引用本文： 张逸凌, 刘星宇, 季欣然, 张立海, 唐佩福. 双光子显微镜活体脊髓成像的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(6): 772-775. doi: 10.7507/1002-1892.20160157 复制
目前，双光子显微镜（two-photon microscopy，TPM）已广泛应用于神经科学领域。通过结合特定细胞类型表达荧光蛋白的转基因动物模型，TPM能在长时间内对活体动物神经系统进行多次三维结构与功能的动态成像[1-2]。与弥散张量成像与MRI成像技术相比，TPM活体成像技术能在时间与空间上提供细胞水平的高分辨率三维重构图像，有利于研究神经元的突触可塑性以及神经细胞与胶质细胞的相互作用关系[3-7]，更直观地提供脊髓损伤的病理生理过程与评估药物干预的治疗效果。本文就近年来TPM活体脊髓成像的研究进展进行综述。
1 TPM活体成像技术的发展
20世纪90年代，美国康奈尔大学科学家Winfried Denk将双光子激发技术与激光扫描共聚焦显微镜相结合，研发出了TPM[8]。TPM对生物样品成像具备光漂白性小、光毒性小、穿透性强等优点，一经问世即很快应用于活体动物神经科学领域的研究中。TPM尤其适用于对小型动物模型（如斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠）进行活体成像，实现了更深层次、低激光、低热损伤、高信噪比的活体成像，能对同一动物在长时间内进行反复多次动态成像[9-13]。为了研究中枢神经系统突触的可塑性，Grutzendler等[14]应用TPM对转基因小鼠的大脑皮层进行长时间结构成像，发现树突棘在发育过程中保持着高度稳定性。在TPM成像过程中，应用磨薄颅骨技术对小鼠大脑皮层进行活体成像，能有效降低因开颅手术造成的出血与炎性反应，避免暴露大脑组织，进而研究大脑皮层树突棘在生理条件下的稳定性与可塑性[15]。TPM活体成像技术的发展，为研究神经疾病细胞水平结构与功能的变化开辟了新途径。
2 TPM活体脊髓成像技术的发展
Kerschensteiner等[16]应用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记神经细胞的转基因小鼠，对单根轴突进行针刺损伤后，采用TPM持续观察活体内单根轴突的退变与瓦勒变性的动态过程，此研究开辟了TPM活体脊髓成像的新领域。不同于大脑皮层与颅骨固定术，固定脊柱与脊髓是活体成像的一大难点；并且脊髓位于躯体深部，动物的呼吸与心跳对脊髓带来的活动会严重影响TPM活体脊髓成像的质量，断层扫描图片需经过复杂的后期处理与重建才能得到清晰图片[17]。Davalos等[18]应用小鼠悬吊与脊柱钳夹固定法，有效降低了呼吸与心跳给成像带来的干扰，使成像质量更加稳定。
为了对小鼠同一脊髓区域进行多次TPM成像，每次成像完毕后，需要缝合小鼠背部肌肉与皮肤，下次成像时再打开皮肤和肌肉，重新暴露脊髓节段[19]。这种重复手术虽然操作简便，但也存在很多问题，如增加动物感染风险，造成脊髓局部损伤，激活脊髓局部的免疫反应，对动物造成长期疼痛。这些问题都会对动物TPM活体脊髓成像造成很大干扰，因此研发出一种长期的活体内动态成像观察窗口意义重大。Farrar等[20] 发明了一种小鼠脊柱脊髓固定观察装置，通过将观察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓节段上涂生物硅胶，用玻璃片封闭装置，从而使小鼠能够长期携带观察装置生存，每次成像时将小鼠麻醉后放入外固定架上即可，避免了重复手术对成像带来的干扰。此项发明开辟了长期TPM活体脊髓成像的新途径。随着长期观察窗口理念的提出，各种改进的观察窗口相继出现，更有利于应用TPM对活体脊髓进行长时间动态观察[21-22]。
3 TPM活体轴突与髓鞘成像
