引用本文： 张国威, 汪泱, 邓志锋. MSCs来源的外泌体修复组织损伤的机制研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(4): 499-503. doi: 10.7507/1002-1892.20160099 复制
MSCs广泛存在于人体组织中，是一类具有自我更新能力的多能前体细胞。其具有多种功能，包括多系分化、促进组织修复、抗炎治疗、免疫抑制以及神经保护作用等。传统观念认为MSCs发挥其生物学功能主要是通过定位至损伤组织，分化取代受损细胞发挥治疗作用。然而，一系列研究发现MSCs在损伤位点的定植与分化效率很低，修复作用有限[1-2]，并且移植的MSCs与损伤组织间的距离对其发挥修复作用并无影响[3-5]。研究者认为，MSCs可能通过释放一些因子减少细胞损伤、增强修复作用[6]。研究证明外泌体广泛参与细胞之间的交流，因此研究者推测其可能作为MSCs的旁分泌因子来实现损伤修复作用[7]。
外泌体是细胞分泌的一种直径为30～100nm的囊泡，其内包裹有来源细胞内的多种mRNA、微小RNA（micro RNA，miRNA）、DNA、蛋白质等生物活性物质，几乎存在于所有体液中，并根据其大小、功能或表面标志物进行分类[8]。1980年Pan等首次发现羊网织红细胞分泌一些小囊泡，最初认为它是网织红细胞成熟过程中脱落的无用蛋白[9]，在1987年的进一步研究中将这些小囊泡命名为“exosomes”（即外泌体）[10]，由此研究者们开始关注这些功能性囊泡。外泌体相关研究的迅速发展主要得益于其领域的两大突破：第一，1996年Raposo研究组发现B淋巴细胞来源的囊泡具有激活免疫系统的作用，参与适应性免疫过程[11]；随后，许多研究组相继发现了外泌体囊泡中含有的功能性蛋白，并参与一些生理过程，进而建立了外泌体作为细胞间信号传递介质的概念。第二，外泌体囊泡中RNA的发现，也极大促进了外泌体研究的发展。2006年，Ratajczak研究组报道，外泌体能够运载mRNA至靶细胞，并翻译成相应蛋白[12]；2007年，Valadi等[13]发现外泌体同样负载miRNA；2010年，又有3个课题组分别独立报道了miRNA存在于外泌体囊泡中，并抑制靶基因的表达[14-16]。越来越多研究证明，外泌体广泛参与细胞之间的交流，作用于靶细胞，调节生理过程。随后在多种疾病模型的研究中发现，MSCs来源的外泌体（MSCs-derived exosomes，MEX）具有与MSCs相似的促进组织修复作用，有望成为再生医学中一个新的治疗方法。本文通过阐述MEX中RNA、蛋白质及未明确的生物活性物质的组织损伤修复潜力，探讨MEX的作用机制以及临床应用潜能。
1 RNA介导的损伤修复作用
1.1 mRNA
研究表明MEX中mRNA在损伤修复中具有治疗作用。Bruno等[17-18]研究表明，MEX中的mRNA主要与促增殖、转录调控以及免疫调节有关，对肾损伤发挥修复作用。Gatti等[19]在缺血再灌注急性肾损伤大鼠模型中发现，外泌体运载的mRNA通过促进固有肾小管上皮细胞增殖，抑制存活细胞的凋亡，发挥损伤修复作用。随后，Zhu等[20]研究了MEX中mRNA与急性肺损伤修复间的关系，研究发现外泌体包含角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）mRNA，它从BMSCs转运至肺泡二型上皮细胞，并翻译KGF蛋白；KGF蛋白水平的升高可以抑制免疫反应，减少肺组织损伤。
1.2 miRNA
