引用本文： 张磊, 龚跃昆, 赵学凌, 周厚俊. 低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(7): 903-908. doi: 10.7507/1002-1892.20160181 复制
低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）介导低氧适应性反应，其可调控一系列转录因子和下游基因表达，在细胞低氧反应中发挥重要调控作用[1]。不少研究表明稳定HIF蛋白能够促进干细胞成骨分化[2-4]，但也有研究报道其能抑制干细胞成骨分化[5-7]。稳定HIF蛋白，可通过降低细胞生存的氧浓度达到，称为物理性低氧[8]；也可在常氧条件下添加低氧模拟剂，如氯化钴、去铁敏、二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）等，阻断HIF降解而模拟低氧环境，称为化学性低氧[9-11]。目前尚未见物理性低氧与化学性低氧对MSCs成骨分化影响比较的相关研究报道。本研究对1%低氧条件与常氧条件下DMOG对体外培养的BMSCs成骨分化的影响进行比较，以期为后期动物实验及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康3～4周龄昆明小鼠20只，雌雄不限，体质量18～20 g，购于昆明医科大学实验动物中心。
DMOG（Cayman公司，美国）；兔RUNX2单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；小鼠抗HIF-1α单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、兔抗HIF-1α单克隆抗体（Cell Signaling公司，美国）；L-DMEM培养基、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、TGF-β1、甲苯胺蓝、油红O、吲哚美辛、维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松（Sigma公司，美国）；茜素红（上海晶纯生化科技股份有限公司）；ALP定量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒、SuperScriptTMⅢcDNA合成试剂盒、Trizol裂解液（Invitrogen公司，美国）；Golden Taq PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。流式细胞仪（Beckman-Coulter公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司，美国）；ABI prism 7000型实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（ABI公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。
1.2 BMSCs分离、培养及鉴定
取健康3～4周龄昆明小鼠，采用本课题组前期实验方法进行BMSCs分离、培养[12]。鉴定：①取第3代BMSCs离心（半径10 cm、1 000 r/min离心5 min）后去上清，以50μL CD44、CD34、CD90、CD29抗体溶液室温孵育30 min，用PBS液制备单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞表面标记。②取第3代BMSCs，分别以成骨培养基、成脂培养基、成软骨培养基[12]进行培养，并分别于14、7、14 d后行茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色。
1.3 实验分组
实验分为对照组（A组）、低氧培养组（B组）及DMOG干预组（C组）。A组于常氧条件下培养BMSCs，B组于低氧条件下（1%O2[2-3, 12]）培养BM SCs，C组于常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养BMSCs。
1.4 观测指标
1.4.1 MTT法检测BMSCs增殖
取第3代BM SCs，以1×104个/mL密度接种于96孔板内，每孔200 μL。按分组方法分别用常规细胞培养基（含10%FBS的L-DMEM）培养1、2、3、4 d，弃上清，每孔加入含5 mg/mL MTT的常规细胞培养基150μL，继续孵育4 h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL DMSO溶液震荡，待充分溶解后，于酶联免疫检测仪上检测490 nm波长处吸光度（A）值。每组设6个复孔，取均值。
1.4.2 ALP定量检测
取第3代BMSCs，以1×105个/孔密度接种于6孔板内，按分组方法分别用成骨培养基（含10%FBS、50μg/mL维生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、1×10-8 mol/L地塞米松的L-DMEM）培养细胞，于培养7、14 d后收集细胞。用4%多聚甲醛液处理2 min，然后使用RIPA buffer裂解液裂解细胞，按ALP定量检测试剂盒说明操作，酶标仪检测520 nm波长处ALP含量。每组设6个复孔，取均值。
1.4.3 RT-qPCR法定量检测RUNX2与Osterix基因表达