脊髓损伤后轴突的再生与功能重建一直是神经科学领域研究的热点与难点。当前基于脊髓损伤的研究主要应用各种离体手段，如使用生物素葡聚糖胺顺行示踪技术标记皮质脊髓束轴突和免疫组织化学方法标记轴突，这些方法需要处死动物提取脊髓组织进行染色[23-25]，无法提供脊髓损伤后轴突在活体内的动态变化信息。黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）H-line小鼠是一种神经系统特异性表达YFP的转基因小鼠，其神经细胞的胞体、树突、轴突特异性表达YFP，非神经细胞不表达YFP[26]，是应用TPM进行活体轴突成像的理想动物模型。对YFP H-line小鼠背侧脊髓进行轴突横断损伤后，可应用TPM在损伤后不同时间点对单根轴突的再生过程进行持续成像，研究脊髓背侧感觉神经再生的动态过程[27-28]。近期TPM活体轴突成像研究报道，在脊髓损伤后3 d内轴突会发生进行性退变与坏死，使用甲泼尼龙冲击治疗能有效缓解轴突的进行性退变，减少脊髓继发性损伤[29-30]。
髓鞘是包绕在轴突周围的管状外膜，在神经电冲动的传导过程中起着绝缘与加快动作电位传导等作用，当髓鞘受损或畸形时，常引发多发性硬化症等疾病，导致患者出现神经功能障碍甚至瘫痪[31]。Micu等[32]应用钙离子指示剂X-rohod-1染料标记脊髓背侧感觉神经纤维的髓鞘，以TPM对髓鞘进行成像。Condie等[33]应用CIC（Case Imaging Compound） 荧光染料选择性标记YFP H-line小鼠脊髓中的髓鞘，以TPM同时对轴突和髓鞘进行活体共定位成像。这些TPM活体轴突与髓鞘成像研究能够提供轴突损伤后退变与再生的动态过程，为理解脊髓损伤后轴突变化的病理生理过程奠定基础。
4 TPM活体小胶质细胞成像
小胶质细胞是中枢神经系统内广泛分布的巨噬细胞，它起着监控、保护、营养支持等重要作用[34-35]。CX3CR1GFP/+小鼠是一种巨噬细胞与小胶质细胞特异性表达GFP的转基因荧光小鼠，是应用TPM进行活体小胶质细胞成像的理想动物模型[36]。当脊髓损伤后数分钟内，应用TPM能够观察到小胶质细胞迅速包围损伤点周围，通过NO信号通路调控途径，小胶质细胞的形态从静息状态下的分支杆状变成激活状态下的阿米巴状[37]。中枢神经系统损伤后，应用TPM对小胶质细胞进行活体成像，能直接观察到小胶质细胞在损伤周围的增殖过程，而小胶质细胞大多来源于中枢神经系统中增殖的小胶质细胞，而非血源性巨噬细胞，这为理解小胶质细胞的来源奠定了基础[38]。CX3CR1GFP/+小鼠与YFP小鼠杂交繁育后获得的新型CX3CR1GFP/+/YFP转基因小鼠，能同时在脊髓中表达GFP标记的小胶质细胞与YFP标记的轴突，应用TPM活体脊髓成像技术能研究脊髓损伤后轴突的退变与小胶质细胞激活的相互作用[39]。研究表明血源性巨噬细胞主要参与脊髓损伤后轴突退变，而中枢神经系统中增殖的小胶质细胞并不促进轴突的退变与坏死[40]。这些TPM活体小胶质细胞成像研究阐明了脊髓损伤后小胶质细胞的病理生理动态过程，以及与轴突退变与再生的相互关系。
5 TPM活体钙离子成像
对于脊髓内神经元功能的研究，既往主要应用膜片钳与神经电生理检测等手段。膜片钳技术需要提取动物的脊髓组织，切成薄片后浸没在溶液中进行记录[41]。这种方法虽然能精确记录单个神经元的功能活性，但是离体的脊髓薄片不能完全反映活体内脊髓神经元的真实功能。神经电生理技术虽然能反映活体内神经元的功能活性，但无法精确定位于单个神经元[42]。随着钙离子指示蛋白与GCaMP转基因小鼠的问世，越来越多的研究团队应用TPM对中枢神经系统内神经元和树突进行钙离子活体成像，研究神经元的功能活性以及突触的可塑性[43-46]。 TPM活体钙离子成像的优势在于既能反映活体内神经元的功能活性，又能精确定位单个神经元和周围神经网络的联系，是研究活体内神经元功能与突触可塑性的理想技术手段。