miRNA也被认为是MEX在组织损伤中修复的一个关键生物活性物质。首先在神经系统疾病方面，研究发现[21]在大脑中动脉栓塞鼠模型中，miRNA-133b从BMSCs转运至受损神经元，可能通过调节酪氨酸羟化酶产生和多巴胺转运蛋白，诱导神经突生长，增强神经可塑性，促进脑损伤修复。但miRNA-133b在MEX修复脑损伤中的确切机制还需要进一步探究。此外，Bonafede等[22]在体外构建脊髓侧索硬化症细胞模型，首次发现脂肪来源MSCs（adipose-derived stem cells，ADSCs）来源的外泌体在脊髓侧索硬化症中的神经保护作用，认为可能是外泌体内的miRNA，比如miRNA21、miRNA222及miRNAlet7a，通过凋亡抑制途径、细胞周期调控、促增殖反应发挥修复作用。同时，MEX miRNA与心脏损伤修复方面的研究也有大量文献报道。Feng等[23]认为心肌缺血后，心肌内甲基化CpG结合蛋白2的水平升高，miRNA-22直接作用于甲基化CpG结合蛋白2，发挥抗凋亡作用。另有研究发现，BMSCs来源外泌体中的miRNA-19a也具有相似的修复作用，但是其作用机制可能是抑制PTEN和BIM蛋白的表达，激活Akt和ERK信号途径[24]。MEX miRNA在其他系统组织中的修复作用也相继被发现。Nakamura等[25]在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中，采用肌肉注射MEX可诱导肌细胞新生以及血管新生，修复肌肉损伤；并认为miRNA494通过线粒体转录因子A和Forkhead box j3调控线粒体合成，能够促进肌细胞新生和迁移。最近，Wang等[26]首次发现MEX中miRNA-223在脓毒血症中具有心脏保护作用，为治疗脓毒血症提供了新的思路。可见，miRNA在组织修复过程中发挥了重要作用，为研究MEX功能提供了新的方向。
2 蛋白质介导的损伤修复作用
外泌体所含蛋白质的生物学功能首先在免疫学研究中证实[11, 27]。之后进一步研究发现了外泌体蛋白在癌症及神经科学领域中的作用[28-30]。直至2010年才报道了MEX中蛋白质的损伤修复作用[31]，但目前相关研究报道较少。
MEX中蛋白质主要通过调节细胞内的信号途径，促进细胞增殖和存活细胞的抗凋亡，在多种组织中发挥修复作用。早期研究发现[31-32]MSCs来源的旁分泌因子对心肌缺血再灌注损伤的修复作用，主要是外泌体的参与；一系列相关研究[33]证明外泌体蛋白质可以提高ATP和还原型辅酶Ⅰ水平，降低c-JNK磷酸化减少氧化应激，激活PI3K/Akt通路促进细胞增殖，由此发挥损伤修复作用，但发挥作用的具体外泌体蛋白质还需要进一步研究。Zhang等[34]研究人脐带MSCs分泌的外泌体，通过运载Wnt4蛋白激活内皮细胞的Wnt/β-链蛋白信号通路，增强血管新生，促进皮肤损伤愈合。在神经系统方面，Katsuda等[35]研究发现ADSCs外泌体包含酶活性脑啡肽酶，其为脑中β淀粉样蛋白的降解酶；共培养实验表明，ADSCs来源MEX被转运到过度表达淀粉样前体蛋白的Neuro-2a细胞中，细胞内外β淀粉样蛋白浓度水平降低。在免疫调节方面，研究发现了外泌体相关的酶在移植物抗宿主病中的治疗潜能[36]。比如，BMSCs来源的外泌体运载具有酶功能的CD73，它是作用于ATP信号途径的生物大分子，能够将AMP代谢为腺苷，通过此通路促进腺苷A2A受体表达的Th1凋亡[37]。目前关于功能性蛋白质的研究有限，因此MEX中蛋白质在其他系统组织中的修复作用需要进一步研究。
3 MEX中未明确的生物活性物质介导的损伤修复