同1.4.2方法分组培养细胞3、7 d后，用Trizol提取总RNA，采用A260/A280比值检测RNA纯度与浓度；使用SuperScriptTMⅢ试剂盒合成cDNA。设计RUNX2、Osterix及β-actin基因引物序列，进行扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列：RUNX2上游5'-TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG-3'，下游5'-GGATGAGGAATGCGCCCTA-3'；Osterix上游5'-ATGGCGTCCTCTCTGCTTG-3'，下游5'-TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT-3'；内参照β-actin上游5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'，下游5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。最后使用Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG荧光染料于RT-qPCR仪进行扩增。反应条件：95℃变性2 min；95℃、15 s，54℃、30 s，65℃、20 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
1.4.4 Western blot检测HIF-1α蛋白表达
同1.4.2方法分组培养细胞24 h后收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白。以BCA法测定蛋白浓度，每组取20μg蛋白进行电泳转膜，以5%牛血清白蛋白封闭2 h，加入一抗小鼠抗HIF-1α单克隆抗体（1:200）4℃孵育过夜，二抗兔抗GAPDH单克隆抗体（1:2 000）37℃孵育2 h；GAPDH为内参蛋白。以Image J软件对蛋白表达条带进行扫描，以内参蛋白灰度值进行校正，目的蛋白与内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4.5 茜素红染色观察
同1.4.2方法分组培养细胞，21 d时弃培养基，10%中性甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗3次，0.1%茜素红染液染色10 min，倒置相差显微镜下观察。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs鉴定
流式细胞术表面标志鉴定示CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD34（-）。见图 1。
图1
流式细胞仪检测BMSCs表面标志ⓐCD29 ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD34 图 2 BMSCs多向诱导分化鉴定ⓐ成骨诱导14 d（茜素红染色×100）ⓑ成脂诱导7 d（油红O染色×100）ⓒ成软骨诱导14 d（甲苯胺蓝染色×100） 图 3 MTT法检测各组各时间点BMSCs增殖 图 4 Western blot检测各组培养24 h HIF-1α蛋白表达1：A组2：C组3：B组 图 5各组培养21 d茜素红染色观察（倒置相差显微镜×100）ⓐA组ⓑB组ⓒC组
Figure1.
BMSCs surface markers by flow cytometry ⓐCD29 ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD34 Fig. 2 Identification of multiple differentiation of BMSCs ⓐOsteogenic induction for 14 days (Alizarin red staining×100) ⓑAdipogenic induction for 7 days (Oil red O staining×100) ⓒCartilage induction for 14 days (Toluidine blue staining×100) Fig. 3BMSCs proliferation by MTT Fig. 4HIF-1αprotein expression by Wester n blot at 24 hours after culture 1: Group A 2: Group C 3: Group B Fig. 5Alizarin red staining observation at 21 days (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
BMSCs经成骨诱导分化14 d后，茜素红染色可见红色结节样钙沉积；成脂诱导7 d后，油红O染色可见红色圆形脂肪滴；成软骨诱导14 d后，细胞逐渐由梭形变为多角形，甲苯胺蓝染色呈蓝色阳性。见图 2。
2.2 MTT法检测BMSCs增殖
培养1 d，3组细胞A值比较差异无统计学意义（P > 0.05）。2、3、4 d，与A组比较，C组均抑制细胞增殖，但差异无统计学意义（P > 0.05）；而B组则促进细胞增殖，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.3 ALP定量检测