Johannssen等[47-48] 应用显微注射仪将微量钙离子指示染料OGB-1注入小鼠腰段脊髓背角，标记脊髓背角的中间神经元，应用TPM观察脊髓背角单个神经元在静息状态下与电刺激状态下的功能活性，研究背角感觉神经元的病理生理机制；然而这种钙离子指示染料只能在体内持续数小时，无法长时间对钙离子活性进行活体成像研究。Nishida等[49]应用电转技术将钙离子指示质粒注入孕12.5 d的ICR鼠子宫内胎鼠脊髓中，当小鼠成年后，钙离子指示蛋白可长期表达于显微注射的脊髓局部，通过TPM能够长期研究脊髓背角神经元的功能，以及各种痛觉刺激传导对脊髓背角神经元的影响及作用机制；然而这种转染方法的成功率与荧光蛋白表达量都不太稳定。随着钙离子指示蛋白GCaMP6s的问世，可通过腺相关病毒包装GCaMP6s，采用显微注射技术将AAV-Syn-GCaMP6s注入成年动物中枢神经系统中，待病毒转染后，GCaMP6s能够持续表达于神经元中长达数月[50]，联合应用TPM能实现长期活体内脊髓钙离子功能的持续成像，为研究活体脊髓病理生理情况下的神经元钙离子活性与神经网络功能联系开辟了新的方法。
6 总结与展望
TPM与转基因荧光小鼠的结合能够提供脊髓活体内细胞动态变化的过程，但仍有许多局限性：① 双光子激光对活体组织的穿透能力有限，观察深度仅限于脊髓背侧的神经纤维与背角神经元，目前尚无相关脊髓腹侧神经纤维与前角神经元的TPM活体成像研究报道；② 出血与软组织再生对TPM活体成像技术的影响较大，特别是重复手术造成的损伤与炎性反应加大了TPM成像难度；③ TPM需要结合转基因动物或荧光标记细胞进行活体成像，对于未带荧光标记的细胞和相应的转基因动物无法成像。然而TPM活体脊髓成像技术对于研究脊髓损伤后神经的再生模式，神经干细胞移植后体内的增殖、迁移、分化过程，以及在体内分化为神经细胞后与宿主神经网络之间的联系有独到优势。随着转基因技术的发展与多光子激光体系的推出，越来越多的细胞亚型有望应用于TPM活体成像领域，多光子激光系统对活体组织的穿透能力逐渐加强，成像深度逐渐加大，这些都有利于阐释脊髓损伤的病理生理过程以及神经再生与功能重建的作用机制，为将来的临床应用奠定基础。
目前，双光子显微镜（two-photon microscopy，TPM）已广泛应用于神经科学领域。通过结合特定细胞类型表达荧光蛋白的转基因动物模型，TPM能在长时间内对活体动物神经系统进行多次三维结构与功能的动态成像[1-2]。与弥散张量成像与MRI成像技术相比，TPM活体成像技术能在时间与空间上提供细胞水平的高分辨率三维重构图像，有利于研究神经元的突触可塑性以及神经细胞与胶质细胞的相互作用关系[3-7]，更直观地提供脊髓损伤的病理生理过程与评估药物干预的治疗效果。本文就近年来TPM活体脊髓成像的研究进展进行综述。
1 TPM活体成像技术的发展
20世纪90年代，美国康奈尔大学科学家Winfried Denk将双光子激发技术与激光扫描共聚焦显微镜相结合，研发出了TPM[8]。TPM对生物样品成像具备光漂白性小、光毒性小、穿透性强等优点，一经问世即很快应用于活体动物神经科学领域的研究中。TPM尤其适用于对小型动物模型（如斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠）进行活体成像，实现了更深层次、低激光、低热损伤、高信噪比的活体成像，能对同一动物在长时间内进行反复多次动态成像[9-13]。为了研究中枢神经系统突触的可塑性，Grutzendler等[14]应用TPM对转基因小鼠的大脑皮层进行长时间结构成像，发现树突棘在发育过程中保持着高度稳定性。在TPM成像过程中，应用磨薄颅骨技术对小鼠大脑皮层进行活体成像，能有效降低因开颅手术造成的出血与炎性反应，避免暴露大脑组织，进而研究大脑皮层树突棘在生理条件下的稳定性与可塑性[15]。TPM活体成像技术的发展，为研究神经疾病细胞水平结构与功能的变化开辟了新途径。
2 TPM活体脊髓成像技术的发展
