引用本文： 梁嘉碧, 李俊, 汪婷, 梁雨虹, 邹学农, 周光前, 周治宇. 原位交联透明质酸水凝胶的制备及体外生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(6): 767-771. doi: 10.7507/1002-1892.20160156 复制
原位交联水凝胶是一类以溶液状态给药后，能在用药部位发生相转变，由液态转化形成半固体凝胶的制剂。将这类材料应用于微创手术中，不仅能最大限度减轻患者痛苦与瘢痕形成，还能降低手术费用、缩短治疗时间[1-5]。透明质酸钠具有良好的理化性能及生物相容性[6-10]，目前已广泛用于心脏瓣膜、软骨、神经、角膜及皮肤的修复重建 [11-13]。但它在体内因受到透明质酸酶的酶解作用而降解迅速，存留时间较短。研究表明，透明质酸钠经交联剂交联修饰后可得到高分子凝胶，能弥补这一缺点，同时仍具有良好的生物相容性[14-15]。
本研究拟将巯基化修饰后的透明质酸与交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol acrylate，PEGDA）交联，制备一种交联时间可控、存留时间长、细胞毒性低、生物相容性好，且无需任何特殊条件架。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
透明质酸（相对分子质量300 000；华熙福瑞达生物医药有限公司）；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG；相对分子质量3 500）、3，3-二巯基二丙酸酰肼[dithiobis (propanoic dihydrazide)，DTP]、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、EDCI （Sigma公司，美国）；1640培养基、FBS（HyClone公司，美国）；活/死细胞染色试剂盒（BioVision公司，美国）；金属钠（天津大茂化学试剂厂）。
傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet公司，美国）；核磁共振光谱仪（Bruker Daltonics公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Thermo公司，芬兰）；培养箱（Thermo公司，美国）；荧光显微镜（Zeiss公司，德国）。
1.2 原位交联透明质酸水凝胶的制备
1.2.1 PEGDA制备与检测
取PEG 17.5 g加入250 mL二氯甲烷，通氩气10 min，磁力搅拌，40℃水浴加热，分2次投入金属钠共0.5 g、反应6 h，加入丙烯酰氯3 mL、反应18 h，过滤，滤液旋转蒸发3 h，真空干燥24 h，获得PEGDA。
采用傅里叶变换红外光谱仪检测PEGDA结构，扫描波数范围为400～4 000 cm-1。核磁共振光谱仪测试PEGDA结构，扫描范围为0～10 ppm。
1.2.2 巯基化透明质酸（hyaluronic acid thiolation，HA-SH）制备与检测
取2 g透明质酸加入200 mL灭菌三蒸水中，搅拌溶解，加入2.38 g巯基化试剂DTP，盐酸调节pH值至4.75，加入1.92 g EDCI，搅拌24 h，NaOH调节pH值至7.0，加入DTT 10 g，NaOH调节pH值至8.5，搅拌24 h，盐酸调节pH值至3.5，装入相对分子质量为3 500的透析袋，分别在100 mmol/L NaCl（pH3.5）和灭菌三蒸水（pH3.5）中透析，以离心半径13.5 cm、2 500 r/min 离心5 min，取上清液冷冻干燥，获得HA-SH。
HA-SH由重复二糖结构组成，每个二糖单元含有一个可反应的羧基，接上巯基后的相对分子质量为491。称取HA-SH 0.005 3 g，配制成0.05 L溶液，若羧基全部被取代，内含巯基量（N总）约为10.8 μmol（0.005 3 g/491）。采用Ellman法[16]测定制备的HA-SH中巯基含量（N测），计算羧基覆盖率（N测/N总×100%），即巯基化产率。
1.2.3 交联反应
将HA-SH和PEGDA分别用PBS（pH7.4）配制成一定浓度（W/V）的溶液，用0.22 μm滤膜过滤灭菌，按5种不同比例混合（表 1），涡旋5 s，放置于37℃水浴中，定时观察成胶情况；从两种溶液混合开始计时，记录交联反应时间。每个浓度平行配制3份样品。
表1
原位交联透明质酸水凝胶的组成及交联时间测定（n=3）
Table1.