培养7 d，A、B、C组ALP含量分别为（1.753±0.077）、（7.222±0.175）、（10.219±0.623）金氏单位/100 mL，14 d分别为（3.412±0.131）、（10.562±0.618）、（15.415±1.521）金氏单位/100 mL。B、C组ALP含量均显著高于A组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 RT-qPCR检测
培养3 d，A、B、C组RUNX2基因相对表达量分别为1.000±0.061、3.822±0.126、4.051±0.132，Osterix基因相对表达量分别为1.000±0.043、1.856±0.062、2.259±0.093；7 d，A、B、C组RUNX2基因相对表达量分别为1.000±0.055、8.666±0.223、9.505±0.216，Osterix基因相对表达量分别为1.000±0.048、3.179±0.305、3.872±0.105。B、C组两种基因相对表达量均显著高于A组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.5 Western blot检测
培养24 h A组未能检出HIF-1α蛋白表达；B、C组HIF-1α蛋白相对表达量分别为0.701±0.003、0.549±0.008，均显著高于A组，且B组高于C组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
2.6 茜素红染色观察
培养21 d茜素红染色示，A组可见少许结节状红染物质，B组可见中等量红染物质，而C组可见大量红染物质。见图 5。
3 讨论
低氧作为细胞的适应性反应，在细胞生理与病理过程中，如红细胞生成、铁代谢、能量代谢、血管生成、血管紧张度、细胞生存与增殖、细胞凋亡、促进与抑制炎性因子生成、激素调节、细胞迁移等方面发挥重要调控作用[13-15]。这一系列低氧反应由HIF介导，使机体适应低氧状态。HIF在体内几乎均以HIF-1和HIF-2两种形式存在。HIF是一个由α和β亚基组成的异源二聚体，相对分子质量为120×103。HIF-β是结构亚基，在细胞内维持恒定水平持续表达。HIF-α由HIF-1α和HIF-2α组成，HIF-1α在机体组织内普遍表达，而HIF-2α仅在特定组织中表达[16]。α亚基是功能亚基，对氧分压改变极为敏感，其本身半衰期仅为5 min，在常氧条件下迅速被降解，因此常氧条件下细胞内很难检测出HIF-α[17]。脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）是含铁的非亚铁血红素双加氧酶，其在氧分子、酮戊二酸、抗坏血酸盐协同下催化HIF降解，是HIF经泛素化途径降解中关键的限速酶[18-19]。PHD抑制剂（PHD inhibitor，PHI）能够抑制PHD活性，进而稳定HIF蛋白，其大概分为铁螯合剂如去铁敏、氯化钴[9-10]，2-酮戊二酸类似物如DMOG[11]，及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金属离子[20-21]。由于铁螯合剂及金属离子会影响细胞离子代谢，副作用较大而受到限制，因此我们选择副作用相对较小的酮戊二酸类似物DMOG作为研究对象。本实验结果也表明，常氧条件下0.5 mmol/ L DMOG均能明显上调HIF-1α蛋白的表达；同时也表明，相对DMOG组而言，1%低氧能更明显上调HIF-1α蛋白的表达，我们推测这可能与DMOG在培养过程中降解、不能持续维持有效实验浓度有关。
目前有关物理性低氧与化学性低氧对MSCs成骨分化影响的研究报道结果并不一致。Jiang等[22]研究表明0.2%O2培养降低人BMSCs的ALP表达，抑制其向成骨分化；Hsu等[5]研究表明1%O2抑制人BMSCs成骨分化；而Ding等[3]研究证实1%O2在成骨分化起始阶段能促进大鼠BMSCs成骨分化；Binder等[4]研究显示5%O2促进人BMSCs成骨分化。Ding等[11]研究表明0.2、0.5、1.0 mmol/L浓度的DMOG均能促进MSCs成骨分化；而Shi等[20]研究表明负载有不同浓度DMOG的氧化硅纳米微球对体外培养的人MSCs成骨分化无明显影响。我们的研究表明，1%O2与0.5 mmol/L DMOG均可上调RUNX2、Osterix mRNA、ALP表达及钙结节沉积。ALP是成骨标志性酶、促进钙的沉积，RUNX2与Osterix是干细胞成骨分化重要的转录因子，促进成骨分化相关基因（Ⅰ型胶原、骨桥素、骨涎蛋白、骨钙素等）的合成[23-24]，表明我们的实验中1%O2与0.5 mmol/L DMOG均能促进BMSCs成骨分化。
我们推测关于物理性低氧与化学性低氧模拟剂对MSCs成骨分化具有不同效应可能基于以下原因：①不同浓度的物理性低氧与不同低氧模拟剂，或不同浓度的同一低氧模拟剂对MSCs的HIF上调程度不同；②物理性低氧或低氧模拟剂作用于MSCs的时间点不同会有不同效应。本实验结果表明，相对于DMOG，1%O2培养更能上调HIF-1蛋白表达，但0.5 mmol/L DMOG表现出更强的促进BMSCs成骨分化的效应。对于这一相互矛盾的结果，我们推测除低氧反应通路外，还有其他机制参与DMOG对BMSCs成骨分化的调控。Sahai等[25]也发现，1%O2培养抑制人脂肪MSCs成骨分化，但这一抑制效应不依赖于HIF蛋白的介导，表明有其他机制参与上诉调控效应。
综上述，本研究通过检测1%O2与0.5 mmol/ L DMOG对BMSCs增殖及成骨分化的影响，发现1%O2能明显促进BMSCs增殖，0.5 mmol/L DMOG对BMSCs增殖无明显影响；1%O2与0.5 mmol/L DMOG均能促进BMSCs成骨分化，且0.5 mmol/L DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。虽然我们就物理性低氧与化学性低氧对BMSCs成骨分化影响做了初步对比，但下一步还需要对不同浓度及不同作用时间点进行对比研究，并进一步研究具体分子机制。
