引用本文： 刘鹏程, 刘宽, 刘俊峰, 夏阔, 陈礼阳, 吴兴. 旋转微重力细胞培养系统下Indianhedgehog转染兔BMSCs促进成软骨分化并抑制老化的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(7): 892-902. doi: 10.7507/1002-1892.20160180 复制
软骨组织工程为治疗软骨损伤及缺损提供了新思路，BMSCs是目前公认的软骨组织工程种子细胞来源[1-3]，但也存在一些不足。通过BMSCs构建的软骨组织工程组织，较体内正常软骨组织在组织学形态、生物力学性能上仍存在一定差异[4]；体外利用BMSCs构建的组织工程软骨细胞或组织容易老化或向成骨细胞发展，并不适用于修复软骨损伤或缺失[5]。Indianhedgehog（IHH）是hedgehog信号通路中重要的同源蛋白之一，具有调控软骨肥大和骨形成的作用，IHH基因或蛋白的缺失会导致肢体末端畸形发育，同时伴有软骨细胞增殖率的下降和肥大软骨细胞的膨胀[6]。IHH可在软骨细胞增殖和分化的多个阶段发挥调控作用，具有直接和间接的调控途径。目前认为，IHH可促进关节周围软骨细胞增加表达甲状旁腺素/甲状旁腺素相关肽受体（parathy r oid hormone/parathyroid hormone-related protein，PTH/PTHrP），后者则通过与其受体PTHR-1结合来促进软骨细胞的增殖并可抑制其肥大，与此同时，IHH与PTHrP形成负反馈环路，通过cAMP/PKA途径下调IHH的分泌[7]。有研究发现，无论是用IHH单独转染BMSCs，还是联合BMP-2或TGF-β共同转染，均可促进初始BMSCs成软骨细胞分化[8]。这为利用IHH基因转染构建组织工程软骨提供了理论依据。
软骨细胞的生长除了营养支持，还需要特殊生长环境，即细胞生长的微环境。传统BMSCs体外培养和诱导分化通常局限于二维细胞培养环境中，细胞可能出现类似于去分化现象，使培养的细胞逐渐失去其来源组织的许多生理特征[9]；而且经诱导生成的软骨组织只能达到组织形态学及生化成分上的类似，不能实现与原有软骨相同的再生[4]。旋转微重力细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）是一种三维空间微重力培养系统，可使培养物在水平轴上建立类似均质液体的悬浮轨道，培养物的重力向量持续随机分布，因而可保持连续的自由落体状态；同时使作用于培养物的表观重力降至约10-2 g，可使细胞克服重力影响易于凝集和黏附于微载体表面[10-11]。RCCS还可提供一定的生物力学刺激，如剪切力、联合压缩力、流体静压力等，营造类似机体内部微环境，使细胞更均匀地分布于支架材料上，有利于营养物质的传输和代谢废物的排除，从而促进软骨细胞增殖和软骨基质合成[10, 12]。研究表明，RCCS可促进BMSCs分化成软骨细胞，且有利于软骨细胞表型的维持及生物力学特点的体外模拟[13]。
本研究通过IHH基因腺病毒载体转染兔BM SCs，探讨IHH基因转染对兔BMSCs成软骨分化的影响；同时联合RCCS，探讨在模拟体内微重力环境下，利用IHH基因转染BMSCs构建组织工程软骨的可能性，为体内实验修复软骨缺损提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器
兔BMSCs[赛业（广州）生物科技有限公司]；含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的腺病毒过表达载体（上海吉满生物科技有限公司；滴度为1×1011 pfu/mL）。L-DMEM、H-DMEM培养基（HyClone公司，美国）；青霉素/链霉素双抗、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO公司，美国）；重组人FGF（Proteintech公司，美国）；地塞米松、抗坏血酸、胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、丙酮酸钠、TGF-β、甲苯胺蓝（Sigma公司，美国）；膜联蛋白V（Annexin V）-cy3试剂盒（Enzolife公司，美国）；Trizol、Polybrene（Invitrogen公司，美国）；RT-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（Kapa公司，美国）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔IHH蛋白ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；ALP活性检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；兔抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体（Enzolife公司，美国）；鼠抗兔聚集蛋白聚糖（aggrecan，ANCN）单克隆抗体、Cytodex 3（GE公司，美国）；鼠抗兔GAPDH单克隆抗体、羊抗兔免疫荧光二抗、羊抗鼠免疫荧光二抗（Proteintech公司，美国）。
PCR仪（Eppendorf公司，美国）；ABI 7900HT型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；CO2细胞培养箱、超净工作台、离心机、酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR公司，美国）；倒置相差荧光显微镜（Leica Demirb公司，德国）；RCCS（Synthecon公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
1.2.1 IHH基因腺病毒载体的构建
以pDC316-mCMV-EGFP为穿梭质粒构成载体骨架并酶切。设计并合成引物，以扩增兔IHH（基因号：100008942）目的基因片段，并连接至酶切后（酶切位点Xba/Xho）的过表达载体上。将连接产物转入感受态细胞，并对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，序列正确的克隆即为含有目的基因的过表达载体。用构建的腺病毒表达载体和骨架质粒共转染293细胞，包装病毒，收集病毒原液，通过紫外分光计量法测定病毒液滴度；然后通过超滤浓缩得到病毒浓缩液，使病毒液滴度达到1×1011～1×1012 pfu/mL。
1.2.2 实验分组
取第2代BMSCs，分为RCCS组和传统组2个大组，每个大组进一步分为3个亚组，即IHH基因腺病毒载体转染组（RCCS 1组和传统1组）、GFP腺病毒载体转染组（RCCS 2组和传统2组）及空白对照组（RCCS 3组和传统3组）。
1.2.3 实验方法
①RCCS组：RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化。当BMSCs长满至70%～80%时，RCCS 1、2组分别用IHH基因腺病毒载体及GFP腺病毒载体，以预实验得出的最佳感染复数200转染兔BMSCs，2 h后更换成新鲜的BMSCs专用完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素双抗和1 ng/mL重组人FGF的L-DMEM培养基）；转染24 h后用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集各组细胞，并进行细胞计数。RCCS 3组细胞于BMSCs专用完全培养基中培养24 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集细胞并计数。调整各组细胞悬液密度为1×105个/ mL。参考Wu等[11]的方法进行RCCS处理。取消毒灭菌后的微载体Cytodex 3，用BMSCs完全培养基（含10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的L-DMEM培养基）冲洗后加入适量BMSCs专用完全培养基，调整密度为5 mg/mL。将各组细胞悬液与Cyto dex 3悬液充分混匀，使细胞和微载体的密度分别为4×105个/mL及5 mg/mL，共同接种至50 mL或10 mL RCCS细胞培养容器中，然后安装于旋转基座上置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养，调整RCCS细胞培养容器的转速为10～12 r/min，使细胞、微载体可充分接触；24 h后调整容器转速为12～14 r/min，直至看到容器内的培养物既不会接触到容器壁，又可在旋转过程中呈现自由落体状态。培养24 h后更换为成软骨细胞诱导分化培养基（含100 nmol/L地塞米松、0.17 mmol/L抗环血酸、1 mmol/L丙酮酸钠、0.35 mmol/L L-脯氨酸、1%ITS及10 ng/mL TGF-β的H-DMEM培养基）；以后每2～3天换液1次，共诱导培养21 d。
当需要从容器中取样检测时，先关闭电源，将容器置于生物安全柜中进行操作；倾斜容器，培养物均沉积在容器底部，收集上清液进行相关检测。当需要收集细胞时，充分混匀容器中的培养物，用注射器抽取适量细胞-微载体-培养基混合液，PBS清洗2～3次，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA将细胞从微载体中消化下来，收集细胞。