Composition and crosslinking time of the in situ crosslinking hyaluronic acid hydrogels(n=3)
1.3 观测指标
1.3.1 细胞毒性检测
① 浸提液制备：取1.5%HA-SH及4%PEGDA交联获得的透明质酸水凝胶0.1 g，加入1 mL含10%FBS的1640培养基浸提24 h。② 细胞分组培养：实验分为4组，分别为水凝胶组（实验组）、生理盐水组（阴性对照组）、DMSO组（阳性对照组）以及未处理组（空白对照组）。取L929细胞（HyClone公司，美国），调整至浓度为4×104 个 /100 μL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组3 个复孔。待细胞融合达95%时，按照分组分别加入浸提液、含10%FBS的1640培养基、DMSO溶液或生理盐水（表 2）。于37°C、5%CO2培养箱中培养24 h。③ 细胞毒性检测：参照ISO10993.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验的方法与要求对产品进行毒性评价。培养24 h后各组取3孔，弃上清，每孔加入100 μL含10%FBS的1640培养基和20 μL MTS试剂，混匀，置于培养箱孵育2 h，于酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值。按照以下公式分别计算实验组、阴性对照组、阳性对照组细胞相对增殖率，细胞相对增殖率 =实验组、阴性对照组或阳性对照组A值/空白对照组A值×100%。材料毒性分级标准：细胞相对增殖率≥ 90%为0级，70%～90%为1级，50%～70%为2级，30%～50%为3级，0～30%为4级。
表2
各组培养试剂成分（μL）
Table2.
Ingredients of nutrient solution(μL)
1.3.2 生物相容性检测
取HA-SH和PEGDA分别用DMEM/F12培养基配制成浓度为1.5% （W/V）和4%（W/V）的溶液，滤膜过滤灭菌，混合后涡旋5 s，加入人BMSCs（本实验室自制），混匀，调整细胞悬液浓度为2×106 个 / mL，接种于24孔板中，每孔100 μL，于37°C、5%CO2 培养箱中培养。培养72 h后，采用活/死细胞染色试剂进行染色，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞质呈绿染为活细胞、红染为死细胞。
2 结果
2.1 PEGDA及HA-SH检测
傅里叶变换红外光谱仪分析显示，PEGDA在3 500 cm-1表征羟基的特征峰明显减弱，而在1 700 cm-1左右出现丙烯酸酯的羰基特征峰，提示大多数羟基被丙烯酸酯基取代。见图 1。
图1
PEGDA的红外吸收光谱图 图 2 PEGDA的核磁共振氢谱图 图 3 1.5%HA-SH与4%PEGDA交联形成的透明质酸水凝胶外观 图 4 培养72 h荧光显微镜观察BMSCs形态 ⓐ ×40 ⓑ ×100 ⓒ ×200 图 5 培养72 h人BMSCs活/死细胞染色观察（荧光显微镜× 100）
Figure1.
