引用本文： 徐亦驰, 尹合勇, 孟昊业, 孙振, 眭翔, 彭江, 汪爱媛, 卢世璧. 镁合金和PLGA体内降解比较及Micro-CT评价镁合金降解情况的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(7): 885-891. doi: 10.7507/1002-1892.20160179 复制
镁金属及其合金与正常人骨的各项性能指标十分接近，能很好地避免应力遮挡效应，具有良好的生物相容性、促进新骨生成、无生物毒性和炎性反应、体内可降解、无需二次手术取出等优势，在骨科应用中越来越受到关注[1]。但目前尚无法控制其在体内的降解速度，因此未得到广泛应用[1-2]。研究表明，镁金属在体内降解速度较快，骨折愈合前即已丧失外形完整性和力学强度，同时释放大量氢气，存在不可忽视的安全隐患[2-3]。为此，研究人员研究了多种方法，如提高镁的纯度、添加微量元素、进行表面处理等[4]，以期控制其降解速度。镁合金是以镁为基础加入其他元素组成的合金，已成为骨科可吸收金属植入物中最具有发展和应用潜能的材料之一。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]是骨科常用的一种可吸收高分子非金属植入材料，具有稳定的降解性能和体内植入优势，目前广泛应用于临床[5-6]。
如何评价可降解材料植入体内后的规律和各项性能如降解性等，一直都是研究热点。传统评价可吸收材料在体内降解的方法存在许多弊端，精确度差且很难定量分析[7]。过去10年中，Micro-CT被广泛应用于小动物解剖图像的呈现及小动物骨科疾病模型的动态观察，其高时间和空间分辨率是关键优势[8-11]，而且来源于Micro-CT自身的数据分析系统可将图像定量化[9-13]。影像学技术的发展日新月异，但目前以类似Micro-CT这种无创检测手段的定量方法来评价可吸收植入物的体内降解仍待进一步探索[14-15]。鉴于此，我们选用表面微弧氧化处理的AZ31镁合金与PLGA作为研究对象，采用失重法比较两种材料在体内的降解情况，并利用Micro-CT的成像及定量分析评价镁合金的体内降解，旨在进一步研究镁合金的降解性能，同时进一步深入发掘Micro-CT的评价优势，为镁合金广泛应用于临床奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
3月龄雄性新西兰大白兔40只，体重2.3～2.7 kg，由北京科宇动物实验中心提供。
标准圆柱形表面微弧氧化处理的AZ31镁合金棒[简称镁棒，单个净重0.500 g，各元素含量（质量分数）：3%Al、1%Zn、0.15%Mn，余为Mg[3, 16]]与PLGA棒（单个净重0.300 g）各40个，长6.0 mm，横截面直径2.0 mm；由TRAUSON医疗器械（中国）有限公司提供。所有材料术前均经29 kGy 60Co辐照消毒。
1.2 实验方法
取40只新西兰大白兔，术前12 h开始禁食。以3%戊巴比妥钠（1.2 mL/kg）腹腔注射麻醉，剃除双后肢皮毛，手术于无菌条件下进行。用直径2.0 mm克氏针钻入双侧股骨髁，深度6.0 mm，将40个镁棒与PLGA棒分别植入右侧和左侧股骨髁钻孔内，每侧植入1个。术后注射青霉素预防感染，实验动物不予以外固定支持，单笼常规饲养，可自由活动并正常负重。分别于术后4、8、12、16周各处死10只动物，无菌条件下取出双侧股骨髁行Micro-CT扫描检测，然后取出植入物采用失重法检测材料降解情况。
1.3 观测指标
1.3.1 Micro-CT法评价镁棒体内降解情况
使用Healthcare-RS-9 Micro-CT机（GE公司，美国），80 kV光管电压和450μA光管电流，曝光时间400 ms。兔骨小梁直径50～80μm，因此选择扫描分辨率为20 μm。由于PLGA为非金属可吸收材料，在Micro-CT中无法显影，而Micro-CT图像能很好显示镁棒的降解情况，故只观察镁棒体内降解情况，见图 1。
图1
Micro-CT扫描下镁棒与PLGA棒的显影情况ⓐPLGA棒呈灰色低信号，与周围软组织灰度值接近（箭头）ⓑ镁棒呈白色高信号，与正常骨质灰度值接近（箭头） 图 2 术后各时间点Micro-CT扫描观察镁棒降解情况箭头示腐蚀点ⓐ术后4周兴趣区ⓑ术后4周黄色高亮ⓒ术后8周兴趣区ⓓ术后8周黄色高亮ⓔ术后12周兴趣区ⓕ术后12周黄色高亮ⓖ术后16周兴趣区ⓗ术后16周黄色高亮
Figure1.