②传统组：传统组将转染后的细胞以3×105个/孔密度接种至6孔板中，加入BMSCs专用完全培养基2 mL，“十”字摇匀法使细胞均匀接种，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。24 h后同上法进行成软骨诱导分化培养。
1.3 观测指标
1.3.1 IHH基因腺病毒转染效率检测
IHH基因腺病毒载体转染BMSCs 12 h后，荧光显微镜下观察各组细胞IHH基因腺病毒转染效率；倒置相差显微镜下观察BMSCs在微载体Cytodex 3上的贴附情况；荧光显微镜下观察IHH基因腺病毒转染后BMSCs在微载体Cytodex 3上的荧光表达情况。
1.3.2 IHH蛋白表达及ALP活性检测
分别于成软骨诱导分化3、7、14、21 d前1天换液，收集24 h后细胞培养上清液，每组随机取3个样本，通过ELISA法[8]测定细胞培养上清液中IHH蛋白浓度。同时，每组随机取3个样本，根据ALP活性检测试剂盒说明书测定细胞培养上清液中ALP活性。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达
分别于成软骨诱导分化3、7、14、21 d，各组随机收集3组样本细胞，采用Trizol法提取RNA并纯化，根据分光光度法测定抽提RNA在260 nm处的波长，计算RNA的浓度及纯度。每个样本均取50μg RNA进行RT-PCR反应合成cDNA，分光光度法测定合成cDNA的浓度，按照实时荧光定量PCR说明书操作，分析各样本中相关基因的表达。软骨相关基因包括Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9，软骨肥大相关基因包括Ⅹ型胶原、ALP、Annexin V，以GAPDH作为内参。根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）中基因序列信息设计并合成引物，见表 1。
表1
各基因引物序列及产物片段大小
Table1.
The primer sequence and product size of the related genes
1.3.4 Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达
分别于成软骨诱导分化10、21 d，每组随机取3个样本，提取细胞中的蛋白，以GAPDH为内参蛋白，通过Wertern blot方法[13]检测细胞中Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达情况。其中Ⅱ型胶原检测一抗采用兔抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体，二抗为山羊抗兔单克隆抗体；ANCN检测一抗为鼠抗兔ANCN单克隆抗体，二抗为山羊抗鼠单克隆抗体。
1.3.5 甲苯胺蓝染色及AnnexinV-cy3免疫荧光染色观察
分别于成软骨诱导分化10、21 d，收集各组细胞爬片，常规行甲苯胺蓝组织学染色，并参考Annexin V-cy3免疫荧光染色试剂盒操作说明及参考文献[8]方法行Annexin V-cy3免疫荧光染色观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IHH基因腺病毒转染效率检测
荧光显微镜观察示，IHH基因腺病毒载体转染BMSCs后12 h即可看到少量绿色荧光，48 h绿色荧光表达最强，病毒转染效率高达95%以上。倒置相差显微镜观察示，RCCS组BMSCs贴附在球形的微载体Cytodex 3上。荧光显微镜观察示，病毒转染后的BMSCs可表达GFP，可见到“灯笼状”的细胞-微载体复合物。见图 1。
图1
IHH基因腺病毒转染效率检测ⓐIHH基因腺病毒载体转染后BMSCs形态观察（荧光显微镜×200）ⓑRCCS组BMSCs贴附于微载体Cytodex 3上（倒置相差显微镜×200）ⓒRCCS组BMSCs病毒转染后可见“灯笼状”细胞-微载体复合物（荧光显微镜×200） 图 2各组成软骨诱导分化各时间点IHH蛋白表达ⓐ传统组ⓑRCCS组 图 3各组成软骨诱导分化各时间点ALP活性检测ⓐ传统组ⓑRCCS组 图 4实时荧光定量PCR检测传统组成软骨诱导各时间点各基因表达量ⓐⅡ型胶原ⓑANCN ⓒSOX9 ⓓⅩ型胶原ⓔALP ⓕAnnexinⅤ
Figure1.
Transfection efficiency of IHH gene ⓐBMSCs morphology after transfection (Fluorescence microscopy×200) ⓑAdhesion of BMSCs on the surface of the Cytodex 3 micro-carriers in RCCS group (Inverted phase contrast microscopy×200) ⓒ"Lantern-like"cell micro-carrier complexes in RCCS group after transfection (Fluorescence microscopy×200) Fig. 2 IHH protein expression in each group at different time points after chondrogenic induction ⓐConventional group ⓑRCCS group Fig. 3 ALP activity in each group at different time points after chondrogenic induction ⓐConventional group ⓑRCCS group Fig. 4 Expression levels of related genes in the conventional group at different time points after chondrogenic induction by real-time quantitative PCR ⓐCollagen typeⅡⓑANCN ⓒSOX9 ⓓCollagen typeⅩⓔALP ⓕAnnexinⅤ
2.2 IHH蛋白表达及ALP活性检测
2.2.1 IHH蛋白表达
ELISA法检测示，成软骨诱导分化各时间点RCCS 1组及传统1组IHH蛋白均呈过表达，均明显高于RCCS 2、3组和传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但随诱导时间延长，RCCS 1组及传统1组IHH蛋白表达逐渐减少，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2。
2.2.2 ALP活性检测
成软骨诱导分化各时间点传统组中各亚组ALP活性均逐渐增高，且传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。而RCCS组中，仅诱导分化3、7 d RCCS 1组ALP活性稍高于RCCS 2、3组（P < 0.05），其余时间点各亚组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。
2.3 实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达
传统组中，随着成软骨诱导分化时间延长，传统2、3组软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9表达逐渐增多，而传统1组呈先升后降趋势，诱导分化第7、14 d传统1组基因表达量稍高于其他两组，但21 d反而低于其他两组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。各亚组软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP、AnnexinⅤ的表达均基本呈现逐渐增多趋势，且传统1组基因表达量均高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
RCCS组中，随着成软骨诱导分化时间延长，各亚组软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9表达逐渐增多，且RCCS 1组各时间点各基因表达量均明显高于RCCS 2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。各亚组软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP、AnnexinⅤ的表达缓慢增加，在诱导分化中期逐渐稳定，Ⅹ型胶原及ALP在最后表达水平出现下降。RCCS 1组各基因表达量在诱导分化早期（7 d前）稍高于其他两组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但在诱导分化后期（14 d后）与其他两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 5。
图5
实时荧光定量PCR检测RCCS组成软骨诱导分化各时间点各基因表达量ⓐⅡ型胶原ⓑANCN ⓒSOX9 ⓓⅩ型胶原ⓔALP ⓕAnnexinⅤ 图 6 Western blot检测各组成软骨诱导分化各时间点各蛋白表达1：3组2：2组3：1组ⓐ传统组10 d ⓑ传统组21 d ⓒRCCS组10 d ⓓRCCS组21 d
Figure5.