Fourier transformation infrared spectrometer of PEGDA Fig. 2 1H nuclear magnetic resonance spectrometer of PEGDA Fig. 3 The appearance of the hydrogel crosslinking by 1.5%HA-SH and 4%PEGDA Fig. 4 Morphology observation of hBMSCs under fluorescence microscopy at 72 hours ⓐ ×40 ⓑ ×100 ⓒ ×200 Fig. 5 hBMSCs viability observation by live/dead cell staining at 72 hours (Fluorescence microscopy×100)
核磁共振光谱仪分析显示，PEGDA的核磁共振氢谱在5～7 ppm出现3组表征丙烯酸酯基的与烯键相连的氢的特征峰。见图 2。HA-SH的巯基化产率为65.4%。
2.2 交联反应时间及大体观察
2%～6%PEGDA与0.5%～1.5%HA-SH经不同比例混合后，交联反应在2～70 min内完成。见表 1。大体观察示，不同浓度及比例交联形成的透明质酸水凝胶均呈透明状。见图 3。
2.3 细胞毒性检测
实验组、阴性对照组及阳性对照组细胞相对增殖率分别为87.08%±2.35%、97.92%±3.55%及8.33%± 1.03%，细胞毒性分级分别为1级、0级和4级。提示制备的透明质酸水凝胶材料细胞毒性分级满足生物医用材料的要求。
2.4 生物相容性检测
培养72 h后，荧光显微镜下观察人BMSCs在透明质酸水凝胶中生长状态稳定，形态良好，轮廓清晰，分布均匀。活/死细胞染色示以绿染的活细胞为主，只有极少数红染的死细胞。见图 4、5。
3 讨论
化学交联一般通过缩聚反应和加聚反应来实现，如橡胶的硫化、不饱和聚酯树脂的固化等。本研究将透明质酸进行巯基化后，与PEGDA进行交联形成透明状水凝胶，交联过程不需要特殊环境与条件，也不需要特殊设备。通过调整HA-SH和PEGDA的配比，材料可控制在2～70 min内发生相转变。
PEGDA的合成分为“醇-酸”法、“醇-酰氯”法和“醇钠-酰氯”法[17-20]。其中“醇-酸”法使用较多，其优点是原料易获得、反应体系简单、副反应少，并且反应不受氧气和水分的影响。但这一反应中PEG的端羟基活性较低，随着相对分子质量增大，端羟基转化程度降低，因此仅适用于相对分子质量小的PEGDA合成。由于丙烯酰氯的反应活性较高，“醇-酰氯”法反应速度较“醇-酸”法有所提高，在室温下即可进行，但该方法仍不宜合成相对分子质量过大的PEGDA。“醇钠-酰氯”法在前两种方法基础上进一步改进，其反应速度更快，且可用于相对分子质量更大的PEGDA合成。本研究选择“醇钠-酰氯”法合成的PEGDA相对分子质量达3 500。实验过程中需要注意，丙烯酰氯易受水分影响，故实验装置必须严格控水，所有容器烘干，与外界相连的部分需加干燥管，内填充无水氯化钙。另外，金属钠暴露于空气中会迅速氧化，并在金属块表面形成氧化钠，影响反应进程，故反应装置中需充入惰性气体进行保护。通过傅里叶变换红外光谱仪检测PEGDA结构，提示所得产物在3 500 cm-1表征羟基的特征峰明显减弱，而在1 700 cm-1左右出现丙烯酸酯的羰基特征峰；核磁共振光谱仪检测显示，所得产物在5～7 ppm出现了3组丙烯酸酯基的特征峰，表明有目标产物生成。
天然透明质酸分子中具有大量的羧基、羟基和乙酰氨基，研究常利用羧基改性获得衍生物。用EDCI对糖胺聚糖进行化学修饰的方法已应用了30多年，是目前得到普遍认可的修饰方法[15-16]。本研究通过采用EDCI将巯基修饰至透明质酸的羧基上，获得HA-SH，以Ellman法测算显示经过优化后巯基化产率达65.4%。
本研究中PEGDA与HA-SH发生交联反应，产生二硫键，形成水凝胶，交联反应可在室温条件下进行。交联时间随PEGDA与HA-SH的浓度和比例变化而变化，PEGDA浓度在2%～6%、HA-SH浓度在0.5%～1.5%范围内，交联反应可控制在2～70 min，最终成功制备了透明质酸水凝胶材料。
生物材料或组织工程支架需具备良好的生物相容性，本研究按照ISO10993.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验的方法与要求，检测了透明质酸水凝胶的毒性。结果提示水凝胶的细胞毒性分级为1级，符合生物医用材料的要求。进一步将人BMSCs接种于透明质酸水凝胶中培养，72 h后观察发现细胞生长状态良好，活/死细胞染色以活细胞为主。
