引用本文： 刘亦舒, 郑志芳, 程飚. 盐酸普萘洛尔乳膏对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(6): 742-747. doi: 10.7507/1002-1892.20160152 复制
糖尿病溃疡是糖尿病严重慢性并发症之一[1]，治疗难度较大、病程长，普遍存在着上皮化缓慢、血管神经受损和感染等问题。普萘洛尔作为一种非选择性的β受体阻滞剂，首先用于心血管疾病的治疗[2]。近年研究发现，普萘洛尔可用于烧伤创面的治疗。对小儿烧伤，普萘洛尔能减轻代谢亢进并逆转肌肉蛋白质的分解代谢，促进烧伤创面愈合[3]。而普萘洛尔用于成人烧伤患者的安全性及有效性需要进一步观察研究[4]。Romana-Souza等[5]研究发现口服普萘洛尔可有效减少局部炎性反应和改善后续修复过程，从而促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合。Kunzi-Rapp[6]研究表明普萘洛尔可促进婴幼儿血管瘤表面溃疡愈合。本课题组前期研究亦表明口服普萘洛尔对婴幼儿严重血管瘤具有良好疗效[7]，并研发制作了盐酸普萘洛尔乳膏（专利号：CN201310003911.5）[8]。目前，有关外用普萘洛尔能否促进糖尿病创面愈合罕见报道。本研究旨在观察外用盐酸普萘洛尔乳膏对糖尿病小鼠创面愈合的影响，分析其可能机制，为临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8周龄雌性自发性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠18只，体质量35～40 g，购于南京大学-南京生物医药研究院。盐酸普萘洛尔乳膏（2 000 g乳膏含20 g盐酸普萘洛尔）、对照用乳膏（除不含盐酸普萘洛尔外，其他成分与盐酸普萘洛尔乳膏一致），均由广州军区广州总医院药剂科提供。IL-1β、促血管生成素2 （angiogenin 2，Ang2） 抗体（Abcam公司，英国）。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国 ）；BX-51光学显微镜（Olympus公司，日本）；电泳仪、凝胶成像系统（Bio-Rad公司、美国）。
1.2 实验分组及方法
18只小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为对照组及实验组，每组9只。两组小鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，在背部中线两侧（间距1 cm 以上） 用打孔器各制备直径为0.6 cm的圆形全层皮肤缺损创面。无菌纱布压迫止血后，实验组及对照组分别涂抹盐酸普萘洛尔乳膏和对照用乳膏，以完全覆盖创面为准，外用无菌纱布包扎固定，单笼饲养。术后2、5、7、10、14、17 d换药，换药时擦掉创面未吸收的乳膏，重新涂抹相应乳膏。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后2、5、7、10、14、17、21 d，大体观察创面愈合情况；照相后采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量创面面积，根据以下公式计算创面愈合率[9]：[1－（创面面积/创面初始面积）]×100%。
1.3.2 组织学观察
术后2、5、7、10、14、17 d两组随机各取1只小鼠，21 d时取剩余3只小鼠，腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg） 麻醉，切取创缘外0.2 cm范围内全层皮肤及创面组织，注射过量0.6%戊巴比妥处死小鼠。将创面标本分成两部分，取一部分置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、透明，石蜡包埋，切片，片厚4 μm。行HE、Masson及甲苯胺蓝染色，镜下分别观察创面再上皮化、胶原纤维、肥大细胞情况。Masson染色胶原纤维呈蓝色，甲苯胺蓝染色肥大细胞颗粒呈紫红色。
1.3.3 Western blot观测
各时间点取另一部分创面标本，采用Western blot法检测组织内IL-1β、Ang-2蛋白表达情况。取100 mg组织于研磨器内，加入500 μL 细胞裂解液，研磨后转移至1.5 mL EP管内，冰上裂解30 min。4℃，14 000×g离心10 min，收集上清。取提取的蛋白溶液与5×上样缓冲液按4:1比例混合，煮沸10 min，恢复室温，— 20℃保存，BCA法测定蛋白浓度。每种样品50 μg，常规电泳、转膜、漂洗后，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。TBST洗膜10 min，1次；采用稀释后一抗[IL-1β（1:1 000）、Ang2（1:3 000）]4℃孵育过夜；TBST洗膜10 min，4次；采用羊抗兔二抗（1:20 000）稀释液37℃孵育1 h；TBST洗膜10 min，4次。X线片显影，通过凝胶成像系统分析，以GAPDH作为内参，以目标蛋白与GAPDH吸光度（A）值比值作为目标蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
实验组：术后2 d创面边缘皮肤稍肿胀，基底苍白；5～14 d创面逐渐缩小，基底红润，肉芽组织生长良好，无明显渗出，边缘可见新生上皮；17、21 d基本完成再上皮化。对照组：术后2、5 d创面边缘皮肤肿胀明显，基底苍白，部分组织坏死，伴少许渗出；7、10 d创面逐渐缩小，基底稍红润，肉芽组织生长缓慢；14、17 d创面明显缩小，边缘可见新生上皮；21 d未完全完成再上皮化。术后2～17 d，实验组创面愈合率均高于对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；21 d，两组创面愈合率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1、2。
图1
两组术后各时间点创面愈合率比较
Figure1.