尽管有关MEX损伤修复作用的报道很多，但大部分研究都未能确定何种生物活性物质发挥了修复作用。MEX在各个系统组织损伤修复的研究成果，为下一步深入探讨相关分子机制奠定了基础。He等[38]研究发现，5/6肾切除残肾鼠模型中通过尾静脉注入MEX，可以阻止肾组织纤维化、间质淋巴细胞浸润以及防止肾小管萎缩，达到保护修复肾脏损伤的作用。在呼吸系统方面，相关报道显示在缺氧性肺动脉高压模型鼠中，MEX通过抑制巨噬细胞涌入缺氧性肺动脉以及缺氧诱导的STAT3信号途径，诱导抗炎和促增殖因子的产生，达到保护修复的作用[39]。在神经系统方面，Zhang 等[40]首次发现通过尾静脉注射MEX能够促进神经功能恢复和神经血管重塑，减少创伤性脑损伤后的神经炎性反应。Farinazzo等[41]在体外将神经细胞暴露于H2O2，模拟神经细胞氧化应激状态，并给予ADSCs来源MEX干预，通过调节神经炎症和神经退行性疾病的微环境，发挥神经保护和神经再生作用。在运动系统方面，研究表明下肢缺血模型中，MEX在体外能够促进内皮细胞的增殖成管，在患肢四点注射MEX，体外采用激光多普勒检测可观察到明显的血流恢复现象[42]。在消化系统方面，Tan等[43]研究CCl4诱导的肝损伤鼠模型，发现MEX能够上调肝脏再生过程中的启动基因，使增殖相关的蛋白、增殖细胞核抗原和Cyclin D1表达增加，修复受损肝脏。在心肌缺血性疾病中，Teng等[44]研究发现，MEX能够诱导血管新生，抑制T淋巴细胞增殖，改善缺血后的微环境，从而促进心肌缺血后功能的恢复。Zhao等[45]研究显示，人脐带MSCs来源的外泌体能够显著增强心肌细胞在低氧条件下Bcl-2（一种重要的抗凋亡蛋白）的表达，增强急性心肌缺血边缘区域Ki67蛋白（与细胞增殖密切相关，可减轻急性心肌缺血损伤）的表达。此外，STAT3信号通路在伤口愈合过程中发挥重要作用，包括迁移、增殖、血管新生以及生长因子的产生[46]；Shabbir等[46]研究发现MEX能够促进伤口愈合，主要通过激活多个生长因子信号级联，包括Akt、STAT3和ERK，使生长因子HGF、IL-6、IGF-1、NGF和基质细胞来源因子1表达量增加；作者认为这些因子的释放激活了Akt和ERK1/2信号级联，并进一步激活了STAT3信号通路。Zhang等[47]首次发现了诱导多能干细胞源性MEX可以促进胶原合成和血管新生，从而促进皮肤伤口的愈合。MEX在生物体内多个系统损伤中均表现出优越的修复效果，为进一步研究MEX内容物发挥生物效应机制奠定了前提基础。
4 小结与展望
以上大量研究表明，在多种动物模型中，MEX均表现出理想的损伤修复效果；并且外泌体中包含的丰富RNA和蛋白质等生物活性物质，在体内运送到靶细胞过程中也不会降解，所以外泌体被认为是理想的药物运输工具[48]。此外，一些研究证明，通过对来源细胞的预处理比如基因干预等，能够改变外泌体的分泌特征以及功能作用[49-50]。参考大量关于MSCs转基因修饰的文献报道[51-53]，我们认为MSCs经过预处理后释放的外泌体将是基因或细胞治疗过程中理想的药物或基因传送介质。此外，同一种MSCs在不同生长阶段培养基中获得的外泌体，其所含生物活性物质并不完全一样，为了达到不同的实验要求，还需要进一步标准化外泌体的提取和收集。
MEX功能也具有个体差异性，据文献报道，各种组织来源MSCs具有相似的表面标志，但是其产生细胞因子的类型及数量以及对炎症的反应能力，均表现出明显不同[54]。供体的年龄和性别也影响MSCs的一些特点，比如表面标志和克隆能力[55]。我们需要进一步明确供体MSCs的特征与它们分泌外泌体功能之间的关系，MEX中生物活性物质特点与MEX治疗作用间的关系，以及供体MSCs的特征与MEX产量是否存在相关性，以期为预测临床应用MEX治疗损伤修复的效果提供更加准确的信息。
同时，我们还应注意到MEX的致癌风险。MEX在损伤组织中具有促增殖作用，说明它也可能加快癌症进展。目前对于MEX是否具有致癌风险仍在讨论中。文献报道MEX可抑制膀胱癌细胞的生长[56]，但能够促进肾癌细胞的生长和侵袭[57]。这两种不同的结果表明MEX对癌细胞的作用可能具有类型依赖性。在MEX应用于临床前我们还需要对此矛盾问题进行更加全面的研究。