Micro-CT image of the magnesium alloy pin and PLGA pin ⓐPLGA pin, showing gray low signal, which was similar to the soft tissue (arrow) ⓑAZ31 pin, showing white high signal, which was similar to the bone tissue (arrow) Fig. 2 The degradation of magnesium alloy pins at each time point by Micro-CT images Arrow indicated corrosion pitting ⓐRegion of interest (ROI) at 4 weeks ⓑHighlighted the ROI at 4 weeks ⓒROI at 8 weeks ⓓHighlighted the ROI at 8 weeks ⓓROI at 12 weeks ⓕHighlighted the ROI at 12 weeks ⓖROI at 16 weeks ⓗHighlighted the ROI at 16 weeks
机器热机后，将取出的新鲜右侧兔股骨髁送入扫描仪中，新建扫描任务与对象，选择20μm-14 min扫描协议；在Control窗口中启动Fluoro预览程序，通过移动样品床确保定位准确后进行扫描，生成图像并自动呈现。在Fluoro程序主窗口中，建立立方体兴趣区，调节立方体6个面的大小和位置，使其包含股骨髁的各角度表面，保存兴趣区后软件自动生成重建体积边缘的笛卡尔坐标（即X/Y/Z三维坐标轴），随后开始进行三维重建。观察图像上股骨髁内镁棒的形状和周围信号强度变化，判断镁棒降解情况；同时，新建一个标准圆柱形兴趣区，设置高度6.0 mm，横截面直径2.0 mm，移动位置使其与镁棒完全重叠；然后，设置灰度阈值为850，将兴趣区设置黄色高亮；随后，采用Micro-CT内部处理分析软件MicroView的Advanced Bone Analysis（ABA）项目分析此兴趣区（即镁棒）各时间点的扫描数据，点击勾选“Bone Parameters”栏下属的“BMD”、“SMI”、“Anisotropy”、“Stereology”、“CorticalAnalysis”和“DirectMeasures”项目，导出EXCEL格式数据。数据包括：①骨骼矿物质定量指标：骨体积分数、骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、骨矿物质含量、组织矿物质密度、组织矿物质含量；其中BMD是根据体模和标准CT值计算得到的骨矿物质含量，以单位体积的羟基磷灰石含量表示，Micro-CT扫描图像每个体素的单位是ADU，经过体模校准为标准CT值（Hu），然后计算BMD。②体视学参数：骨体积组织体积比、骨表面积体积比、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间距。③直接三维测量骨小梁厚度、骨小梁间距。④结构模型指数：松质骨结构的衰败特征是骨小梁从板状成分向柱状成分转变，因此通过计算骨骼表面曲率来描述骨小梁的“板状”和“杆状”程度。⑤骨皮质分析：骨皮质厚度、内径周长、外径周长、骨腔横截面面积和骨皮质截面面积。
本研究检测指标：①镁棒体积分数：我们创新性地将镁棒视为骨组织，与骨体积分数相似，镁棒体积分数即为降解后的镁棒体积与植入前的镁棒体积之比。②镁矿物密度和镁CT图像密度：在图像中分析骨矿物质密度和组织矿物质密度，分别反映镁矿物密度和镁CT图像密度。③镁棒表面积与体积比：将镁棒视为骨组织，分析骨体视学参数中骨表面积体积比。④平均骨小梁厚度：该指标反映镁棒的横截面半径，原理：镁棒不存在“骨小梁”，此组数据中，计算机自动在镁棒内部正中心生成一根贯穿纵轴的假想线，将“平均骨小梁厚度”这一指标当作镁棒的横截面半径，故其理论值应为1.0 mm。上述指标均由Micro-CT内高级骨形态分析软件ABA自动计算得出。
术后各时间点在镁棒横截面上选择新生骨组成的骨环最大内径，并测量在此横截面上降解后的镁棒直径，反映镁合金降解情况。
1.3.2 失重法检测材料降解情况