Comparison of the wound healing rate between 2 groups at different time points
图2
术后各时间点两组创面大体观察 ⓐ ～ⓓ 实验组术后即刻及5、14、21 d ⓔ ～ⓗ 对照组术后即刻及5、14、21 d 图 3 术后各时间点两组HE染色观察（×200） ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d
Figure2.
Gross observation of wounds healing at different time points ⓐ -ⓓ Experimental group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation ⓔ -ⓗ Control group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation Fig. 3 HE staining observation at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓓ -ⓕ Control group at 5, 14, and 21 days after operation
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
术后2 d两组创面以炎性反应为主，实验组创缘开始出现表皮增厚，对照组未见明显表皮增厚。5 d，对照组开始出现表皮增厚，实验组创缘表皮增厚较明显且较多炎性细胞浸润。7～14 d，实验组炎性细胞浸润逐渐减少，基底毛细血管逐渐增多，可见角质形成细胞向创面中心爬行；而对照组仍存在较多炎性细胞浸润，角质形成细胞爬行缓慢。21 d两组大部分创面均已被上皮覆盖，实验组可见皮肤附属器生成，对照组真皮乳头层层次不明显。见图 3。
2.2.2 Masson染色
术后2 d两组胶原纤维少；5～21 d实验组胶原纤维范围大于对照组，但两组胶原纤维排列均较紊乱且粗细不均。见图 4。
图4
术后各时间点两组Masson染色观察（×200）ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d 图 5 术后各时间点两组甲苯胺蓝染色观察（×200）ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d 图 6 Western blot观察术后各时间点两组IL-1β、Ang2蛋白表达 1： 2 d 2：5 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d 6：17 d 7：21 d ⓐ 实验组 ⓑ 对照组
Figure4.
Masson staining at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓐ -ⓒ Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 5 Toluidine blue staining at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓐ -ⓒ Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 6 Western blot results of IL-1 β and Ang2 in 2 groups 1: At 2 days 2 : At 5 days 3: At 7 days 4: At 10 days 5: At 14 days 6: At 17 days 7: At 21 days ⓐ Experimental group ⓑ Control group
2.2.3 甲苯胺蓝染色
术后2～10 d两组见少量阳性染色细胞；14、17 d两组均未见阳性染色细胞；21 d对照组见少量阳性染色细胞，实验组未见阳性染色细胞。见图 5。
2.3 Western blot观测
除术后10 d外，其余各时间点实验组IL-1β蛋白相对表达量均低于对照组；术后各时间点实验组Ang2蛋白相对表达量均低于对照组（图 6）。术后2、5、7、10、14、17 d，实验组IL-1β蛋白相对表达量分别为0.014、0.052、0.037、0.119、0.094、0.069，对照组分别为0.295、0.409、0.658、0.028、0.206、0.172；实验组Ang2蛋白相对表达量分别为0.026、0.035、0.069、0.085、0.113、0.128，对照组分别为0.068、0.598、0.241、0.524、0.382、0.270。术后21 d，实验组IL-1β及Ang2蛋白相对表达量分别为0.060±0.030、0.152±0.028，均低于对照组的0.170±0.105、0.212±0.069，但差异无统计学意义（t=1.759，P=0.153；t=1.387，P=0.238）。