Expression levels of related genes in the RCCS group at different time points after chondrogenic induction by real-time fluorescence quantitative PCR ⓐCollagen typeⅡⓑANCN ⓒSOX9 ⓓCollagen type X ⓔALP ⓕAnnexinⅤ Fig. 6 Expression of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blot 1: Group 3 2: Group 2 3: Group 1 ⓐConventional group at 10 days ⓑConventional group at 21 days ⓒRCCS group at 10 days ⓓRCCS gro up at 21 days
2.4 Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达
传统组中，成软骨诱导分化10 d时各亚组Ⅱ型胶原和ANCN蛋白表达水平均较低，传统1组蛋白表达量稍高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。21 d时，传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组（P < 0.05），但ANCN蛋白表达量各亚组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
RCCS组中，成软骨诱导分化10、21 d时各亚组Ⅱ型胶原和ANCN蛋白表达水平均较高，且RCCS 1组蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6、7。
图7
Western blot检测各组成软骨诱导各时间点各蛋白表达量
ⓐ传统组诱导10 dⅡ型胶原ⓑ传统组诱导10 d ANCN ⓒ传统组诱导21 dⅡ型胶原ⓓ传统组诱导21 d ANCN ⓔRCCS组诱导10 dⅡ型胶原ⓕRCCS组诱导10 d ANCN 𗀂RCCS组诱导21 dⅡ型胶原𗀃RCCS组诱导21 d ANCN
Figure7. Expression levels of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blotⓐ Collagen typeⅡin conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓑANCN in conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓒCollagen typeⅡin conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓓANCN in conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓔCollagen typeⅡin RCCS group after 10 days of chondrogenic induction ⓕANCN in RCCS group after 10 days of chondrogenic induction 𗀂Collagen typeⅡin RCCS group after 21 days of chondrogenic induction 𗀃ANCN in RCCS group after 21 days of chondrogenic induction
2.5 甲苯胺蓝染色及Annexin V-cy3免疫荧光染色观察
2.5.1 甲苯胺蓝染色
传统组中，成软骨诱导分化各时间点各亚组染色均呈浅蓝色，但10 d时传统1组染色深于传统2、3组，21 d时传统1组染色浅于传统2、3组。RCCS组中，成软骨诱导分化10 d，各亚组染色均呈淡蓝色，21 d均呈蓝色，RCCS 1组染色均明显深于RCCS 2、3组。见图 8。
图8
成软骨诱导分化各时间点各组甲苯胺蓝染色观察（倒置相差显微镜×100）
ⓐ传统1组10 d ⓑ传统2组10 d ⓒ传统3组10 d ⓓ传统1组21 d ⓔ传统2组21 d ⓕ传统3组21 d ⓖ RCCS 1组10 d ⓗ RCCS 2组10 d ⓘ RCCS 3组10 d ⓙ RCCS 1组21 d ⓚ RCCS 2组21 d ⓛ RCCS 3组21 d
Figure8. Methylene blue staining results in each group at differenct time points after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscopy×100)ⓐConventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 10 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
2.5.2 AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色
传统组中，成软骨诱导分化10 d，各亚组均呈现少量红色荧光，21 d均有较强红色荧光，传统1组红色荧光均强于传统2、3组。RCCS组中，成软骨诱导分化10、21 d，各亚组红色荧光表达均较弱，组间无明显差异。见图 9。
图9
成软骨诱导各时间点各组AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色观察（荧光显微镜×100）
ⓐ传统1组10 d ⓑ传统2组10 d ⓒ传统3组10 d ⓓ传统1组21 d ⓔ传统2组21 d ⓕ传统3组21 d ⓖ RCCS 1组10 d ⓗ RCCS 2组10 d ⓘ RCCS 3组10 d ⓙ RCCS 1组21 d ⓚ RCCS 2组21 d ⓛ RCCS 3组21 d
Figure9. Annexin V-cy3 immunofluorescence staining results in each group at different time points after chondrogenic induction (Fluorescence microscopy×100)ⓐ Conventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 1 0 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
3 讨论
BMSCs成软骨分化是在多种信号通路协同调控下完成的，如TGF-β/BMP、Wnt、FGF、IGF和Hedgehog等通路在此过程中发挥不同的调控作用，Hedgehog信号通路是其中一种重要的信号通路[14-15]。IHH是Hedeghog信号通路中的一个同源蛋白，可通过直接和间接两条途径来调控软骨发育，在促进软骨细胞增殖的同时抑制软骨细胞老化，其中IHH和其受体PTHrP形成的负反馈通路发挥重要作用[7]。因此，IHH基因被认为是一个有利于软骨形成的因子，可用于软骨组织工程以促进软骨形成。一些基础研究也发现[8]，IHH基因无论是单独转染BMSCs，还是联合TGF-β或BMP-2基因共转染，均可促进BMSCs成软骨分化。BMSCs生长和分化过程中，Hedgehog信号被激活时将促使IHH基因的表达增加，细胞翻译、表达出IHH蛋白并分泌到细胞外，与细胞膜上相关受体结合后触发一系列反应[8]。细胞培养上清液中IHH蛋白的浓度能够反映IHH信号活性。本研究通过构建IHH基因腺病毒载体转染兔BMSCs，结果发现IHH基因腺病毒转染组高表达IHH蛋白，提示IHH基因过表达腺病毒载体转染成功。但在传统的细胞培养、诱导条件下，传统1组中软骨相关基因的表达呈先高后低的趋势，且在21 d时明显低于其他两组，而软骨肥大相关基因表达却逐渐增高且高于其他两组水平（P < 0.05）。蛋白表达结果也表明，虽然诱导10 dⅡ型胶原和ACNC蛋白表达量高于其他两组，但21 d却低于其他两组。BMSCs经过成软骨诱导分化，细胞形态由梭形或纺锤形变成椭圆形或圆形，逐渐呈现出类软骨细胞样的形态[16]。经甲苯胺蓝染色，细胞外基质可被染成淡蓝色，细胞核深染；且软骨细胞外基质合成越多，染色结果越趋向深蓝色[8]。当软骨细胞发生肥大或凋亡时可表达AnnexinⅤ，经AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色在荧光显微镜下可呈红色荧光，且红光越强，表示AnnexinⅤ表达越多[8]。所以AnnexinⅤ不仅反映细胞凋亡水平，在软骨组织中也是软骨细胞肥大和老化的标志[8]。细胞爬片AnnexinⅤ-cy3染色结果显示，IHH基因腺病毒转染组有较强红色荧光表达，说明IHH基因腺病毒转染组诱导后软骨细胞肥大或老化严重。