术前将镁棒和PLGA棒于电子天平上逐一称重（精确度0.001 g）。术后各时间点取出植入物，清洁后于超声波清洗器中用乙醇清洗，烘干机中烘干，再次称重[17]。比较植入前后重量丢失情况，作为植入物的降解量。由于植入前样本本身离散性大，可能会出现第一个时间点体内降解量过小导致称量值误差较大，为避免此误差，只称量并计算术后8、12、16周植入物的降解量。并将各时间点镁棒质量分数与Micro-CT方法得出的镁棒体积分数进行比较。
1.3.3 组织学观察
将各时间点股骨髁标本于4%多聚甲醛中固定2周，10%EDTA脱钙4周，石蜡浸制包埋，切片，片厚5μm，行HE染色，光镜下观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Micro-CT法评价镁合金体内降解情况
2.1.1 Micro-CT扫描观察
术后4周镁棒几乎无降解痕迹，边缘完整、连续且光滑，隐约有少量腐蚀点；术后8周腐蚀点明显，尤其是纵轴与横截面的交界边缘开始变得模糊，与4周时比较主要表现在原有腐蚀点逐步扩大，并非持续性出现大量新腐蚀点；术后12周，镁棒表面腐蚀点明显增多且多为新的腐蚀点；至术后16周时镁棒表面腐蚀面积更大，边缘已不连续。见图 2。
2.1.2 定量指标计算
①镁棒体积分数：术后4周，镁棒体积分数保持在平均98.5%以上，降解相当缓慢和轻微；术后8周，镁棒体积分数降至平均96.5%，但仍较缓慢，与术后4周比较差异无统计学意义（P > 0.05）；术后12周镁棒体积分数明显降低，16周时降低更为明显，与其余各时间点比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3 a。
图3
Micro-CT定量指标ⓐ镁棒体积分数ⓑ镁矿物密度和镁CT图像密度ⓒ镁棒表面积与体积比ⓓ平均骨小梁厚度 图 4 术后12周镁棒横截面Micro-CT图像ⓐ新生骨骨环最大内径（橙色实线，2.34 mm）ⓑ镁棒横截面直径（黑色实线，1.94 mm） 图 5 术后各时间点新生骨骨环最大内径及同截面镁棒直径变化 图 6 镁棒质量分数与体积分数的变化比较 图 7 术后各时间点镁棒和PLGA棒HE染色观察（×40）ⓐ镁棒术后4周ⓑ镁棒术后16周ⓒPLGA棒术后4周ⓓPLGA棒术后16周
Figure3.
The data by micro-CT measurements ⓐMagnesium pin volume fraction ⓑAlloy cylinder mineral density and the CT image density ⓒThe surface-to-volume ratio of the magnesium pin ⓓThe mean trabecular thickness Fig. 4 Micro-CT images in the cross-section of the magnesium alloy pin at 12 weeks ⓐMaximum inner diameter of the new bone loop (orange line, 2.34 mm) ⓑDiameter of the pin (black line, 1.94 mm) at the same position Fig. 5 Maximum inner diameter of the new bone loop and diameter of the pin at the same position at each time point Fig. 6 Weight fraction and volume fraction of the magnesium alloy pins Fig. 7 HE staining of the tissue around the magnesium alloy and PLGA pins (×40) ⓐMagnesium alloy pin at 4 weeks ⓑMagnesium alloy pin at 16 weeks ⓒPLGA pin at 4 weeks ⓓPLGA pin at 16 weeks
②镁矿物密度和镁CT图像密度：术后随时间延长镁矿物密度持续降低，于术后12～16周降低速度最快，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；而镁CT图像密度随术后时间延长变化小，各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 3 b。
③镁棒表面积与体积比：术后随时间延长镁棒体积逐步减少，镁棒表面变得粗糙、模糊，表面积变大，因此镁棒表面积与体积比持续增加。术后12、16周镁棒表面积与体积比明显高于4、8周，且16周高于12周，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3 c。