3 讨论
皮肤组织中分布着丰富的交感神经，交感神经节后纤维通过调节血管舒缩功能、立毛肌活动及腺体分泌维持皮肤微环境稳态，有研究表明交感神经在创面愈合中起重要作用[10]。此外，烧伤及创伤所致的应激状态下高水平儿茶酚胺能抑制创面愈合，而口服高剂量普萘洛尔能拮抗该过程，从而促进创面愈合[11]。外用普萘洛尔是否也能改善交感神经功能尚未明确。Vestita等[12]报道局部外用普萘洛尔可治疗足底较深慢性溃疡。此外，与普萘洛尔类似的β受体阻滞剂噻吗洛尔已用于慢性创面的治疗[13]。Romana-Souza[6]报道口服普萘洛尔可促进糖尿病大鼠创面愈合，但该研究采用的是链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠。有研究报道自发突变的糖尿病小鼠更适合进行糖尿病慢性创面的研究[14]。为此本实验选择自发性糖尿病小鼠，观察外用盐酸普萘洛尔乳膏治疗慢性创面的可行性，并探讨其作用机制，为临床应用提供理论依据。
创面愈合过程包括急性炎症期、细胞增殖期和瘢痕形成期，角质形成细胞及成纤维细胞在创面愈合过程中发挥重要作用，其中表皮细胞作为一个独立的神经内分泌器官参与了创面愈合过程[15]。再上皮化是定义创面成功愈合的一个重要标志性过程，所有慢性创面的再上皮化进程均受到抑制[15]。有研究发现，肾上腺素通过与β2受体结合抑制角质形成细胞迁移，从而延迟再上皮化[16]。本研究发现实验组创面再上皮化快于对照组，因此加速上皮化可能是普萘洛尔促进糖尿病小鼠创面愈合的机制之一。这与Pullar等[17]报道的β受体阻滞剂可促进角质形成细胞增殖迁移一致。
IL-1β是一种具有多种生物活性的炎性细胞因子，能调节许多局部和系统的炎性反应。IL-1β由成纤维细胞产生，并对巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞等产生生物学作用。研究表明，糖尿病足难治溃疡组织内IL-1β显著增高，进而抑制成纤维细胞的增殖[18]。本研究结果表明，普萘洛尔乳膏能促进创面愈合，术后10 d实验组IL-1β 蛋白相对表达量高于对照组不排除是实验误差的可能，总体来看实验组IL-1β蛋白相对表达量均低于对照组。胶原组织主要由成纤维细胞分泌产生，对创面愈合起到重要作用，普萘洛尔能抑制IL-1β的表达，减少其对成纤维细胞的抑制，从而使胶原增多，促进创面愈合，这可能也是外用普萘洛尔促进创面愈合的原因之一。
在糖尿病创面中，血管内皮细胞增殖活跃，但由于缺乏功能性的毛细血管，所以不能提供血供。这一机制可能与持续不正常的Ang表达和VEGF下调有关[19]。既往研究发现，Ang2主要由血管内皮细胞合成，通过自分泌作用，与自身细胞膜上的Tie2受体特异性结合，但不引起受体磷酸化和随后的信号传递。Ang2的主要功能是竞争性抑制Ang1形成不稳定的血管。李小强等[20]报道负压伤口疗法可通过增强Ang1的表达，降低Ang2的表达，促进糖尿病大鼠伤口的血管发生。Kämpfer等[21]报道糖尿病小鼠创面Ang2的过度表达可降低VEGF含量，不利于血管形成。本研究表明，实验组Ang2蛋白相对表达量较对照组减少，这可能是盐酸普萘洛尔乳膏促进创面愈合的机制之一。也有研究表明普萘洛尔不能抑制视网膜病理性新血管形成，且不改变Ang2的表达[22]。因此普萘洛尔与Ang2关系还需进一步研究。
总之，局部外用盐酸普萘洛尔乳膏可促进自发性糖尿病小鼠创面愈合，其机制涉及多个方面，包括表皮细胞的增殖、炎症的抑制、血管的稳定等方面。此外，本研究观察样本量少，未对各时间点IL-1β及Ang2相对表达量进行统计学分析，且21 d时两组差异无统计学意义，有关普萘洛尔促进慢性创面愈合的机制尚有待深入研究。
糖尿病溃疡是糖尿病严重慢性并发症之一[1]，治疗难度较大、病程长，普遍存在着上皮化缓慢、血管神经受损和感染等问题。普萘洛尔作为一种非选择性的β受体阻滞剂，首先用于心血管疾病的治疗[2]。近年研究发现，普萘洛尔可用于烧伤创面的治疗。对小儿烧伤，普萘洛尔能减轻代谢亢进并逆转肌肉蛋白质的分解代谢，促进烧伤创面愈合[3]。而普萘洛尔用于成人烧伤患者的安全性及有效性需要进一步观察研究[4]。Romana-Souza等[5]研究发现口服普萘洛尔可有效减少局部炎性反应和改善后续修复过程，从而促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合。Kunzi-Rapp[6]研究表明普萘洛尔可促进婴幼儿血管瘤表面溃疡愈合。本课题组前期研究亦表明口服普萘洛尔对婴幼儿严重血管瘤具有良好疗效[7]，并研发制作了盐酸普萘洛尔乳膏（专利号：CN201310003911.5）[8]。