低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）介导低氧适应性反应，其可调控一系列转录因子和下游基因表达，在细胞低氧反应中发挥重要调控作用[1]。不少研究表明稳定HIF蛋白能够促进干细胞成骨分化[2-4]，但也有研究报道其能抑制干细胞成骨分化[5-7]。稳定HIF蛋白，可通过降低细胞生存的氧浓度达到，称为物理性低氧[8]；也可在常氧条件下添加低氧模拟剂，如氯化钴、去铁敏、二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）等，阻断HIF降解而模拟低氧环境，称为化学性低氧[9-11]。目前尚未见物理性低氧与化学性低氧对MSCs成骨分化影响比较的相关研究报道。本研究对1%低氧条件与常氧条件下DMOG对体外培养的BMSCs成骨分化的影响进行比较，以期为后期动物实验及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康3～4周龄昆明小鼠20只，雌雄不限，体质量18～20 g，购于昆明医科大学实验动物中心。
DMOG（Cayman公司，美国）；兔RUNX2单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；小鼠抗HIF-1α单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、兔抗HIF-1α单克隆抗体（Cell Signaling公司，美国）；L-DMEM培养基、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、TGF-β1、甲苯胺蓝、油红O、吲哚美辛、维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松（Sigma公司，美国）；茜素红（上海晶纯生化科技股份有限公司）；ALP定量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒、SuperScriptTMⅢcDNA合成试剂盒、Trizol裂解液（Invitrogen公司，美国）；Golden Taq PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。流式细胞仪（Beckman-Coulter公司，美国）；酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司，美国）；ABI prism 7000型实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（ABI公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。
1.2 BMSCs分离、培养及鉴定
取健康3～4周龄昆明小鼠，采用本课题组前期实验方法进行BMSCs分离、培养[12]。鉴定：①取第3代BMSCs离心（半径10 cm、1 000 r/min离心5 min）后去上清，以50μL CD44、CD34、CD90、CD29抗体溶液室温孵育30 min，用PBS液制备单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞表面标记。②取第3代BMSCs，分别以成骨培养基、成脂培养基、成软骨培养基[12]进行培养，并分别于14、7、14 d后行茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色。
1.3 实验分组
实验分为对照组（A组）、低氧培养组（B组）及DMOG干预组（C组）。A组于常氧条件下培养BMSCs，B组于低氧条件下（1%O2[2-3, 12]）培养BM SCs，C组于常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养BMSCs。
1.4 观测指标
1.4.1 MTT法检测BMSCs增殖
取第3代BM SCs，以1×104个/mL密度接种于96孔板内，每孔200 μL。按分组方法分别用常规细胞培养基（含10%FBS的L-DMEM）培养1、2、3、4 d，弃上清，每孔加入含5 mg/mL MTT的常规细胞培养基150μL，继续孵育4 h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL DMSO溶液震荡，待充分溶解后，于酶联免疫检测仪上检测490 nm波长处吸光度（A）值。每组设6个复孔，取均值。
1.4.2 ALP定量检测
取第3代BMSCs，以1×105个/孔密度接种于6孔板内，按分组方法分别用成骨培养基（含10%FBS、50μg/mL维生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、1×10-8 mol/L地塞米松的L-DMEM）培养细胞，于培养7、14 d后收集细胞。用4%多聚甲醛液处理2 min，然后使用RIPA buffer裂解液裂解细胞，按ALP定量检测试剂盒说明操作，酶标仪检测520 nm波长处ALP含量。每组设6个复孔，取均值。
1.4.3 RT-qPCR法定量检测RUNX2与Osterix基因表达