Kerschensteiner等[16]应用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记神经细胞的转基因小鼠，对单根轴突进行针刺损伤后，采用TPM持续观察活体内单根轴突的退变与瓦勒变性的动态过程，此研究开辟了TPM活体脊髓成像的新领域。不同于大脑皮层与颅骨固定术，固定脊柱与脊髓是活体成像的一大难点；并且脊髓位于躯体深部，动物的呼吸与心跳对脊髓带来的活动会严重影响TPM活体脊髓成像的质量，断层扫描图片需经过复杂的后期处理与重建才能得到清晰图片[17]。Davalos等[18]应用小鼠悬吊与脊柱钳夹固定法，有效降低了呼吸与心跳给成像带来的干扰，使成像质量更加稳定。
为了对小鼠同一脊髓区域进行多次TPM成像，每次成像完毕后，需要缝合小鼠背部肌肉与皮肤，下次成像时再打开皮肤和肌肉，重新暴露脊髓节段[19]。这种重复手术虽然操作简便，但也存在很多问题，如增加动物感染风险，造成脊髓局部损伤，激活脊髓局部的免疫反应，对动物造成长期疼痛。这些问题都会对动物TPM活体脊髓成像造成很大干扰，因此研发出一种长期的活体内动态成像观察窗口意义重大。Farrar等[20] 发明了一种小鼠脊柱脊髓固定观察装置，通过将观察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓节段上涂生物硅胶，用玻璃片封闭装置，从而使小鼠能够长期携带观察装置生存，每次成像时将小鼠麻醉后放入外固定架上即可，避免了重复手术对成像带来的干扰。此项发明开辟了长期TPM活体脊髓成像的新途径。随着长期观察窗口理念的提出，各种改进的观察窗口相继出现，更有利于应用TPM对活体脊髓进行长时间动态观察[21-22]。
3 TPM活体轴突与髓鞘成像
脊髓损伤后轴突的再生与功能重建一直是神经科学领域研究的热点与难点。当前基于脊髓损伤的研究主要应用各种离体手段，如使用生物素葡聚糖胺顺行示踪技术标记皮质脊髓束轴突和免疫组织化学方法标记轴突，这些方法需要处死动物提取脊髓组织进行染色[23-25]，无法提供脊髓损伤后轴突在活体内的动态变化信息。黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）H-line小鼠是一种神经系统特异性表达YFP的转基因小鼠，其神经细胞的胞体、树突、轴突特异性表达YFP，非神经细胞不表达YFP[26]，是应用TPM进行活体轴突成像的理想动物模型。对YFP H-line小鼠背侧脊髓进行轴突横断损伤后，可应用TPM在损伤后不同时间点对单根轴突的再生过程进行持续成像，研究脊髓背侧感觉神经再生的动态过程[27-28]。近期TPM活体轴突成像研究报道，在脊髓损伤后3 d内轴突会发生进行性退变与坏死，使用甲泼尼龙冲击治疗能有效缓解轴突的进行性退变，减少脊髓继发性损伤[29-30]。
髓鞘是包绕在轴突周围的管状外膜，在神经电冲动的传导过程中起着绝缘与加快动作电位传导等作用，当髓鞘受损或畸形时，常引发多发性硬化症等疾病，导致患者出现神经功能障碍甚至瘫痪[31]。Micu等[32]应用钙离子指示剂X-rohod-1染料标记脊髓背侧感觉神经纤维的髓鞘，以TPM对髓鞘进行成像。Condie等[33]应用CIC（Case Imaging Compound） 荧光染料选择性标记YFP H-line小鼠脊髓中的髓鞘，以TPM同时对轴突和髓鞘进行活体共定位成像。这些TPM活体轴突与髓鞘成像研究能够提供轴突损伤后退变与再生的动态过程，为理解脊髓损伤后轴突变化的病理生理过程奠定基础。
4 TPM活体小胶质细胞成像