目前，有关外用普萘洛尔能否促进糖尿病创面愈合罕见报道。本研究旨在观察外用盐酸普萘洛尔乳膏对糖尿病小鼠创面愈合的影响，分析其可能机制，为临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8周龄雌性自发性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠18只，体质量35～40 g，购于南京大学-南京生物医药研究院。盐酸普萘洛尔乳膏（2 000 g乳膏含20 g盐酸普萘洛尔）、对照用乳膏（除不含盐酸普萘洛尔外，其他成分与盐酸普萘洛尔乳膏一致），均由广州军区广州总医院药剂科提供。IL-1β、促血管生成素2 （angiogenin 2，Ang2） 抗体（Abcam公司，英国）。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国 ）；BX-51光学显微镜（Olympus公司，日本）；电泳仪、凝胶成像系统（Bio-Rad公司、美国）。
1.2 实验分组及方法
18只小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为对照组及实验组，每组9只。两组小鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，在背部中线两侧（间距1 cm 以上） 用打孔器各制备直径为0.6 cm的圆形全层皮肤缺损创面。无菌纱布压迫止血后，实验组及对照组分别涂抹盐酸普萘洛尔乳膏和对照用乳膏，以完全覆盖创面为准，外用无菌纱布包扎固定，单笼饲养。术后2、5、7、10、14、17 d换药，换药时擦掉创面未吸收的乳膏，重新涂抹相应乳膏。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后2、5、7、10、14、17、21 d，大体观察创面愈合情况；照相后采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量创面面积，根据以下公式计算创面愈合率[9]：[1－（创面面积/创面初始面积）]×100%。
1.3.2 组织学观察
术后2、5、7、10、14、17 d两组随机各取1只小鼠，21 d时取剩余3只小鼠，腹腔注射0.6%戊巴比妥（40 mg/kg） 麻醉，切取创缘外0.2 cm范围内全层皮肤及创面组织，注射过量0.6%戊巴比妥处死小鼠。将创面标本分成两部分，取一部分置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、透明，石蜡包埋，切片，片厚4 μm。行HE、Masson及甲苯胺蓝染色，镜下分别观察创面再上皮化、胶原纤维、肥大细胞情况。Masson染色胶原纤维呈蓝色，甲苯胺蓝染色肥大细胞颗粒呈紫红色。
1.3.3 Western blot观测
各时间点取另一部分创面标本，采用Western blot法检测组织内IL-1β、Ang-2蛋白表达情况。取100 mg组织于研磨器内，加入500 μL 细胞裂解液，研磨后转移至1.5 mL EP管内，冰上裂解30 min。4℃，14 000×g离心10 min，收集上清。取提取的蛋白溶液与5×上样缓冲液按4:1比例混合，煮沸10 min，恢复室温，— 20℃保存，BCA法测定蛋白浓度。每种样品50 μg，常规电泳、转膜、漂洗后，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。TBST洗膜10 min，1次；采用稀释后一抗[IL-1β（1:1 000）、Ang2（1:3 000）]4℃孵育过夜；TBST洗膜10 min，4次；采用羊抗兔二抗（1:20 000）稀释液37℃孵育1 h；TBST洗膜10 min，4次。X线片显影，通过凝胶成像系统分析，以GAPDH作为内参，以目标蛋白与GAPDH吸光度（A）值比值作为目标蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
实验组：术后2 d创面边缘皮肤稍肿胀，基底苍白；5～14 d创面逐渐缩小，基底红润，肉芽组织生长良好，无明显渗出，边缘可见新生上皮；17、21 d基本完成再上皮化。对照组：术后2、5 d创面边缘皮肤肿胀明显，基底苍白，部分组织坏死，伴少许渗出；7、10 d创面逐渐缩小，基底稍红润，肉芽组织生长缓慢；14、17 d创面明显缩小，边缘可见新生上皮；21 d未完全完成再上皮化。术后2～17 d，实验组创面愈合率均高于对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；21 d，两组创面愈合率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1、2。
图1
两组术后各时间点创面愈合率比较
Figure1.