MSCs广泛存在于人体组织中，是一类具有自我更新能力的多能前体细胞。其具有多种功能，包括多系分化、促进组织修复、抗炎治疗、免疫抑制以及神经保护作用等。传统观念认为MSCs发挥其生物学功能主要是通过定位至损伤组织，分化取代受损细胞发挥治疗作用。然而，一系列研究发现MSCs在损伤位点的定植与分化效率很低，修复作用有限[1-2]，并且移植的MSCs与损伤组织间的距离对其发挥修复作用并无影响[3-5]。研究者认为，MSCs可能通过释放一些因子减少细胞损伤、增强修复作用[6]。研究证明外泌体广泛参与细胞之间的交流，因此研究者推测其可能作为MSCs的旁分泌因子来实现损伤修复作用[7]。
外泌体是细胞分泌的一种直径为30～100nm的囊泡，其内包裹有来源细胞内的多种mRNA、微小RNA（micro RNA，miRNA）、DNA、蛋白质等生物活性物质，几乎存在于所有体液中，并根据其大小、功能或表面标志物进行分类[8]。1980年Pan等首次发现羊网织红细胞分泌一些小囊泡，最初认为它是网织红细胞成熟过程中脱落的无用蛋白[9]，在1987年的进一步研究中将这些小囊泡命名为“exosomes”（即外泌体）[10]，由此研究者们开始关注这些功能性囊泡。外泌体相关研究的迅速发展主要得益于其领域的两大突破：第一，1996年Raposo研究组发现B淋巴细胞来源的囊泡具有激活免疫系统的作用，参与适应性免疫过程[11]；随后，许多研究组相继发现了外泌体囊泡中含有的功能性蛋白，并参与一些生理过程，进而建立了外泌体作为细胞间信号传递介质的概念。第二，外泌体囊泡中RNA的发现，也极大促进了外泌体研究的发展。2006年，Ratajczak研究组报道，外泌体能够运载mRNA至靶细胞，并翻译成相应蛋白[12]；2007年，Valadi等[13]发现外泌体同样负载miRNA；2010年，又有3个课题组分别独立报道了miRNA存在于外泌体囊泡中，并抑制靶基因的表达[14-16]。越来越多研究证明，外泌体广泛参与细胞之间的交流，作用于靶细胞，调节生理过程。随后在多种疾病模型的研究中发现，MSCs来源的外泌体（MSCs-derived exosomes，MEX）具有与MSCs相似的促进组织修复作用，有望成为再生医学中一个新的治疗方法。本文通过阐述MEX中RNA、蛋白质及未明确的生物活性物质的组织损伤修复潜力，探讨MEX的作用机制以及临床应用潜能。
1 RNA介导的损伤修复作用
1.1 mRNA
研究表明MEX中mRNA在损伤修复中具有治疗作用。Bruno等[17-18]研究表明，MEX中的mRNA主要与促增殖、转录调控以及免疫调节有关，对肾损伤发挥修复作用。Gatti等[19]在缺血再灌注急性肾损伤大鼠模型中发现，外泌体运载的mRNA通过促进固有肾小管上皮细胞增殖，抑制存活细胞的凋亡，发挥损伤修复作用。随后，Zhu等[20]研究了MEX中mRNA与急性肺损伤修复间的关系，研究发现外泌体包含角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）mRNA，它从BMSCs转运至肺泡二型上皮细胞，并翻译KGF蛋白；KGF蛋白水平的升高可以抑制免疫反应，减少肺组织损伤。
1.2 miRNA