④平均骨小梁厚度：术后随时间延长镁棒表面生成的腐蚀点越来越多，导致横截面半径减小，即平均骨小梁厚度逐渐降低，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。但术后12～16周平均骨小梁厚度降低速度明显减慢，可能是由于镁刺激骨的再生作用导致在镁棒表面腐蚀点处出现少量新生骨，抑制了镁棒横截面半径继续变小。见图 3 d。
2.1.3 镁棒降解和周围新骨长入
术后随时间延长镁棒横截面直径逐渐减小，各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。而新生骨骨环最大内径的变化无规律，术后4周较术前增加，8周时较4周略减小，12周时显著增加达峰值，16周时再次降低达4周水平；12周时新生骨骨环的最大内径显著大于其余各时间点，差异有统计学意义（P < 0.05），其余各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。因此，尽管部分骨组织已出现了连接，但镁棒和周围骨组织之间由新生骨形成的骨桥仍欠充分。见图 4、5。
2.2 失重法检测材料降解情况
术后随时间延长，两种材料降解量均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。术后8、12周，镁棒降解量均显著低于PLGA棒，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后16周时镁棒降解量反而高于PLGA棒，但差异无统计学意义（t=1.157，P=0.262）。见表 1。
表1
术后各时间点镁棒与PLGA棒降解量比较（n=10，g，将各时间点镁棒质量分数与Micro-CT方法得出的体积分数进行比较，结果显示两个指标的变化趋势相近，但各时间点镁棒质量分数均低于体积分数，且在第8、12、16周差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
2.3 组织学观察
HE染色示，术后4周镁棒植入物周围可见轻度炎性反应；随时间延长炎性反应逐渐减轻，至16周时已未见炎性反应。而PLGA棒植入物在体内降解过程中均无明显炎性反应。见图 7。
3 讨论
在骨科相关疾病的修复和替代材料中，可吸收材料植入物仍占据重要地位[18]。镁及其合金与其他材料如钛合金、不锈钢等相比具有独特优势，近年来被积极开发和研究[19-20]。然而，其在人体中应用时存在安全性、电化学活性以及在体内与组织液反应等问题，使得我们重视研究如何控制其在体内的降解速度[21-23]。研究合适的方法提高镁合金的抗腐蚀性能尤为重要。目前，一些延缓镁合金过快腐蚀的方法已被提出并得到了验证，其中应用较广泛的是对镁合金进行表面处理[4, 24]，但对处理方法的无毒性和生物相容性等提出了更高要求。
本研究中，我们选用表面微弧氧化处理的AZ31镁合金及已在临床中广泛使用的PLGA材料在动物体内进行实验，用失重法比较两种材料的降解性能，同时利用Micro-CT对镁合金各时间点进行扫描图像和数值定量分析，在时间轴上纵向比较镁合金的降解，并将此结果再次与失重法评价镁合金降解的结果进行比较。结果显示，镁棒经微弧氧化处理能保护表面不被明显腐蚀达8周之久，失去表面保护后腐蚀明显加快，12～16周镁棒体积分数减少了6.8%，为各时间点体积分数下降最大，而PLGA棒在体内比镁棒更早、更快发生降解。Micro-CT图像中通过对镁棒设置黄色高亮，可明显动态观察到腐蚀程度加重和降解的进行性进展。其数值更能定量、精准地反映镁棒的体积分数变化、镁合金含量和密度变化、镁棒表面积与体积比以及平均骨小梁厚度所表示的镁棒横截面直径变化，根据这些数据结果得出结论，即在镁棒降解过程中其含量降低，但密度无明显变化。镁棒横截面直径理应逐渐变小，而且理论上如果镁棒与其周围新生骨连接紧密，新生骨骨环的最大内径也应逐渐变小，甚至变小的速度可超过镁棒。但实验结果提示新生骨内径并未出现预想的减少趋势，推断镁合金材料由于缺乏一定的抓持力，导致其并不能很好地与周围组织相连接，即镁合金材料还不能生成足够的新生骨桥，在空隙中连接镁棒与周围组织的能力仍欠佳。