综上述，本研究制备的原位交联透明质酸水凝胶材料，交联时间可控且操作简便，体外生物相容性好，下一步我们将进行体内组织相容性相关研究，进一步研讨其作为种子细胞载体或组织缺损填充材料的可行性。
原位交联水凝胶是一类以溶液状态给药后，能在用药部位发生相转变，由液态转化形成半固体凝胶的制剂。将这类材料应用于微创手术中，不仅能最大限度减轻患者痛苦与瘢痕形成，还能降低手术费用、缩短治疗时间[1-5]。透明质酸钠具有良好的理化性能及生物相容性[6-10]，目前已广泛用于心脏瓣膜、软骨、神经、角膜及皮肤的修复重建 [11-13]。但它在体内因受到透明质酸酶的酶解作用而降解迅速，存留时间较短。研究表明，透明质酸钠经交联剂交联修饰后可得到高分子凝胶，能弥补这一缺点，同时仍具有良好的生物相容性[14-15]。
本研究拟将巯基化修饰后的透明质酸与交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol acrylate，PEGDA）交联，制备一种交联时间可控、存留时间长、细胞毒性低、生物相容性好，且无需任何特殊条件架。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
透明质酸（相对分子质量300 000；华熙福瑞达生物医药有限公司）；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG；相对分子质量3 500）、3，3-二巯基二丙酸酰肼[dithiobis (propanoic dihydrazide)，DTP]、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、EDCI （Sigma公司，美国）；1640培养基、FBS（HyClone公司，美国）；活/死细胞染色试剂盒（BioVision公司，美国）；金属钠（天津大茂化学试剂厂）。
傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet公司，美国）；核磁共振光谱仪（Bruker Daltonics公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Thermo公司，芬兰）；培养箱（Thermo公司，美国）；荧光显微镜（Zeiss公司，德国）。
1.2 原位交联透明质酸水凝胶的制备
1.2.1 PEGDA制备与检测
取PEG 17.5 g加入250 mL二氯甲烷，通氩气10 min，磁力搅拌，40℃水浴加热，分2次投入金属钠共0.5 g、反应6 h，加入丙烯酰氯3 mL、反应18 h，过滤，滤液旋转蒸发3 h，真空干燥24 h，获得PEGDA。
采用傅里叶变换红外光谱仪检测PEGDA结构，扫描波数范围为400～4 000 cm-1。核磁共振光谱仪测试PEGDA结构，扫描范围为0～10 ppm。
1.2.2 巯基化透明质酸（hyaluronic acid thiolation，HA-SH）制备与检测
取2 g透明质酸加入200 mL灭菌三蒸水中，搅拌溶解，加入2.38 g巯基化试剂DTP，盐酸调节pH值至4.75，加入1.92 g EDCI，搅拌24 h，NaOH调节pH值至7.0，加入DTT 10 g，NaOH调节pH值至8.5，搅拌24 h，盐酸调节pH值至3.5，装入相对分子质量为3 500的透析袋，分别在100 mmol/L NaCl（pH3.5）和灭菌三蒸水（pH3.5）中透析，以离心半径13.5 cm、2 500 r/min 离心5 min，取上清液冷冻干燥，获得HA-SH。
HA-SH由重复二糖结构组成，每个二糖单元含有一个可反应的羧基，接上巯基后的相对分子质量为491。称取HA-SH 0.005 3 g，配制成0.05 L溶液，若羧基全部被取代，内含巯基量（N总）约为10.8 μmol（0.005 3 g/491）。采用Ellman法[16]测定制备的HA-SH中巯基含量（N测），计算羧基覆盖率（N测/N总×100%），即巯基化产率。
1.2.3 交联反应
将HA-SH和PEGDA分别用PBS（pH7.4）配制成一定浓度（W/V）的溶液，用0.22 μm滤膜过滤灭菌，按5种不同比例混合（表 1），涡旋5 s，放置于37℃水浴中，定时观察成胶情况；从两种溶液混合开始计时，记录交联反应时间。每个浓度平行配制3份样品。
表1
原位交联透明质酸水凝胶的组成及交联时间测定（n=3）
Table1.