以上结果表明，在传统二维细胞培养、诱导模式下，IHH基因虽然在诱导分化早期利于软骨分化进程，但同时亦促进软骨肥大老化，甚至凋亡。分析原因可能是，正常情况下IHH-PTH/PTHrP轴可正向促进PTH及PTHrP的分泌，后者与其受体结合后可加快软骨细胞的增殖；当有软骨内成骨信号通路如Wnt/β-catienine等存在时，软骨细胞随即向成骨方向发展，或者老化和凋亡；而当IHH信号高表达时会加速软骨内成骨的进程，使快速增殖的软骨细胞出现分化、老化，甚至是凋亡[8]。本研究中，传统1组在诱导分化前期软骨相关基因及软骨标志蛋白的表达均优于其他两组，而在后期却明显低于其他两组，也说明了这个问题。此外，传统1组高表达AnnexinⅤ红色荧光蛋白，也提示软骨细胞出现了老化。Fischer等[17]研究发现，间断性的PTHrP蛋白刺激可促进MSCs成软骨细胞分化，软骨相关的Ⅱ型胶原及ANCN表达明显增多，但持续的PTHrP蛋白刺激却可抑制软骨形成，且软骨肥大相关标志基因、蛋白无表达增加。这也从另一方面说明，IHH基因转染后过多的IHH/PTHrP信号积累可能加速了BMSCs至软骨形成，再到软骨成熟和肥大及软骨内成骨的过程。
此外，在BMSCs诱导分化过程中Ⅹ型胶原及ALP基因表达增加，且传统1组明显高于其他两组。说明IHH信号的增加触发了软骨肥大或成骨相关基因及信号通路的激活，后者可导致软骨细胞外的Ⅱ型胶原逐渐变成成骨细胞相关的Ⅹ型胶原，亦可促进ALP的分泌。本研究结果发现，传统1组在诱导分化过程中ALP表达增多且均高于其他两组，也反映了相关信号通路的激活。当cAMP/PKA途径活化剂Forskolin存在时，可有效复制持续性PTHrP刺激时对MSCs成软骨分化的抑制作用及对软骨细胞肥大成熟和肥大的促进作用[17]，这说明cAMP/PKA途径在该过程中发挥重要的中介信号调控作用。
RCCS是一种新型细胞培养生物反应器，由于其可以模拟体内组织细胞生长的微重力环境，因此在软骨组织工程研究中日益受到重视。RCCS中细胞黏附在三维支架材料上并可随着基座的旋转而自由转动。这可使培养物在水平轴上建立类似均质液体的悬浮轨道，使重力向量持续随机分布，因此培养物可维持在连续的自由落体状态有利于细胞聚集，从而加强细胞之间及细胞与基质间的联系。后者可通过激活SIRT1增强SOX9转录，从而增加下游靶基因Ⅱ型胶原的表达[12, 18]。RCCS细胞培养容器具备硅胶换气膜，可使细胞或组织得到充分的气体交换。正是这种高效的细胞内外及细胞间物质传递效率，使细胞具有较强的增殖和分化能力[10, 19]。此外，RCCS还可提供一定的力学刺激，如剪切力、流体静压力、联合压缩力等类似机体的微环境，使细胞在支架材料上分布更加均匀，后者有利于营养物质的吸收和代谢产物的排除，从而促进软骨细胞的增殖分化和基质合成。Cytodex 3是一种球形的细胞培养微载体，直径25～30μm，其表面包裹着一层胶原蛋白，非常有利于BMSCs黏附。BMSCs贴壁生长于Cytodex 3表面并悬浮于培养基中，增加了细胞与培养基的接触面积，从而有利于细胞的代谢与生长。我们将兔BMSCs接种至微载体上并在RCCS中培养进行诱导成软骨分化。结果发现，在RCCS诱导条件下IHH基因腺病毒转染对BMSCs成软骨分化的影响不同于传统模式。表现为在诱导分化过程中，软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9及相关蛋白的表达逐渐增加，RCCS 1组明显高于RCCS 2、3组；而软骨肥大相关标志物的表达水平均较低，各组之间无明显差异。表明在RCCS诱导条件下。IHH基因过表达可促进BMSCs成软骨分化，且能有效抑制软骨细胞肥大。
对于上述结果出现的原因，除了RCCS条件下高效的营养物质传输及代谢废物排除等因素，也可能与一些特殊信号通路的激活有关。RCCS可给予培养物一定的生物力学刺激，这种刺激能介导相关信号通路的改变，从而对BMSCs成软骨分化产生一定影响。多能干细胞在一定力学刺激下，SOX9、Runx2、p38 MAPK等表达水平增加，这些与软骨的合成密切相关[20]。整合素（Integrin）、细胞骨架、MAPK信号通路等是细胞接受和传导力学信号最重要的途径之一。Integrin能够感受胞外力学信号后，将其转化为化学信号并整合成胞内信号，再通过细胞骨架、MAPK等信号通路调节一系列细胞生物学行为[21]。有研究发现[22-23]，在微重力作用下MSCs中Integrinβ1表达增加，但其下游信号FAK及PYK2等表达显著降低；此外，Ras、ERK的磷酸化也受到抑制，而磷酸化的ERK可直接调节Runx2的转录，Runx2与MSCs成骨分化有密切联系。因此，微重力效应下FAK、PYK2等分子磷酸化水平的降低，以及MAPK/ERK信号通路的紊乱，也许能抑制MSCs向软骨细胞分化后进一步发展为成骨细胞。此外，BMP、TGF-β、p38及Wnt/β-catenin等信号也可能参与微重力环境下BMSCs成软骨细胞分化后的调控。实验中成骨相关基因Ⅹ型胶原及ALP表达水平较低，且各组细胞培养上清液中ALP活性也较低，可能与BMSCs分化成软骨后进一步向成骨细胞分化受到抑制相关。但具体的信号调控机制仍需进一步探索。
综上述，体外可成功构建兔IHH基因腺病毒载体，后者可高效转染兔BMSCs并过表达兔IHH蛋白。在传统细胞培养、诱导条件下，IHH基因腺病毒转染BMSCs在诱导分化早期可促进软骨合成，但随即亦可导致软骨肥大老化或向成骨方向分化。而在RCCS培养、诱导条件下，IHH基因腺病毒转染BMSCs可有效促进软骨合成并抑制软骨老化或向成骨发展，适合软骨组织工程的需要。
软骨组织工程为治疗软骨损伤及缺损提供了新思路，BMSCs是目前公认的软骨组织工程种子细胞来源[1-3]，但也存在一些不足。通过BMSCs构建的软骨组织工程组织，较体内正常软骨组织在组织学形态、生物力学性能上仍存在一定差异[4]；体外利用BMSCs构建的组织工程软骨细胞或组织容易老化或向成骨细胞发展，并不适用于修复软骨损伤或缺失[5]。Indianhedgehog（IHH）是hedgehog信号通路中重要的同源蛋白之一，具有调控软骨肥大和骨形成的作用，IHH基因或蛋白的缺失会导致肢体末端畸形发育，同时伴有软骨细胞增殖率的下降和肥大软骨细胞的膨胀[6]。IHH可在软骨细胞增殖和分化的多个阶段发挥调控作用，具有直接和间接的调控途径。目前认为，IHH可促进关节周围软骨细胞增加表达甲状旁腺素/甲状旁腺素相关肽受体（parathy r oid hormone/parathyroid hormone-related protein，PTH/PTHrP），后者则通过与其受体PTHR-1结合来促进软骨细胞的增殖并可抑制其肥大，与此同时，IHH与PTHrP形成负反馈环路，通过cAMP/PKA途径下调IHH的分泌[7]。有研究发现，无论是用IHH单独转染BMSCs，还是联合BMP-2或TGF-β共同转染，均可促进初始BMSCs成软骨细胞分化[8]。这为利用IHH基因转染构建组织工程软骨提供了理论依据。
软骨细胞的生长除了营养支持，还需要特殊生长环境，即细胞生长的微环境。传统BMSCs体外培养和诱导分化通常局限于二维细胞培养环境中，细胞可能出现类似于去分化现象，使培养的细胞逐渐失去其来源组织的许多生理特征[9]；而且经诱导生成的软骨组织只能达到组织形态学及生化成分上的类似，不能实现与原有软骨相同的再生[4]。旋转微重力细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）是一种三维空间微重力培养系统，可使培养物在水平轴上建立类似均质液体的悬浮轨道，培养物的重力向量持续随机分布，因而可保持连续的自由落体状态；同时使作用于培养物的表观重力降至约10-2 g，可使细胞克服重力影响易于凝集和黏附于微载体表面[10-11]。RCCS还可提供一定的生物力学刺激，如剪切力、联合压缩力、流体静压力等，营造类似机体内部微环境，使细胞更均匀地分布于支架材料上，有利于营养物质的传输和代谢废物的排除，从而促进软骨细胞增殖和软骨基质合成[10, 12]。研究表明，RCCS可促进BMSCs分化成软骨细胞，且有利于软骨细胞表型的维持及生物力学特点的体外模拟[13]。