Micro-CT结果包括图像和数值数据。图像显示出4个时间点镁棒的形状变化和其表面的腐蚀点，具体数值数据则反映出镁棒的降解遵循了“慢-快”的规律，且失重法测得的PLGA材料降解同样也有相似的“慢-快”规律。直至16周实验结束，两种材料仍保持良好的外形完整性。因此Micro-CT是无创的检测手段，具有很高的图像分辨率和数据精确性；而以质量丢失为依据的检测方法却无法保证其准确性，因为在测量质量时的许多步骤，如从股骨髁中用物理器械取出镁棒、在清洗机中清洗、超声波乙醇等化学试剂清洗以及在烘干等过程中，都可导致材料不可避免地少量丢失，这也正是本实验选择Micro-CT作为主要检测手段的重要原因。
镁金属及其合金与正常人骨的各项性能指标十分接近，能很好地避免应力遮挡效应，具有良好的生物相容性、促进新骨生成、无生物毒性和炎性反应、体内可降解、无需二次手术取出等优势，在骨科应用中越来越受到关注[1]。但目前尚无法控制其在体内的降解速度，因此未得到广泛应用[1-2]。研究表明，镁金属在体内降解速度较快，骨折愈合前即已丧失外形完整性和力学强度，同时释放大量氢气，存在不可忽视的安全隐患[2-3]。为此，研究人员研究了多种方法，如提高镁的纯度、添加微量元素、进行表面处理等[4]，以期控制其降解速度。镁合金是以镁为基础加入其他元素组成的合金，已成为骨科可吸收金属植入物中最具有发展和应用潜能的材料之一。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]是骨科常用的一种可吸收高分子非金属植入材料，具有稳定的降解性能和体内植入优势，目前广泛应用于临床[5-6]。
如何评价可降解材料植入体内后的规律和各项性能如降解性等，一直都是研究热点。传统评价可吸收材料在体内降解的方法存在许多弊端，精确度差且很难定量分析[7]。过去10年中，Micro-CT被广泛应用于小动物解剖图像的呈现及小动物骨科疾病模型的动态观察，其高时间和空间分辨率是关键优势[8-11]，而且来源于Micro-CT自身的数据分析系统可将图像定量化[9-13]。影像学技术的发展日新月异，但目前以类似Micro-CT这种无创检测手段的定量方法来评价可吸收植入物的体内降解仍待进一步探索[14-15]。鉴于此，我们选用表面微弧氧化处理的AZ31镁合金与PLGA作为研究对象，采用失重法比较两种材料在体内的降解情况，并利用Micro-CT的成像及定量分析评价镁合金的体内降解，旨在进一步研究镁合金的降解性能，同时进一步深入发掘Micro-CT的评价优势，为镁合金广泛应用于临床奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
3月龄雄性新西兰大白兔40只，体重2.3～2.7 kg，由北京科宇动物实验中心提供。
标准圆柱形表面微弧氧化处理的AZ31镁合金棒[简称镁棒，单个净重0.500 g，各元素含量（质量分数）：3%Al、1%Zn、0.15%Mn，余为Mg[3, 16]]与PLGA棒（单个净重0.300 g）各40个，长6.0 mm，横截面直径2.0 mm；由TRAUSON医疗器械（中国）有限公司提供。所有材料术前均经29 kGy 60Co辐照消毒。
1.2 实验方法
取40只新西兰大白兔，术前12 h开始禁食。以3%戊巴比妥钠（1.2 mL/kg）腹腔注射麻醉，剃除双后肢皮毛，手术于无菌条件下进行。用直径2.0 mm克氏针钻入双侧股骨髁，深度6.0 mm，将40个镁棒与PLGA棒分别植入右侧和左侧股骨髁钻孔内，每侧植入1个。术后注射青霉素预防感染，实验动物不予以外固定支持，单笼常规饲养，可自由活动并正常负重。分别于术后4、8、12、16周各处死10只动物，无菌条件下取出双侧股骨髁行Micro-CT扫描检测，然后取出植入物采用失重法检测材料降解情况。
1.3 观测指标
1.3.1 Micro-CT法评价镁棒体内降解情况
使用Healthcare-RS-9 Micro-CT机（GE公司，美国），80 kV光管电压和450μA光管电流，曝光时间400 ms。兔骨小梁直径50～80μm，因此选择扫描分辨率为20 μm。由于PLGA为非金属可吸收材料，在Micro-CT中无法显影，而Micro-CT图像能很好显示镁棒的降解情况，故只观察镁棒体内降解情况，见图 1。
图1
Micro-CT扫描下镁棒与PLGA棒的显影情况ⓐPLGA棒呈灰色低信号，与周围软组织灰度值接近（箭头）ⓑ镁棒呈白色高信号，与正常骨质灰度值接近（箭头） 图 2 术后各时间点Micro-CT扫描观察镁棒降解情况箭头示腐蚀点ⓐ术后4周兴趣区ⓑ术后4周黄色高亮ⓒ术后8周兴趣区ⓓ术后8周黄色高亮ⓔ术后12周兴趣区ⓕ术后12周黄色高亮ⓖ术后16周兴趣区ⓗ术后16周黄色高亮
Figure1.