同1.4.2方法分组培养细胞3、7 d后，用Trizol提取总RNA，采用A260/A280比值检测RNA纯度与浓度；使用SuperScriptTMⅢ试剂盒合成cDNA。设计RUNX2、Osterix及β-actin基因引物序列，进行扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列：RUNX2上游5'-TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG-3'，下游5'-GGATGAGGAATGCGCCCTA-3'；Osterix上游5'-ATGGCGTCCTCTCTGCTTG-3'，下游5'-TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT-3'；内参照β-actin上游5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'，下游5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。最后使用Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG荧光染料于RT-qPCR仪进行扩增。反应条件：95℃变性2 min；95℃、15 s，54℃、30 s，65℃、20 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
1.4.4 Western blot检测HIF-1α蛋白表达
同1.4.2方法分组培养细胞24 h后收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白。以BCA法测定蛋白浓度，每组取20μg蛋白进行电泳转膜，以5%牛血清白蛋白封闭2 h，加入一抗小鼠抗HIF-1α单克隆抗体（1:200）4℃孵育过夜，二抗兔抗GAPDH单克隆抗体（1:2 000）37℃孵育2 h；GAPDH为内参蛋白。以Image J软件对蛋白表达条带进行扫描，以内参蛋白灰度值进行校正，目的蛋白与内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4.5 茜素红染色观察
同1.4.2方法分组培养细胞，21 d时弃培养基，10%中性甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗3次，0.1%茜素红染液染色10 min，倒置相差显微镜下观察。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs鉴定
流式细胞术表面标志鉴定示CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD34（-）。见图 1。
图1
流式细胞仪检测BMSCs表面标志ⓐCD29 ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD34 图 2 BMSCs多向诱导分化鉴定ⓐ成骨诱导14 d（茜素红染色×100）ⓑ成脂诱导7 d（油红O染色×100）ⓒ成软骨诱导14 d（甲苯胺蓝染色×100） 图 3 MTT法检测各组各时间点BMSCs增殖 图 4 Western blot检测各组培养24 h HIF-1α蛋白表达1：A组2：C组3：B组 图 5各组培养21 d茜素红染色观察（倒置相差显微镜×100）ⓐA组ⓑB组ⓒC组
Figure1.
BMSCs surface markers by flow cytometry ⓐCD29 ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD34 Fig. 2 Identification of multiple differentiation of BMSCs ⓐOsteogenic induction for 14 days (Alizarin red staining×100) ⓑAdipogenic induction for 7 days (Oil red O staining×100) ⓒCartilage induction for 14 days (Toluidine blue staining×100) Fig. 3BMSCs proliferation by MTT Fig. 4HIF-1αprotein expression by Wester n blot at 24 hours after culture 1: Group A 2: Group C 3: Group B Fig. 5Alizarin red staining observation at 21 days (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C
BMSCs经成骨诱导分化14 d后，茜素红染色可见红色结节样钙沉积；成脂诱导7 d后，油红O染色可见红色圆形脂肪滴；成软骨诱导14 d后，细胞逐渐由梭形变为多角形，甲苯胺蓝染色呈蓝色阳性。见图 2。
2.2 MTT法检测BMSCs增殖
培养1 d，3组细胞A值比较差异无统计学意义（P > 0.05）。2、3、4 d，与A组比较，C组均抑制细胞增殖，但差异无统计学意义（P > 0.05）；而B组则促进细胞增殖，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.3 ALP定量检测
培养7 d，A、B、C组ALP含量分别为（1.753±0.077）、（7.222±0.175）、（10.219±0.623）金氏单位/100 mL，14 d分别为（3.412±0.131）、（10.562±0.618）、（15.415±1.521）金氏单位/100 mL。B、C组ALP含量均显著高于A组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 RT-qPCR检测