miRNA也被认为是MEX在组织损伤中修复的一个关键生物活性物质。首先在神经系统疾病方面，研究发现[21]在大脑中动脉栓塞鼠模型中，miRNA-133b从BMSCs转运至受损神经元，可能通过调节酪氨酸羟化酶产生和多巴胺转运蛋白，诱导神经突生长，增强神经可塑性，促进脑损伤修复。但miRNA-133b在MEX修复脑损伤中的确切机制还需要进一步探究。此外，Bonafede等[22]在体外构建脊髓侧索硬化症细胞模型，首次发现脂肪来源MSCs（adipose-derived stem cells，ADSCs）来源的外泌体在脊髓侧索硬化症中的神经保护作用，认为可能是外泌体内的miRNA，比如miRNA21、miRNA222及miRNAlet7a，通过凋亡抑制途径、细胞周期调控、促增殖反应发挥修复作用。同时，MEX miRNA与心脏损伤修复方面的研究也有大量文献报道。Feng等[23]认为心肌缺血后，心肌内甲基化CpG结合蛋白2的水平升高，miRNA-22直接作用于甲基化CpG结合蛋白2，发挥抗凋亡作用。另有研究发现，BMSCs来源外泌体中的miRNA-19a也具有相似的修复作用，但是其作用机制可能是抑制PTEN和BIM蛋白的表达，激活Akt和ERK信号途径[24]。MEX miRNA在其他系统组织中的修复作用也相继被发现。Nakamura等[25]在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中，采用肌肉注射MEX可诱导肌细胞新生以及血管新生，修复肌肉损伤；并认为miRNA494通过线粒体转录因子A和Forkhead box j3调控线粒体合成，能够促进肌细胞新生和迁移。最近，Wang等[26]首次发现MEX中miRNA-223在脓毒血症中具有心脏保护作用，为治疗脓毒血症提供了新的思路。可见，miRNA在组织修复过程中发挥了重要作用，为研究MEX功能提供了新的方向。
2 蛋白质介导的损伤修复作用
外泌体所含蛋白质的生物学功能首先在免疫学研究中证实[11, 27]。之后进一步研究发现了外泌体蛋白在癌症及神经科学领域中的作用[28-30]。直至2010年才报道了MEX中蛋白质的损伤修复作用[31]，但目前相关研究报道较少。
MEX中蛋白质主要通过调节细胞内的信号途径，促进细胞增殖和存活细胞的抗凋亡，在多种组织中发挥修复作用。早期研究发现[31-32]MSCs来源的旁分泌因子对心肌缺血再灌注损伤的修复作用，主要是外泌体的参与；一系列相关研究[33]证明外泌体蛋白质可以提高ATP和还原型辅酶Ⅰ水平，降低c-JNK磷酸化减少氧化应激，激活PI3K/Akt通路促进细胞增殖，由此发挥损伤修复作用，但发挥作用的具体外泌体蛋白质还需要进一步研究。Zhang等[34]研究人脐带MSCs分泌的外泌体，通过运载Wnt4蛋白激活内皮细胞的Wnt/β-链蛋白信号通路，增强血管新生，促进皮肤损伤愈合。在神经系统方面，Katsuda等[35]研究发现ADSCs外泌体包含酶活性脑啡肽酶，其为脑中β淀粉样蛋白的降解酶；共培养实验表明，ADSCs来源MEX被转运到过度表达淀粉样前体蛋白的Neuro-2a细胞中，细胞内外β淀粉样蛋白浓度水平降低。在免疫调节方面，研究发现了外泌体相关的酶在移植物抗宿主病中的治疗潜能[36]。比如，BMSCs来源的外泌体运载具有酶功能的CD73，它是作用于ATP信号途径的生物大分子，能够将AMP代谢为腺苷，通过此通路促进腺苷A2A受体表达的Th1凋亡[37]。目前关于功能性蛋白质的研究有限，因此MEX中蛋白质在其他系统组织中的修复作用需要进一步研究。
3 MEX中未明确的生物活性物质介导的损伤修复