Micro-CT image of the magnesium alloy pin and PLGA pin ⓐPLGA pin, showing gray low signal, which was similar to the soft tissue (arrow) ⓑAZ31 pin, showing white high signal, which was similar to the bone tissue (arrow) Fig. 2 The degradation of magnesium alloy pins at each time point by Micro-CT images Arrow indicated corrosion pitting ⓐRegion of interest (ROI) at 4 weeks ⓑHighlighted the ROI at 4 weeks ⓒROI at 8 weeks ⓓHighlighted the ROI at 8 weeks ⓓROI at 12 weeks ⓕHighlighted the ROI at 12 weeks ⓖROI at 16 weeks ⓗHighlighted the ROI at 16 weeks
机器热机后，将取出的新鲜右侧兔股骨髁送入扫描仪中，新建扫描任务与对象，选择20μm-14 min扫描协议；在Control窗口中启动Fluoro预览程序，通过移动样品床确保定位准确后进行扫描，生成图像并自动呈现。在Fluoro程序主窗口中，建立立方体兴趣区，调节立方体6个面的大小和位置，使其包含股骨髁的各角度表面，保存兴趣区后软件自动生成重建体积边缘的笛卡尔坐标（即X/Y/Z三维坐标轴），随后开始进行三维重建。观察图像上股骨髁内镁棒的形状和周围信号强度变化，判断镁棒降解情况；同时，新建一个标准圆柱形兴趣区，设置高度6.0 mm，横截面直径2.0 mm，移动位置使其与镁棒完全重叠；然后，设置灰度阈值为850，将兴趣区设置黄色高亮；随后，采用Micro-CT内部处理分析软件MicroView的Advanced Bone Analysis（ABA）项目分析此兴趣区（即镁棒）各时间点的扫描数据，点击勾选“Bone Parameters”栏下属的“BMD”、“SMI”、“Anisotropy”、“Stereology”、“CorticalAnalysis”和“DirectMeasures”项目，导出EXCEL格式数据。数据包括：①骨骼矿物质定量指标：骨体积分数、骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、骨矿物质含量、组织矿物质密度、组织矿物质含量；其中BMD是根据体模和标准CT值计算得到的骨矿物质含量，以单位体积的羟基磷灰石含量表示，Micro-CT扫描图像每个体素的单位是ADU，经过体模校准为标准CT值（Hu），然后计算BMD。②体视学参数：骨体积组织体积比、骨表面积体积比、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间距。③直接三维测量骨小梁厚度、骨小梁间距。④结构模型指数：松质骨结构的衰败特征是骨小梁从板状成分向柱状成分转变，因此通过计算骨骼表面曲率来描述骨小梁的“板状”和“杆状”程度。⑤骨皮质分析：骨皮质厚度、内径周长、外径周长、骨腔横截面面积和骨皮质截面面积。
本研究检测指标：①镁棒体积分数：我们创新性地将镁棒视为骨组织，与骨体积分数相似，镁棒体积分数即为降解后的镁棒体积与植入前的镁棒体积之比。②镁矿物密度和镁CT图像密度：在图像中分析骨矿物质密度和组织矿物质密度，分别反映镁矿物密度和镁CT图像密度。③镁棒表面积与体积比：将镁棒视为骨组织，分析骨体视学参数中骨表面积体积比。④平均骨小梁厚度：该指标反映镁棒的横截面半径，原理：镁棒不存在“骨小梁”，此组数据中，计算机自动在镁棒内部正中心生成一根贯穿纵轴的假想线，将“平均骨小梁厚度”这一指标当作镁棒的横截面半径，故其理论值应为1.0 mm。上述指标均由Micro-CT内高级骨形态分析软件ABA自动计算得出。
术后各时间点在镁棒横截面上选择新生骨组成的骨环最大内径，并测量在此横截面上降解后的镁棒直径，反映镁合金降解情况。
1.3.2 失重法检测材料降解情况
术前将镁棒和PLGA棒于电子天平上逐一称重（精确度0.001 g）。术后各时间点取出植入物，清洁后于超声波清洗器中用乙醇清洗，烘干机中烘干，再次称重[17]。比较植入前后重量丢失情况，作为植入物的降解量。由于植入前样本本身离散性大，可能会出现第一个时间点体内降解量过小导致称量值误差较大，为避免此误差，只称量并计算术后8、12、16周植入物的降解量。并将各时间点镁棒质量分数与Micro-CT方法得出的镁棒体积分数进行比较。