本研究通过IHH基因腺病毒载体转染兔BM SCs，探讨IHH基因转染对兔BMSCs成软骨分化的影响；同时联合RCCS，探讨在模拟体内微重力环境下，利用IHH基因转染BMSCs构建组织工程软骨的可能性，为体内实验修复软骨缺损提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器
兔BMSCs[赛业（广州）生物科技有限公司]；含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的腺病毒过表达载体（上海吉满生物科技有限公司；滴度为1×1011 pfu/mL）。L-DMEM、H-DMEM培养基（HyClone公司，美国）；青霉素/链霉素双抗、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO公司，美国）；重组人FGF（Proteintech公司，美国）；地塞米松、抗坏血酸、胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、丙酮酸钠、TGF-β、甲苯胺蓝（Sigma公司，美国）；膜联蛋白V（Annexin V）-cy3试剂盒（Enzolife公司，美国）；Trizol、Polybrene（Invitrogen公司，美国）；RT-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（Kapa公司，美国）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔IHH蛋白ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；ALP活性检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；兔抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体（Enzolife公司，美国）；鼠抗兔聚集蛋白聚糖（aggrecan，ANCN）单克隆抗体、Cytodex 3（GE公司，美国）；鼠抗兔GAPDH单克隆抗体、羊抗兔免疫荧光二抗、羊抗鼠免疫荧光二抗（Proteintech公司，美国）。
PCR仪（Eppendorf公司，美国）；ABI 7900HT型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；CO2细胞培养箱、超净工作台、离心机、酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR公司，美国）；倒置相差荧光显微镜（Leica Demirb公司，德国）；RCCS（Synthecon公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
1.2.1 IHH基因腺病毒载体的构建
以pDC316-mCMV-EGFP为穿梭质粒构成载体骨架并酶切。设计并合成引物，以扩增兔IHH（基因号：100008942）目的基因片段，并连接至酶切后（酶切位点Xba/Xho）的过表达载体上。将连接产物转入感受态细胞，并对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，序列正确的克隆即为含有目的基因的过表达载体。用构建的腺病毒表达载体和骨架质粒共转染293细胞，包装病毒，收集病毒原液，通过紫外分光计量法测定病毒液滴度；然后通过超滤浓缩得到病毒浓缩液，使病毒液滴度达到1×1011～1×1012 pfu/mL。
1.2.2 实验分组
取第2代BMSCs，分为RCCS组和传统组2个大组，每个大组进一步分为3个亚组，即IHH基因腺病毒载体转染组（RCCS 1组和传统1组）、GFP腺病毒载体转染组（RCCS 2组和传统2组）及空白对照组（RCCS 3组和传统3组）。
1.2.3 实验方法
①RCCS组：RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化。当BMSCs长满至70%～80%时，RCCS 1、2组分别用IHH基因腺病毒载体及GFP腺病毒载体，以预实验得出的最佳感染复数200转染兔BMSCs，2 h后更换成新鲜的BMSCs专用完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素双抗和1 ng/mL重组人FGF的L-DMEM培养基）；转染24 h后用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集各组细胞，并进行细胞计数。RCCS 3组细胞于BMSCs专用完全培养基中培养24 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集细胞并计数。调整各组细胞悬液密度为1×105个/ mL。参考Wu等[11]的方法进行RCCS处理。取消毒灭菌后的微载体Cytodex 3，用BMSCs完全培养基（含10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的L-DMEM培养基）冲洗后加入适量BMSCs专用完全培养基，调整密度为5 mg/mL。将各组细胞悬液与Cyto dex 3悬液充分混匀，使细胞和微载体的密度分别为4×105个/mL及5 mg/mL，共同接种至50 mL或10 mL RCCS细胞培养容器中，然后安装于旋转基座上置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养，调整RCCS细胞培养容器的转速为10～12 r/min，使细胞、微载体可充分接触；24 h后调整容器转速为12～14 r/min，直至看到容器内的培养物既不会接触到容器壁，又可在旋转过程中呈现自由落体状态。培养24 h后更换为成软骨细胞诱导分化培养基（含100 nmol/L地塞米松、0.17 mmol/L抗环血酸、1 mmol/L丙酮酸钠、0.35 mmol/L L-脯氨酸、1%ITS及10 ng/mL TGF-β的H-DMEM培养基）；以后每2～3天换液1次，共诱导培养21 d。
当需要从容器中取样检测时，先关闭电源，将容器置于生物安全柜中进行操作；倾斜容器，培养物均沉积在容器底部，收集上清液进行相关检测。当需要收集细胞时，充分混匀容器中的培养物，用注射器抽取适量细胞-微载体-培养基混合液，PBS清洗2～3次，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA将细胞从微载体中消化下来，收集细胞。
②传统组：传统组将转染后的细胞以3×105个/孔密度接种至6孔板中，加入BMSCs专用完全培养基2 mL，“十”字摇匀法使细胞均匀接种，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。24 h后同上法进行成软骨诱导分化培养。
1.3 观测指标
1.3.1 IHH基因腺病毒转染效率检测
IHH基因腺病毒载体转染BMSCs 12 h后，荧光显微镜下观察各组细胞IHH基因腺病毒转染效率；倒置相差显微镜下观察BMSCs在微载体Cytodex 3上的贴附情况；荧光显微镜下观察IHH基因腺病毒转染后BMSCs在微载体Cytodex 3上的荧光表达情况。
1.3.2 IHH蛋白表达及ALP活性检测
分别于成软骨诱导分化3、7、14、21 d前1天换液，收集24 h后细胞培养上清液，每组随机取3个样本，通过ELISA法[8]测定细胞培养上清液中IHH蛋白浓度。同时，每组随机取3个样本，根据ALP活性检测试剂盒说明书测定细胞培养上清液中ALP活性。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达