Comparison of the wound healing rate between 2 groups at different time points
图2
术后各时间点两组创面大体观察 ⓐ ～ⓓ 实验组术后即刻及5、14、21 d ⓔ ～ⓗ 对照组术后即刻及5、14、21 d 图 3 术后各时间点两组HE染色观察（×200） ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d
Figure2.
Gross observation of wounds healing at different time points ⓐ -ⓓ Experimental group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation ⓔ -ⓗ Control group at immediate, 5, 14, and 21 days after operation Fig. 3 HE staining observation at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓓ -ⓕ Control group at 5, 14, and 21 days after operation
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
术后2 d两组创面以炎性反应为主，实验组创缘开始出现表皮增厚，对照组未见明显表皮增厚。5 d，对照组开始出现表皮增厚，实验组创缘表皮增厚较明显且较多炎性细胞浸润。7～14 d，实验组炎性细胞浸润逐渐减少，基底毛细血管逐渐增多，可见角质形成细胞向创面中心爬行；而对照组仍存在较多炎性细胞浸润，角质形成细胞爬行缓慢。21 d两组大部分创面均已被上皮覆盖，实验组可见皮肤附属器生成，对照组真皮乳头层层次不明显。见图 3。
2.2.2 Masson染色
术后2 d两组胶原纤维少；5～21 d实验组胶原纤维范围大于对照组，但两组胶原纤维排列均较紊乱且粗细不均。见图 4。
图4
术后各时间点两组Masson染色观察（×200）ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d 图 5 术后各时间点两组甲苯胺蓝染色观察（×200）ⓐ ～ⓒ 实验组术后5、14、21 d ⓓ ～ⓕ 对照组术后5、14、21 d 图 6 Western blot观察术后各时间点两组IL-1β、Ang2蛋白表达 1： 2 d 2：5 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d 6：17 d 7：21 d ⓐ 实验组 ⓑ 对照组
Figure4.
Masson staining at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓐ -ⓒ Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 5 Toluidine blue staining at different time points (×200) ⓐ -ⓒ Experimental group at 5, 14, and 21 days after operation ⓐ -ⓒ Control group at 5, 14, and 21 days after operation Fig. 6 Western blot results of IL-1 β and Ang2 in 2 groups 1: At 2 days 2 : At 5 days 3: At 7 days 4: At 10 days 5: At 14 days 6: At 17 days 7: At 21 days ⓐ Experimental group ⓑ Control group
2.2.3 甲苯胺蓝染色
术后2～10 d两组见少量阳性染色细胞；14、17 d两组均未见阳性染色细胞；21 d对照组见少量阳性染色细胞，实验组未见阳性染色细胞。见图 5。
2.3 Western blot观测