1.3.3 组织学观察
将各时间点股骨髁标本于4%多聚甲醛中固定2周，10%EDTA脱钙4周，石蜡浸制包埋，切片，片厚5μm，行HE染色，光镜下观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Micro-CT法评价镁合金体内降解情况
2.1.1 Micro-CT扫描观察
术后4周镁棒几乎无降解痕迹，边缘完整、连续且光滑，隐约有少量腐蚀点；术后8周腐蚀点明显，尤其是纵轴与横截面的交界边缘开始变得模糊，与4周时比较主要表现在原有腐蚀点逐步扩大，并非持续性出现大量新腐蚀点；术后12周，镁棒表面腐蚀点明显增多且多为新的腐蚀点；至术后16周时镁棒表面腐蚀面积更大，边缘已不连续。见图 2。
2.1.2 定量指标计算
①镁棒体积分数：术后4周，镁棒体积分数保持在平均98.5%以上，降解相当缓慢和轻微；术后8周，镁棒体积分数降至平均96.5%，但仍较缓慢，与术后4周比较差异无统计学意义（P > 0.05）；术后12周镁棒体积分数明显降低，16周时降低更为明显，与其余各时间点比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3 a。
图3
Micro-CT定量指标ⓐ镁棒体积分数ⓑ镁矿物密度和镁CT图像密度ⓒ镁棒表面积与体积比ⓓ平均骨小梁厚度 图 4 术后12周镁棒横截面Micro-CT图像ⓐ新生骨骨环最大内径（橙色实线，2.34 mm）ⓑ镁棒横截面直径（黑色实线，1.94 mm） 图 5 术后各时间点新生骨骨环最大内径及同截面镁棒直径变化 图 6 镁棒质量分数与体积分数的变化比较 图 7 术后各时间点镁棒和PLGA棒HE染色观察（×40）ⓐ镁棒术后4周ⓑ镁棒术后16周ⓒPLGA棒术后4周ⓓPLGA棒术后16周
Figure3.
The data by micro-CT measurements ⓐMagnesium pin volume fraction ⓑAlloy cylinder mineral density and the CT image density ⓒThe surface-to-volume ratio of the magnesium pin ⓓThe mean trabecular thickness Fig. 4 Micro-CT images in the cross-section of the magnesium alloy pin at 12 weeks ⓐMaximum inner diameter of the new bone loop (orange line, 2.34 mm) ⓑDiameter of the pin (black line, 1.94 mm) at the same position Fig. 5 Maximum inner diameter of the new bone loop and diameter of the pin at the same position at each time point Fig. 6 Weight fraction and volume fraction of the magnesium alloy pins Fig. 7 HE staining of the tissue around the magnesium alloy and PLGA pins (×40) ⓐMagnesium alloy pin at 4 weeks ⓑMagnesium alloy pin at 16 weeks ⓒPLGA pin at 4 weeks ⓓPLGA pin at 16 weeks
②镁矿物密度和镁CT图像密度：术后随时间延长镁矿物密度持续降低，于术后12～16周降低速度最快，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；而镁CT图像密度随术后时间延长变化小，各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 3 b。
③镁棒表面积与体积比：术后随时间延长镁棒体积逐步减少，镁棒表面变得粗糙、模糊，表面积变大，因此镁棒表面积与体积比持续增加。术后12、16周镁棒表面积与体积比明显高于4、8周，且16周高于12周，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3 c。