分别于成软骨诱导分化3、7、14、21 d，各组随机收集3组样本细胞，采用Trizol法提取RNA并纯化，根据分光光度法测定抽提RNA在260 nm处的波长，计算RNA的浓度及纯度。每个样本均取50μg RNA进行RT-PCR反应合成cDNA，分光光度法测定合成cDNA的浓度，按照实时荧光定量PCR说明书操作，分析各样本中相关基因的表达。软骨相关基因包括Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9，软骨肥大相关基因包括Ⅹ型胶原、ALP、Annexin V，以GAPDH作为内参。根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）中基因序列信息设计并合成引物，见表 1。
表1
各基因引物序列及产物片段大小
Table1.
The primer sequence and product size of the related genes
1.3.4 Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达
分别于成软骨诱导分化10、21 d，每组随机取3个样本，提取细胞中的蛋白，以GAPDH为内参蛋白，通过Wertern blot方法[13]检测细胞中Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达情况。其中Ⅱ型胶原检测一抗采用兔抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体，二抗为山羊抗兔单克隆抗体；ANCN检测一抗为鼠抗兔ANCN单克隆抗体，二抗为山羊抗鼠单克隆抗体。
1.3.5 甲苯胺蓝染色及AnnexinV-cy3免疫荧光染色观察
分别于成软骨诱导分化10、21 d，收集各组细胞爬片，常规行甲苯胺蓝组织学染色，并参考Annexin V-cy3免疫荧光染色试剂盒操作说明及参考文献[8]方法行Annexin V-cy3免疫荧光染色观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IHH基因腺病毒转染效率检测
荧光显微镜观察示，IHH基因腺病毒载体转染BMSCs后12 h即可看到少量绿色荧光，48 h绿色荧光表达最强，病毒转染效率高达95%以上。倒置相差显微镜观察示，RCCS组BMSCs贴附在球形的微载体Cytodex 3上。荧光显微镜观察示，病毒转染后的BMSCs可表达GFP，可见到“灯笼状”的细胞-微载体复合物。见图 1。
图1
IHH基因腺病毒转染效率检测ⓐIHH基因腺病毒载体转染后BMSCs形态观察（荧光显微镜×200）ⓑRCCS组BMSCs贴附于微载体Cytodex 3上（倒置相差显微镜×200）ⓒRCCS组BMSCs病毒转染后可见“灯笼状”细胞-微载体复合物（荧光显微镜×200） 图 2各组成软骨诱导分化各时间点IHH蛋白表达ⓐ传统组ⓑRCCS组 图 3各组成软骨诱导分化各时间点ALP活性检测ⓐ传统组ⓑRCCS组 图 4实时荧光定量PCR检测传统组成软骨诱导各时间点各基因表达量ⓐⅡ型胶原ⓑANCN ⓒSOX9 ⓓⅩ型胶原ⓔALP ⓕAnnexinⅤ
Figure1.
Transfection efficiency of IHH gene ⓐBMSCs morphology after transfection (Fluorescence microscopy×200) ⓑAdhesion of BMSCs on the surface of the Cytodex 3 micro-carriers in RCCS group (Inverted phase contrast microscopy×200) ⓒ"Lantern-like"cell micro-carrier complexes in RCCS group after transfection (Fluorescence microscopy×200) Fig. 2 IHH protein expression in each group at different time points after chondrogenic induction ⓐConventional group ⓑRCCS group Fig. 3 ALP activity in each group at different time points after chondrogenic induction ⓐConventional group ⓑRCCS group Fig. 4 Expression levels of related genes in the conventional group at different time points after chondrogenic induction by real-time quantitative PCR ⓐCollagen typeⅡⓑANCN ⓒSOX9 ⓓCollagen typeⅩⓔALP ⓕAnnexinⅤ
2.2 IHH蛋白表达及ALP活性检测
2.2.1 IHH蛋白表达
ELISA法检测示，成软骨诱导分化各时间点RCCS 1组及传统1组IHH蛋白均呈过表达，均明显高于RCCS 2、3组和传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但随诱导时间延长，RCCS 1组及传统1组IHH蛋白表达逐渐减少，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2。
2.2.2 ALP活性检测
成软骨诱导分化各时间点传统组中各亚组ALP活性均逐渐增高，且传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。而RCCS组中，仅诱导分化3、7 d RCCS 1组ALP活性稍高于RCCS 2、3组（P < 0.05），其余时间点各亚组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。
2.3 实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达
传统组中，随着成软骨诱导分化时间延长，传统2、3组软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9表达逐渐增多，而传统1组呈先升后降趋势，诱导分化第7、14 d传统1组基因表达量稍高于其他两组，但21 d反而低于其他两组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。各亚组软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP、AnnexinⅤ的表达均基本呈现逐渐增多趋势，且传统1组基因表达量均高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
RCCS组中，随着成软骨诱导分化时间延长，各亚组软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9表达逐渐增多，且RCCS 1组各时间点各基因表达量均明显高于RCCS 2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。各亚组软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP、AnnexinⅤ的表达缓慢增加，在诱导分化中期逐渐稳定，Ⅹ型胶原及ALP在最后表达水平出现下降。RCCS 1组各基因表达量在诱导分化早期（7 d前）稍高于其他两组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但在诱导分化后期（14 d后）与其他两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 5。
图5
实时荧光定量PCR检测RCCS组成软骨诱导分化各时间点各基因表达量ⓐⅡ型胶原ⓑANCN ⓒSOX9 ⓓⅩ型胶原ⓔALP ⓕAnnexinⅤ 图 6 Western blot检测各组成软骨诱导分化各时间点各蛋白表达1：3组2：2组3：1组ⓐ传统组10 d ⓑ传统组21 d ⓒRCCS组10 d ⓓRCCS组21 d
Figure5.