Composition and crosslinking time of the in situ crosslinking hyaluronic acid hydrogels(n=3)
1.3 观测指标
1.3.1 细胞毒性检测
① 浸提液制备：取1.5%HA-SH及4%PEGDA交联获得的透明质酸水凝胶0.1 g，加入1 mL含10%FBS的1640培养基浸提24 h。② 细胞分组培养：实验分为4组，分别为水凝胶组（实验组）、生理盐水组（阴性对照组）、DMSO组（阳性对照组）以及未处理组（空白对照组）。取L929细胞（HyClone公司，美国），调整至浓度为4×104 个 /100 μL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组3 个复孔。待细胞融合达95%时，按照分组分别加入浸提液、含10%FBS的1640培养基、DMSO溶液或生理盐水（表 2）。于37°C、5%CO2培养箱中培养24 h。③ 细胞毒性检测：参照ISO10993.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验的方法与要求对产品进行毒性评价。培养24 h后各组取3孔，弃上清，每孔加入100 μL含10%FBS的1640培养基和20 μL MTS试剂，混匀，置于培养箱孵育2 h，于酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值。按照以下公式分别计算实验组、阴性对照组、阳性对照组细胞相对增殖率，细胞相对增殖率 =实验组、阴性对照组或阳性对照组A值/空白对照组A值×100%。材料毒性分级标准：细胞相对增殖率≥ 90%为0级，70%～90%为1级，50%～70%为2级，30%～50%为3级，0～30%为4级。
表2
各组培养试剂成分（μL）
Table2.
Ingredients of nutrient solution(μL)
1.3.2 生物相容性检测
取HA-SH和PEGDA分别用DMEM/F12培养基配制成浓度为1.5% （W/V）和4%（W/V）的溶液，滤膜过滤灭菌，混合后涡旋5 s，加入人BMSCs（本实验室自制），混匀，调整细胞悬液浓度为2×106 个 / mL，接种于24孔板中，每孔100 μL，于37°C、5%CO2 培养箱中培养。培养72 h后，采用活/死细胞染色试剂进行染色，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞质呈绿染为活细胞、红染为死细胞。
2 结果
2.1 PEGDA及HA-SH检测
傅里叶变换红外光谱仪分析显示，PEGDA在3 500 cm-1表征羟基的特征峰明显减弱，而在1 700 cm-1左右出现丙烯酸酯的羰基特征峰，提示大多数羟基被丙烯酸酯基取代。见图 1。
图1
PEGDA的红外吸收光谱图 图 2 PEGDA的核磁共振氢谱图 图 3 1.5%HA-SH与4%PEGDA交联形成的透明质酸水凝胶外观 图 4 培养72 h荧光显微镜观察BMSCs形态 ⓐ ×40 ⓑ ×100 ⓒ ×200 图 5 培养72 h人BMSCs活/死细胞染色观察（荧光显微镜× 100）
Figure1.