除术后10 d外，其余各时间点实验组IL-1β蛋白相对表达量均低于对照组；术后各时间点实验组Ang2蛋白相对表达量均低于对照组（图 6）。术后2、5、7、10、14、17 d，实验组IL-1β蛋白相对表达量分别为0.014、0.052、0.037、0.119、0.094、0.069，对照组分别为0.295、0.409、0.658、0.028、0.206、0.172；实验组Ang2蛋白相对表达量分别为0.026、0.035、0.069、0.085、0.113、0.128，对照组分别为0.068、0.598、0.241、0.524、0.382、0.270。术后21 d，实验组IL-1β及Ang2蛋白相对表达量分别为0.060±0.030、0.152±0.028，均低于对照组的0.170±0.105、0.212±0.069，但差异无统计学意义（t=1.759，P=0.153；t=1.387，P=0.238）。
3 讨论
皮肤组织中分布着丰富的交感神经，交感神经节后纤维通过调节血管舒缩功能、立毛肌活动及腺体分泌维持皮肤微环境稳态，有研究表明交感神经在创面愈合中起重要作用[10]。此外，烧伤及创伤所致的应激状态下高水平儿茶酚胺能抑制创面愈合，而口服高剂量普萘洛尔能拮抗该过程，从而促进创面愈合[11]。外用普萘洛尔是否也能改善交感神经功能尚未明确。Vestita等[12]报道局部外用普萘洛尔可治疗足底较深慢性溃疡。此外，与普萘洛尔类似的β受体阻滞剂噻吗洛尔已用于慢性创面的治疗[13]。Romana-Souza[6]报道口服普萘洛尔可促进糖尿病大鼠创面愈合，但该研究采用的是链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠。有研究报道自发突变的糖尿病小鼠更适合进行糖尿病慢性创面的研究[14]。为此本实验选择自发性糖尿病小鼠，观察外用盐酸普萘洛尔乳膏治疗慢性创面的可行性，并探讨其作用机制，为临床应用提供理论依据。
创面愈合过程包括急性炎症期、细胞增殖期和瘢痕形成期，角质形成细胞及成纤维细胞在创面愈合过程中发挥重要作用，其中表皮细胞作为一个独立的神经内分泌器官参与了创面愈合过程[15]。再上皮化是定义创面成功愈合的一个重要标志性过程，所有慢性创面的再上皮化进程均受到抑制[15]。有研究发现，肾上腺素通过与β2受体结合抑制角质形成细胞迁移，从而延迟再上皮化[16]。本研究发现实验组创面再上皮化快于对照组，因此加速上皮化可能是普萘洛尔促进糖尿病小鼠创面愈合的机制之一。这与Pullar等[17]报道的β受体阻滞剂可促进角质形成细胞增殖迁移一致。
IL-1β是一种具有多种生物活性的炎性细胞因子，能调节许多局部和系统的炎性反应。IL-1β由成纤维细胞产生，并对巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞等产生生物学作用。研究表明，糖尿病足难治溃疡组织内IL-1β显著增高，进而抑制成纤维细胞的增殖[18]。本研究结果表明，普萘洛尔乳膏能促进创面愈合，术后10 d实验组IL-1β 蛋白相对表达量高于对照组不排除是实验误差的可能，总体来看实验组IL-1β蛋白相对表达量均低于对照组。胶原组织主要由成纤维细胞分泌产生，对创面愈合起到重要作用，普萘洛尔能抑制IL-1β的表达，减少其对成纤维细胞的抑制，从而使胶原增多，促进创面愈合，这可能也是外用普萘洛尔促进创面愈合的原因之一。
在糖尿病创面中，血管内皮细胞增殖活跃，但由于缺乏功能性的毛细血管，所以不能提供血供。这一机制可能与持续不正常的Ang表达和VEGF下调有关[19]。既往研究发现，Ang2主要由血管内皮细胞合成，通过自分泌作用，与自身细胞膜上的Tie2受体特异性结合，但不引起受体磷酸化和随后的信号传递。Ang2的主要功能是竞争性抑制Ang1形成不稳定的血管。李小强等[20]报道负压伤口疗法可通过增强Ang1的表达，降低Ang2的表达，促进糖尿病大鼠伤口的血管发生。Kämpfer等[21]报道糖尿病小鼠创面Ang2的过度表达可降低VEGF含量，不利于血管形成。本研究表明，实验组Ang2蛋白相对表达量较对照组减少，这可能是盐酸普萘洛尔乳膏促进创面愈合的机制之一。也有研究表明普萘洛尔不能抑制视网膜病理性新血管形成，且不改变Ang2的表达[22]。因此普萘洛尔与Ang2关系还需进一步研究。
总之，局部外用盐酸普萘洛尔乳膏可促进自发性糖尿病小鼠创面愈合，其机制涉及多个方面，包括表皮细胞的增殖、炎症的抑制、血管的稳定等方面。此外，本研究观察样本量少，未对各时间点IL-1β及Ang2相对表达量进行统计学分析，且21 d时两组差异无统计学意义，有关普萘洛尔促进慢性创面愈合的机制尚有待深入研究。