尽管有关MEX损伤修复作用的报道很多，但大部分研究都未能确定何种生物活性物质发挥了修复作用。MEX在各个系统组织损伤修复的研究成果，为下一步深入探讨相关分子机制奠定了基础。He等[38]研究发现，5/6肾切除残肾鼠模型中通过尾静脉注入MEX，可以阻止肾组织纤维化、间质淋巴细胞浸润以及防止肾小管萎缩，达到保护修复肾脏损伤的作用。在呼吸系统方面，相关报道显示在缺氧性肺动脉高压模型鼠中，MEX通过抑制巨噬细胞涌入缺氧性肺动脉以及缺氧诱导的STAT3信号途径，诱导抗炎和促增殖因子的产生，达到保护修复的作用[39]。在神经系统方面，Zhang 等[40]首次发现通过尾静脉注射MEX能够促进神经功能恢复和神经血管重塑，减少创伤性脑损伤后的神经炎性反应。Farinazzo等[41]在体外将神经细胞暴露于H2O2，模拟神经细胞氧化应激状态，并给予ADSCs来源MEX干预，通过调节神经炎症和神经退行性疾病的微环境，发挥神经保护和神经再生作用。在运动系统方面，研究表明下肢缺血模型中，MEX在体外能够促进内皮细胞的增殖成管，在患肢四点注射MEX，体外采用激光多普勒检测可观察到明显的血流恢复现象[42]。在消化系统方面，Tan等[43]研究CCl4诱导的肝损伤鼠模型，发现MEX能够上调肝脏再生过程中的启动基因，使增殖相关的蛋白、增殖细胞核抗原和Cyclin D1表达增加，修复受损肝脏。在心肌缺血性疾病中，Teng等[44]研究发现，MEX能够诱导血管新生，抑制T淋巴细胞增殖，改善缺血后的微环境，从而促进心肌缺血后功能的恢复。Zhao等[45]研究显示，人脐带MSCs来源的外泌体能够显著增强心肌细胞在低氧条件下Bcl-2（一种重要的抗凋亡蛋白）的表达，增强急性心肌缺血边缘区域Ki67蛋白（与细胞增殖密切相关，可减轻急性心肌缺血损伤）的表达。此外，STAT3信号通路在伤口愈合过程中发挥重要作用，包括迁移、增殖、血管新生以及生长因子的产生[46]；Shabbir等[46]研究发现MEX能够促进伤口愈合，主要通过激活多个生长因子信号级联，包括Akt、STAT3和ERK，使生长因子HGF、IL-6、IGF-1、NGF和基质细胞来源因子1表达量增加；作者认为这些因子的释放激活了Akt和ERK1/2信号级联，并进一步激活了STAT3信号通路。Zhang等[47]首次发现了诱导多能干细胞源性MEX可以促进胶原合成和血管新生，从而促进皮肤伤口的愈合。MEX在生物体内多个系统损伤中均表现出优越的修复效果，为进一步研究MEX内容物发挥生物效应机制奠定了前提基础。
4 小结与展望
以上大量研究表明，在多种动物模型中，MEX均表现出理想的损伤修复效果；并且外泌体中包含的丰富RNA和蛋白质等生物活性物质，在体内运送到靶细胞过程中也不会降解，所以外泌体被认为是理想的药物运输工具[48]。此外，一些研究证明，通过对来源细胞的预处理比如基因干预等，能够改变外泌体的分泌特征以及功能作用[49-50]。参考大量关于MSCs转基因修饰的文献报道[51-53]，我们认为MSCs经过预处理后释放的外泌体将是基因或细胞治疗过程中理想的药物或基因传送介质。此外，同一种MSCs在不同生长阶段培养基中获得的外泌体，其所含生物活性物质并不完全一样，为了达到不同的实验要求，还需要进一步标准化外泌体的提取和收集。
MEX功能也具有个体差异性，据文献报道，各种组织来源MSCs具有相似的表面标志，但是其产生细胞因子的类型及数量以及对炎症的反应能力，均表现出明显不同[54]。供体的年龄和性别也影响MSCs的一些特点，比如表面标志和克隆能力[55]。我们需要进一步明确供体MSCs的特征与它们分泌外泌体功能之间的关系，MEX中生物活性物质特点与MEX治疗作用间的关系，以及供体MSCs的特征与MEX产量是否存在相关性，以期为预测临床应用MEX治疗损伤修复的效果提供更加准确的信息。
同时，我们还应注意到MEX的致癌风险。MEX在损伤组织中具有促增殖作用，说明它也可能加快癌症进展。目前对于MEX是否具有致癌风险仍在讨论中。文献报道MEX可抑制膀胱癌细胞的生长[56]，但能够促进肾癌细胞的生长和侵袭[57]。这两种不同的结果表明MEX对癌细胞的作用可能具有类型依赖性。在MEX应用于临床前我们还需要对此矛盾问题进行更加全面的研究。