Fourier transformation infrared spectrometer of PEGDA Fig. 2 1H nuclear magnetic resonance spectrometer of PEGDA Fig. 3 The appearance of the hydrogel crosslinking by 1.5%HA-SH and 4%PEGDA Fig. 4 Morphology observation of hBMSCs under fluorescence microscopy at 72 hours ⓐ ×40 ⓑ ×100 ⓒ ×200 Fig. 5 hBMSCs viability observation by live/dead cell staining at 72 hours (Fluorescence microscopy×100)
核磁共振光谱仪分析显示，PEGDA的核磁共振氢谱在5～7 ppm出现3组表征丙烯酸酯基的与烯键相连的氢的特征峰。见图 2。HA-SH的巯基化产率为65.4%。
2.2 交联反应时间及大体观察
2%～6%PEGDA与0.5%～1.5%HA-SH经不同比例混合后，交联反应在2～70 min内完成。见表 1。大体观察示，不同浓度及比例交联形成的透明质酸水凝胶均呈透明状。见图 3。
2.3 细胞毒性检测
实验组、阴性对照组及阳性对照组细胞相对增殖率分别为87.08%±2.35%、97.92%±3.55%及8.33%± 1.03%，细胞毒性分级分别为1级、0级和4级。提示制备的透明质酸水凝胶材料细胞毒性分级满足生物医用材料的要求。
2.4 生物相容性检测
培养72 h后，荧光显微镜下观察人BMSCs在透明质酸水凝胶中生长状态稳定，形态良好，轮廓清晰，分布均匀。活/死细胞染色示以绿染的活细胞为主，只有极少数红染的死细胞。见图 4、5。
3 讨论
化学交联一般通过缩聚反应和加聚反应来实现，如橡胶的硫化、不饱和聚酯树脂的固化等。本研究将透明质酸进行巯基化后，与PEGDA进行交联形成透明状水凝胶，交联过程不需要特殊环境与条件，也不需要特殊设备。通过调整HA-SH和PEGDA的配比，材料可控制在2～70 min内发生相转变。
PEGDA的合成分为“醇-酸”法、“醇-酰氯”法和“醇钠-酰氯”法[17-20]。其中“醇-酸”法使用较多，其优点是原料易获得、反应体系简单、副反应少，并且反应不受氧气和水分的影响。但这一反应中PEG的端羟基活性较低，随着相对分子质量增大，端羟基转化程度降低，因此仅适用于相对分子质量小的PEGDA合成。由于丙烯酰氯的反应活性较高，“醇-酰氯”法反应速度较“醇-酸”法有所提高，在室温下即可进行，但该方法仍不宜合成相对分子质量过大的PEGDA。“醇钠-酰氯”法在前两种方法基础上进一步改进，其反应速度更快，且可用于相对分子质量更大的PEGDA合成。本研究选择“醇钠-酰氯”法合成的PEGDA相对分子质量达3 500。实验过程中需要注意，丙烯酰氯易受水分影响，故实验装置必须严格控水，所有容器烘干，与外界相连的部分需加干燥管，内填充无水氯化钙。另外，金属钠暴露于空气中会迅速氧化，并在金属块表面形成氧化钠，影响反应进程，故反应装置中需充入惰性气体进行保护。通过傅里叶变换红外光谱仪检测PEGDA结构，提示所得产物在3 500 cm-1表征羟基的特征峰明显减弱，而在1 700 cm-1左右出现丙烯酸酯的羰基特征峰；核磁共振光谱仪检测显示，所得产物在5～7 ppm出现了3组丙烯酸酯基的特征峰，表明有目标产物生成。
天然透明质酸分子中具有大量的羧基、羟基和乙酰氨基，研究常利用羧基改性获得衍生物。用EDCI对糖胺聚糖进行化学修饰的方法已应用了30多年，是目前得到普遍认可的修饰方法[15-16]。本研究通过采用EDCI将巯基修饰至透明质酸的羧基上，获得HA-SH，以Ellman法测算显示经过优化后巯基化产率达65.4%。
本研究中PEGDA与HA-SH发生交联反应，产生二硫键，形成水凝胶，交联反应可在室温条件下进行。交联时间随PEGDA与HA-SH的浓度和比例变化而变化，PEGDA浓度在2%～6%、HA-SH浓度在0.5%～1.5%范围内，交联反应可控制在2～70 min，最终成功制备了透明质酸水凝胶材料。
生物材料或组织工程支架需具备良好的生物相容性，本研究按照ISO10993.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验的方法与要求，检测了透明质酸水凝胶的毒性。结果提示水凝胶的细胞毒性分级为1级，符合生物医用材料的要求。进一步将人BMSCs接种于透明质酸水凝胶中培养，72 h后观察发现细胞生长状态良好，活/死细胞染色以活细胞为主。
综上述，本研究制备的原位交联透明质酸水凝胶材料，交联时间可控且操作简便，体外生物相容性好，下一步我们将进行体内组织相容性相关研究，进一步研讨其作为种子细胞载体或组织缺损填充材料的可行性。