Expression levels of related genes in the RCCS group at different time points after chondrogenic induction by real-time fluorescence quantitative PCR ⓐCollagen typeⅡⓑANCN ⓒSOX9 ⓓCollagen type X ⓔALP ⓕAnnexinⅤ Fig. 6 Expression of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blot 1: Group 3 2: Group 2 3: Group 1 ⓐConventional group at 10 days ⓑConventional group at 21 days ⓒRCCS group at 10 days ⓓRCCS gro up at 21 days
2.4 Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达
传统组中，成软骨诱导分化10 d时各亚组Ⅱ型胶原和ANCN蛋白表达水平均较低，传统1组蛋白表达量稍高于传统2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。21 d时，传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组（P < 0.05），但ANCN蛋白表达量各亚组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
RCCS组中，成软骨诱导分化10、21 d时各亚组Ⅱ型胶原和ANCN蛋白表达水平均较高，且RCCS 1组蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6、7。
图7
Western blot检测各组成软骨诱导各时间点各蛋白表达量
ⓐ传统组诱导10 dⅡ型胶原ⓑ传统组诱导10 d ANCN ⓒ传统组诱导21 dⅡ型胶原ⓓ传统组诱导21 d ANCN ⓔRCCS组诱导10 dⅡ型胶原ⓕRCCS组诱导10 d ANCN 𗀂RCCS组诱导21 dⅡ型胶原𗀃RCCS组诱导21 d ANCN
Figure7. Expression levels of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blotⓐ Collagen typeⅡin conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓑANCN in conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓒCollagen typeⅡin conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓓANCN in conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓔCollagen typeⅡin RCCS group after 10 days of chondrogenic induction ⓕANCN in RCCS group after 10 days of chondrogenic induction 𗀂Collagen typeⅡin RCCS group after 21 days of chondrogenic induction 𗀃ANCN in RCCS group after 21 days of chondrogenic induction
2.5 甲苯胺蓝染色及Annexin V-cy3免疫荧光染色观察
2.5.1 甲苯胺蓝染色
传统组中，成软骨诱导分化各时间点各亚组染色均呈浅蓝色，但10 d时传统1组染色深于传统2、3组，21 d时传统1组染色浅于传统2、3组。RCCS组中，成软骨诱导分化10 d，各亚组染色均呈淡蓝色，21 d均呈蓝色，RCCS 1组染色均明显深于RCCS 2、3组。见图 8。
图8
成软骨诱导分化各时间点各组甲苯胺蓝染色观察（倒置相差显微镜×100）
ⓐ传统1组10 d ⓑ传统2组10 d ⓒ传统3组10 d ⓓ传统1组21 d ⓔ传统2组21 d ⓕ传统3组21 d ⓖ RCCS 1组10 d ⓗ RCCS 2组10 d ⓘ RCCS 3组10 d ⓙ RCCS 1组21 d ⓚ RCCS 2组21 d ⓛ RCCS 3组21 d
Figure8. Methylene blue staining results in each group at differenct time points after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscopy×100)ⓐConventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 10 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
2.5.2 AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色
传统组中，成软骨诱导分化10 d，各亚组均呈现少量红色荧光，21 d均有较强红色荧光，传统1组红色荧光均强于传统2、3组。RCCS组中，成软骨诱导分化10、21 d，各亚组红色荧光表达均较弱，组间无明显差异。见图 9。
图9
成软骨诱导各时间点各组AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色观察（荧光显微镜×100）
ⓐ传统1组10 d ⓑ传统2组10 d ⓒ传统3组10 d ⓓ传统1组21 d ⓔ传统2组21 d ⓕ传统3组21 d ⓖ RCCS 1组10 d ⓗ RCCS 2组10 d ⓘ RCCS 3组10 d ⓙ RCCS 1组21 d ⓚ RCCS 2组21 d ⓛ RCCS 3组21 d
Figure9. Annexin V-cy3 immunofluorescence staining results in each group at different time points after chondrogenic induction (Fluorescence microscopy×100)ⓐ Conventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 1 0 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
3 讨论