④平均骨小梁厚度：术后随时间延长镁棒表面生成的腐蚀点越来越多，导致横截面半径减小，即平均骨小梁厚度逐渐降低，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。但术后12～16周平均骨小梁厚度降低速度明显减慢，可能是由于镁刺激骨的再生作用导致在镁棒表面腐蚀点处出现少量新生骨，抑制了镁棒横截面半径继续变小。见图 3 d。
2.1.3 镁棒降解和周围新骨长入
术后随时间延长镁棒横截面直径逐渐减小，各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。而新生骨骨环最大内径的变化无规律，术后4周较术前增加，8周时较4周略减小，12周时显著增加达峰值，16周时再次降低达4周水平；12周时新生骨骨环的最大内径显著大于其余各时间点，差异有统计学意义（P < 0.05），其余各时间点间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。因此，尽管部分骨组织已出现了连接，但镁棒和周围骨组织之间由新生骨形成的骨桥仍欠充分。见图 4、5。
2.2 失重法检测材料降解情况
术后随时间延长，两种材料降解量均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。术后8、12周，镁棒降解量均显著低于PLGA棒，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后16周时镁棒降解量反而高于PLGA棒，但差异无统计学意义（t=1.157，P=0.262）。见表 1。
表1
术后各时间点镁棒与PLGA棒降解量比较（n=10，g，将各时间点镁棒质量分数与Micro-CT方法得出的体积分数进行比较，结果显示两个指标的变化趋势相近，但各时间点镁棒质量分数均低于体积分数，且在第8、12、16周差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
2.3 组织学观察
HE染色示，术后4周镁棒植入物周围可见轻度炎性反应；随时间延长炎性反应逐渐减轻，至16周时已未见炎性反应。而PLGA棒植入物在体内降解过程中均无明显炎性反应。见图 7。
3 讨论
在骨科相关疾病的修复和替代材料中，可吸收材料植入物仍占据重要地位[18]。镁及其合金与其他材料如钛合金、不锈钢等相比具有独特优势，近年来被积极开发和研究[19-20]。然而，其在人体中应用时存在安全性、电化学活性以及在体内与组织液反应等问题，使得我们重视研究如何控制其在体内的降解速度[21-23]。研究合适的方法提高镁合金的抗腐蚀性能尤为重要。目前，一些延缓镁合金过快腐蚀的方法已被提出并得到了验证，其中应用较广泛的是对镁合金进行表面处理[4, 24]，但对处理方法的无毒性和生物相容性等提出了更高要求。
本研究中，我们选用表面微弧氧化处理的AZ31镁合金及已在临床中广泛使用的PLGA材料在动物体内进行实验，用失重法比较两种材料的降解性能，同时利用Micro-CT对镁合金各时间点进行扫描图像和数值定量分析，在时间轴上纵向比较镁合金的降解，并将此结果再次与失重法评价镁合金降解的结果进行比较。结果显示，镁棒经微弧氧化处理能保护表面不被明显腐蚀达8周之久，失去表面保护后腐蚀明显加快，12～16周镁棒体积分数减少了6.8%，为各时间点体积分数下降最大，而PLGA棒在体内比镁棒更早、更快发生降解。Micro-CT图像中通过对镁棒设置黄色高亮，可明显动态观察到腐蚀程度加重和降解的进行性进展。其数值更能定量、精准地反映镁棒的体积分数变化、镁合金含量和密度变化、镁棒表面积与体积比以及平均骨小梁厚度所表示的镁棒横截面直径变化，根据这些数据结果得出结论，即在镁棒降解过程中其含量降低，但密度无明显变化。镁棒横截面直径理应逐渐变小，而且理论上如果镁棒与其周围新生骨连接紧密，新生骨骨环的最大内径也应逐渐变小，甚至变小的速度可超过镁棒。但实验结果提示新生骨内径并未出现预想的减少趋势，推断镁合金材料由于缺乏一定的抓持力，导致其并不能很好地与周围组织相连接，即镁合金材料还不能生成足够的新生骨桥，在空隙中连接镁棒与周围组织的能力仍欠佳。
Micro-CT结果包括图像和数值数据。图像显示出4个时间点镁棒的形状变化和其表面的腐蚀点，具体数值数据则反映出镁棒的降解遵循了“慢-快”的规律，且失重法测得的PLGA材料降解同样也有相似的“慢-快”规律。直至16周实验结束，两种材料仍保持良好的外形完整性。因此Micro-CT是无创的检测手段，具有很高的图像分辨率和数据精确性；而以质量丢失为依据的检测方法却无法保证其准确性，因为在测量质量时的许多步骤，如从股骨髁中用物理器械取出镁棒、在清洗机中清洗、超声波乙醇等化学试剂清洗以及在烘干等过程中，都可导致材料不可避免地少量丢失，这也正是本实验选择Micro-CT作为主要检测手段的重要原因。
