组装成与细胞外基质结构相似的纳米纤维支架等特征[12-14]，因此被认为是一种理想的组织工程生物支架材料。RADA16-Ⅰ的C末端可通过化学键插入短肽活性片段，使该多肽纳米材料具有生物学活性。目前各种短肽活性片段修饰的RADA16-Ⅰ已在神经、软骨、血管、心肌再生修复中应用，并获得了满意效果[3, 13, 15-16]。BMP-7是目前为止促进髓核细胞分泌蛋白多糖能力最强的生长因子之一[17-18]。Chen等[19]研究发现BMP-7具有3个功能活性片段——KPSS、SNVI、KAIS。本课题组前期研究结果表明，载有活性片段KPSS的功能化自组装多肽RADA-KPSS较载有活性片段SNVI、KAIS的功能化自组装多肽RADA-SNVI、RADA-KAIS更能促进人髓核细胞增殖、迁移及表达细胞外基质成分（Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9）[20]。但单纯的RADA-KPSS成胶性能较差，而将RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合后不但能够明显改善成胶性能，同时在体外条件下可显著促进人退变髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达[7]。故将RADA-KPSS与RADA16-Ⅰ以1∶1比例混合制成的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS，可能为髓核组织工程内源性修复提供更优良的材 料。
本研究结果显示，原子力显微镜观察RADKPS支架材料具备纳米级的纤维直径以及孔径结构，可为细胞提供良好的三维环境。理想的髓核组织工程支架复合材料应具有良好的生物相容性，以确保临床应用的安全性。细胞相容性包括细胞在支架上的黏附、活性，以及不同浓度多肽支架溶液对细胞增殖的影响。扫描电镜结果示，细胞在接种12 h时开始黏附，呈球状，无伪足伸出；7 d时细胞已经展开，呈卵圆形，其表面附着大量颗粒，表明细胞已开始分泌细胞外基质，并与邻近细胞多平面立体接触。细胞活性染色结果示，细胞在接种12 h及7 d后活性均良好，表明多肽水凝胶成胶过程未产生具有明显细胞毒性的物质。细胞增殖实验结果示，兔BMSCs在不同浓度RADKPS溶液中生长良好，且数量均多于单纯10%FBS培养液组，但无统计学差异，这可能是由于实验组RADKPS溶液浓度均较低而不能形成三维孔隙结构，不能发挥支架材料三维培养细胞的优势。而支架材料中复合的KPSS片段发挥了BMP-7的促细胞增殖效应，侧面说明了该功能片段的有效 性。
多种离体椎间盘器官模型已被成功用于椎间盘早期退变及生物力学等研究[21-23]，本实验选择新西兰大白兔离体椎间盘器官培养模型，能够维持椎间盘内髓核细胞所固有的低氧、高渗和低pH环境，减少培养条件的变化对椎间盘髓核内细胞的影响，而反映RADKPS对髓核内细胞的作用。通过肝素化、尽可能修除骨性终板、剔去前后纵韧带及外层纤维环，尽可能保证了椎间盘器官营养通道的通畅；以微量注射器注射方法有效防止了注入水凝胶材料的泄露，并尽可能降低对髓核内细胞的损伤。通过7 d的培养可定性观察到注射组离体椎间盘器官内髓核细胞活性高于空白对照组。说明该新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS对椎间盘器官内的髓核细胞无毒性反应。
支架本身或其在体内降解后产生的代谢产物不可避免地会进入血液循环中，有产生溶血副作用的风险，本研究溶血实验结果显示，不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均<5%，完全符合医用材料对溶血实验的要求。
支架植入小鼠皮下观察主要是评价其局部炎性反应以及降解速度情况。组织学结果显示在14 d内以少量中性粒细胞浸润为主，28 d时以成纤维细胞浸润为主，成纤维细胞分泌大量胶原纤维，已逐步取代原支架结构，表明支架的降解速度符合人体内新生组织再生长入的速度，具有良好的组织相容性。
综上述，修饰有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS具有良好的细胞相容性、血液相容性及组织相容性，为进一步动物实验验证其修复椎间盘的作用奠定了实验基础。