BMSCs成软骨分化是在多种信号通路协同调控下完成的，如TGF-β/BMP、Wnt、FGF、IGF和Hedgehog等通路在此过程中发挥不同的调控作用，Hedgehog信号通路是其中一种重要的信号通路[14-15]。IHH是Hedeghog信号通路中的一个同源蛋白，可通过直接和间接两条途径来调控软骨发育，在促进软骨细胞增殖的同时抑制软骨细胞老化，其中IHH和其受体PTHrP形成的负反馈通路发挥重要作用[7]。因此，IHH基因被认为是一个有利于软骨形成的因子，可用于软骨组织工程以促进软骨形成。一些基础研究也发现[8]，IHH基因无论是单独转染BMSCs，还是联合TGF-β或BMP-2基因共转染，均可促进BMSCs成软骨分化。BMSCs生长和分化过程中，Hedgehog信号被激活时将促使IHH基因的表达增加，细胞翻译、表达出IHH蛋白并分泌到细胞外，与细胞膜上相关受体结合后触发一系列反应[8]。细胞培养上清液中IHH蛋白的浓度能够反映IHH信号活性。本研究通过构建IHH基因腺病毒载体转染兔BMSCs，结果发现IHH基因腺病毒转染组高表达IHH蛋白，提示IHH基因过表达腺病毒载体转染成功。但在传统的细胞培养、诱导条件下，传统1组中软骨相关基因的表达呈先高后低的趋势，且在21 d时明显低于其他两组，而软骨肥大相关基因表达却逐渐增高且高于其他两组水平（P < 0.05）。蛋白表达结果也表明，虽然诱导10 dⅡ型胶原和ACNC蛋白表达量高于其他两组，但21 d却低于其他两组。BMSCs经过成软骨诱导分化，细胞形态由梭形或纺锤形变成椭圆形或圆形，逐渐呈现出类软骨细胞样的形态[16]。经甲苯胺蓝染色，细胞外基质可被染成淡蓝色，细胞核深染；且软骨细胞外基质合成越多，染色结果越趋向深蓝色[8]。当软骨细胞发生肥大或凋亡时可表达AnnexinⅤ，经AnnexinⅤ-cy3免疫荧光染色在荧光显微镜下可呈红色荧光，且红光越强，表示AnnexinⅤ表达越多[8]。所以AnnexinⅤ不仅反映细胞凋亡水平，在软骨组织中也是软骨细胞肥大和老化的标志[8]。细胞爬片AnnexinⅤ-cy3染色结果显示，IHH基因腺病毒转染组有较强红色荧光表达，说明IHH基因腺病毒转染组诱导后软骨细胞肥大或老化严重。
以上结果表明，在传统二维细胞培养、诱导模式下，IHH基因虽然在诱导分化早期利于软骨分化进程，但同时亦促进软骨肥大老化，甚至凋亡。分析原因可能是，正常情况下IHH-PTH/PTHrP轴可正向促进PTH及PTHrP的分泌，后者与其受体结合后可加快软骨细胞的增殖；当有软骨内成骨信号通路如Wnt/β-catienine等存在时，软骨细胞随即向成骨方向发展，或者老化和凋亡；而当IHH信号高表达时会加速软骨内成骨的进程，使快速增殖的软骨细胞出现分化、老化，甚至是凋亡[8]。本研究中，传统1组在诱导分化前期软骨相关基因及软骨标志蛋白的表达均优于其他两组，而在后期却明显低于其他两组，也说明了这个问题。此外，传统1组高表达AnnexinⅤ红色荧光蛋白，也提示软骨细胞出现了老化。Fischer等[17]研究发现，间断性的PTHrP蛋白刺激可促进MSCs成软骨细胞分化，软骨相关的Ⅱ型胶原及ANCN表达明显增多，但持续的PTHrP蛋白刺激却可抑制软骨形成，且软骨肥大相关标志基因、蛋白无表达增加。这也从另一方面说明，IHH基因转染后过多的IHH/PTHrP信号积累可能加速了BMSCs至软骨形成，再到软骨成熟和肥大及软骨内成骨的过程。
此外，在BMSCs诱导分化过程中Ⅹ型胶原及ALP基因表达增加，且传统1组明显高于其他两组。说明IHH信号的增加触发了软骨肥大或成骨相关基因及信号通路的激活，后者可导致软骨细胞外的Ⅱ型胶原逐渐变成成骨细胞相关的Ⅹ型胶原，亦可促进ALP的分泌。本研究结果发现，传统1组在诱导分化过程中ALP表达增多且均高于其他两组，也反映了相关信号通路的激活。当cAMP/PKA途径活化剂Forskolin存在时，可有效复制持续性PTHrP刺激时对MSCs成软骨分化的抑制作用及对软骨细胞肥大成熟和肥大的促进作用[17]，这说明cAMP/PKA途径在该过程中发挥重要的中介信号调控作用。
RCCS是一种新型细胞培养生物反应器，由于其可以模拟体内组织细胞生长的微重力环境，因此在软骨组织工程研究中日益受到重视。RCCS中细胞黏附在三维支架材料上并可随着基座的旋转而自由转动。这可使培养物在水平轴上建立类似均质液体的悬浮轨道，使重力向量持续随机分布，因此培养物可维持在连续的自由落体状态有利于细胞聚集，从而加强细胞之间及细胞与基质间的联系。后者可通过激活SIRT1增强SOX9转录，从而增加下游靶基因Ⅱ型胶原的表达[12, 18]。RCCS细胞培养容器具备硅胶换气膜，可使细胞或组织得到充分的气体交换。正是这种高效的细胞内外及细胞间物质传递效率，使细胞具有较强的增殖和分化能力[10, 19]。此外，RCCS还可提供一定的力学刺激，如剪切力、流体静压力、联合压缩力等类似机体的微环境，使细胞在支架材料上分布更加均匀，后者有利于营养物质的吸收和代谢产物的排除，从而促进软骨细胞的增殖分化和基质合成。Cytodex 3是一种球形的细胞培养微载体，直径25～30μm，其表面包裹着一层胶原蛋白，非常有利于BMSCs黏附。BMSCs贴壁生长于Cytodex 3表面并悬浮于培养基中，增加了细胞与培养基的接触面积，从而有利于细胞的代谢与生长。我们将兔BMSCs接种至微载体上并在RCCS中培养进行诱导成软骨分化。结果发现，在RCCS诱导条件下IHH基因腺病毒转染对BMSCs成软骨分化的影响不同于传统模式。表现为在诱导分化过程中，软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9及相关蛋白的表达逐渐增加，RCCS 1组明显高于RCCS 2、3组；而软骨肥大相关标志物的表达水平均较低，各组之间无明显差异。表明在RCCS诱导条件下。IHH基因过表达可促进BMSCs成软骨分化，且能有效抑制软骨细胞肥大。
对于上述结果出现的原因，除了RCCS条件下高效的营养物质传输及代谢废物排除等因素，也可能与一些特殊信号通路的激活有关。RCCS可给予培养物一定的生物力学刺激，这种刺激能介导相关信号通路的改变，从而对BMSCs成软骨分化产生一定影响。多能干细胞在一定力学刺激下，SOX9、Runx2、p38 MAPK等表达水平增加，这些与软骨的合成密切相关[20]。整合素（Integrin）、细胞骨架、MAPK信号通路等是细胞接受和传导力学信号最重要的途径之一。Integrin能够感受胞外力学信号后，将其转化为化学信号并整合成胞内信号，再通过细胞骨架、MAPK等信号通路调节一系列细胞生物学行为[21]。有研究发现[22-23]，在微重力作用下MSCs中Integrinβ1表达增加，但其下游信号FAK及PYK2等表达显著降低；此外，Ras、ERK的磷酸化也受到抑制，而磷酸化的ERK可直接调节Runx2的转录，Runx2与MSCs成骨分化有密切联系。因此，微重力效应下FAK、PYK2等分子磷酸化水平的降低，以及MAPK/ERK信号通路的紊乱，也许能抑制MSCs向软骨细胞分化后进一步发展为成骨细胞。此外，BMP、TGF-β、p38及Wnt/β-catenin等信号也可能参与微重力环境下BMSCs成软骨细胞分化后的调控。实验中成骨相关基因Ⅹ型胶原及ALP表达水平较低，且各组细胞培养上清液中ALP活性也较低，可能与BMSCs分化成软骨后进一步向成骨细胞分化受到抑制相关。但具体的信号调控机制仍需进一步探索。
综上述，体外可成功构建兔IHH基因腺病毒载体，后者可高效转染兔BMSCs并过表达兔IHH蛋白。在传统细胞培养、诱导条件下，IHH基因腺病毒转染BMSCs在诱导分化早期可促进软骨合成，但随即亦可导致软骨肥大老化或向成骨方向分化。而在RCCS培养、诱导条件下，IHH基因腺病毒转染BMSCs可有效促进软骨合成并抑制软骨老化或向成骨发展，适合软骨组织工程的需要。