小胶质细胞是中枢神经系统内广泛分布的巨噬细胞，它起着监控、保护、营养支持等重要作用[34-35]。CX3CR1GFP/+小鼠是一种巨噬细胞与小胶质细胞特异性表达GFP的转基因荧光小鼠，是应用TPM进行活体小胶质细胞成像的理想动物模型[36]。当脊髓损伤后数分钟内，应用TPM能够观察到小胶质细胞迅速包围损伤点周围，通过NO信号通路调控途径，小胶质细胞的形态从静息状态下的分支杆状变成激活状态下的阿米巴状[37]。中枢神经系统损伤后，应用TPM对小胶质细胞进行活体成像，能直接观察到小胶质细胞在损伤周围的增殖过程，而小胶质细胞大多来源于中枢神经系统中增殖的小胶质细胞，而非血源性巨噬细胞，这为理解小胶质细胞的来源奠定了基础[38]。CX3CR1GFP/+小鼠与YFP小鼠杂交繁育后获得的新型CX3CR1GFP/+/YFP转基因小鼠，能同时在脊髓中表达GFP标记的小胶质细胞与YFP标记的轴突，应用TPM活体脊髓成像技术能研究脊髓损伤后轴突的退变与小胶质细胞激活的相互作用[39]。研究表明血源性巨噬细胞主要参与脊髓损伤后轴突退变，而中枢神经系统中增殖的小胶质细胞并不促进轴突的退变与坏死[40]。这些TPM活体小胶质细胞成像研究阐明了脊髓损伤后小胶质细胞的病理生理动态过程，以及与轴突退变与再生的相互关系。
5 TPM活体钙离子成像
对于脊髓内神经元功能的研究，既往主要应用膜片钳与神经电生理检测等手段。膜片钳技术需要提取动物的脊髓组织，切成薄片后浸没在溶液中进行记录[41]。这种方法虽然能精确记录单个神经元的功能活性，但是离体的脊髓薄片不能完全反映活体内脊髓神经元的真实功能。神经电生理技术虽然能反映活体内神经元的功能活性，但无法精确定位于单个神经元[42]。随着钙离子指示蛋白与GCaMP转基因小鼠的问世，越来越多的研究团队应用TPM对中枢神经系统内神经元和树突进行钙离子活体成像，研究神经元的功能活性以及突触的可塑性[43-46]。 TPM活体钙离子成像的优势在于既能反映活体内神经元的功能活性，又能精确定位单个神经元和周围神经网络的联系，是研究活体内神经元功能与突触可塑性的理想技术手段。
Johannssen等[47-48] 应用显微注射仪将微量钙离子指示染料OGB-1注入小鼠腰段脊髓背角，标记脊髓背角的中间神经元，应用TPM观察脊髓背角单个神经元在静息状态下与电刺激状态下的功能活性，研究背角感觉神经元的病理生理机制；然而这种钙离子指示染料只能在体内持续数小时，无法长时间对钙离子活性进行活体成像研究。Nishida等[49]应用电转技术将钙离子指示质粒注入孕12.5 d的ICR鼠子宫内胎鼠脊髓中，当小鼠成年后，钙离子指示蛋白可长期表达于显微注射的脊髓局部，通过TPM能够长期研究脊髓背角神经元的功能，以及各种痛觉刺激传导对脊髓背角神经元的影响及作用机制；然而这种转染方法的成功率与荧光蛋白表达量都不太稳定。随着钙离子指示蛋白GCaMP6s的问世，可通过腺相关病毒包装GCaMP6s，采用显微注射技术将AAV-Syn-GCaMP6s注入成年动物中枢神经系统中，待病毒转染后，GCaMP6s能够持续表达于神经元中长达数月[50]，联合应用TPM能实现长期活体内脊髓钙离子功能的持续成像，为研究活体脊髓病理生理情况下的神经元钙离子活性与神经网络功能联系开辟了新的方法。
6 总结与展望
TPM与转基因荧光小鼠的结合能够提供脊髓活体内细胞动态变化的过程，但仍有许多局限性：① 双光子激光对活体组织的穿透能力有限，观察深度仅限于脊髓背侧的神经纤维与背角神经元，目前尚无相关脊髓腹侧神经纤维与前角神经元的TPM活体成像研究报道；② 出血与软组织再生对TPM活体成像技术的影响较大，特别是重复手术造成的损伤与炎性反应加大了TPM成像难度；③ TPM需要结合转基因动物或荧光标记细胞进行活体成像，对于未带荧光标记的细胞和相应的转基因动物无法成像。然而TPM活体脊髓成像技术对于研究脊髓损伤后神经的再生模式，神经干细胞移植后体内的增殖、迁移、分化过程，以及在体内分化为神经细胞后与宿主神经网络之间的联系有独到优势。随着转基因技术的发展与多光子激光体系的推出，越来越多的细胞亚型有望应用于TPM活体成像领域，多光子激光系统对活体组织的穿透能力逐渐加强，成像深度逐渐加大，这些都有利于阐释脊髓损伤的病理生理过程以及神经再生与功能重建的作用机制，为将来的临床应用奠定基础。