培养3 d，A、B、C组RUNX2基因相对表达量分别为1.000±0.061、3.822±0.126、4.051±0.132，Osterix基因相对表达量分别为1.000±0.043、1.856±0.062、2.259±0.093；7 d，A、B、C组RUNX2基因相对表达量分别为1.000±0.055、8.666±0.223、9.505±0.216，Osterix基因相对表达量分别为1.000±0.048、3.179±0.305、3.872±0.105。B、C组两种基因相对表达量均显著高于A组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.5 Western blot检测
培养24 h A组未能检出HIF-1α蛋白表达；B、C组HIF-1α蛋白相对表达量分别为0.701±0.003、0.549±0.008，均显著高于A组，且B组高于C组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
2.6 茜素红染色观察
培养21 d茜素红染色示，A组可见少许结节状红染物质，B组可见中等量红染物质，而C组可见大量红染物质。见图 5。
3 讨论
低氧作为细胞的适应性反应，在细胞生理与病理过程中，如红细胞生成、铁代谢、能量代谢、血管生成、血管紧张度、细胞生存与增殖、细胞凋亡、促进与抑制炎性因子生成、激素调节、细胞迁移等方面发挥重要调控作用[13-15]。这一系列低氧反应由HIF介导，使机体适应低氧状态。HIF在体内几乎均以HIF-1和HIF-2两种形式存在。HIF是一个由α和β亚基组成的异源二聚体，相对分子质量为120×103。HIF-β是结构亚基，在细胞内维持恒定水平持续表达。HIF-α由HIF-1α和HIF-2α组成，HIF-1α在机体组织内普遍表达，而HIF-2α仅在特定组织中表达[16]。α亚基是功能亚基，对氧分压改变极为敏感，其本身半衰期仅为5 min，在常氧条件下迅速被降解，因此常氧条件下细胞内很难检测出HIF-α[17]。脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）是含铁的非亚铁血红素双加氧酶，其在氧分子、酮戊二酸、抗坏血酸盐协同下催化HIF降解，是HIF经泛素化途径降解中关键的限速酶[18-19]。PHD抑制剂（PHD inhibitor，PHI）能够抑制PHD活性，进而稳定HIF蛋白，其大概分为铁螯合剂如去铁敏、氯化钴[9-10]，2-酮戊二酸类似物如DMOG[11]，及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金属离子[20-21]。由于铁螯合剂及金属离子会影响细胞离子代谢，副作用较大而受到限制，因此我们选择副作用相对较小的酮戊二酸类似物DMOG作为研究对象。本实验结果也表明，常氧条件下0.5 mmol/ L DMOG均能明显上调HIF-1α蛋白的表达；同时也表明，相对DMOG组而言，1%低氧能更明显上调HIF-1α蛋白的表达，我们推测这可能与DMOG在培养过程中降解、不能持续维持有效实验浓度有关。
目前有关物理性低氧与化学性低氧对MSCs成骨分化影响的研究报道结果并不一致。Jiang等[22]研究表明0.2%O2培养降低人BMSCs的ALP表达，抑制其向成骨分化；Hsu等[5]研究表明1%O2抑制人BMSCs成骨分化；而Ding等[3]研究证实1%O2在成骨分化起始阶段能促进大鼠BMSCs成骨分化；Binder等[4]研究显示5%O2促进人BMSCs成骨分化。Ding等[11]研究表明0.2、0.5、1.0 mmol/L浓度的DMOG均能促进MSCs成骨分化；而Shi等[20]研究表明负载有不同浓度DMOG的氧化硅纳米微球对体外培养的人MSCs成骨分化无明显影响。我们的研究表明，1%O2与0.5 mmol/L DMOG均可上调RUNX2、Osterix mRNA、ALP表达及钙结节沉积。ALP是成骨标志性酶、促进钙的沉积，RUNX2与Osterix是干细胞成骨分化重要的转录因子，促进成骨分化相关基因（Ⅰ型胶原、骨桥素、骨涎蛋白、骨钙素等）的合成[23-24]，表明我们的实验中1%O2与0.5 mmol/L DMOG均能促进BMSCs成骨分化。
我们推测关于物理性低氧与化学性低氧模拟剂对MSCs成骨分化具有不同效应可能基于以下原因：①不同浓度的物理性低氧与不同低氧模拟剂，或不同浓度的同一低氧模拟剂对MSCs的HIF上调程度不同；②物理性低氧或低氧模拟剂作用于MSCs的时间点不同会有不同效应。本实验结果表明，相对于DMOG，1%O2培养更能上调HIF-1蛋白表达，但0.5 mmol/L DMOG表现出更强的促进BMSCs成骨分化的效应。对于这一相互矛盾的结果，我们推测除低氧反应通路外，还有其他机制参与DMOG对BMSCs成骨分化的调控。Sahai等[25]也发现，1%O2培养抑制人脂肪MSCs成骨分化，但这一抑制效应不依赖于HIF蛋白的介导，表明有其他机制参与上诉调控效应。
综上述，本研究通过检测1%O2与0.5 mmol/ L DMOG对BMSCs增殖及成骨分化的影响，发现1%O2能明显促进BMSCs增殖，0.5 mmol/L DMOG对BMSCs增殖无明显影响；1%O2与0.5 mmol/L DMOG均能促进BMSCs成骨分化，且0.5 mmol/L DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。虽然我们就物理性低氧与化学性低氧对BMSCs成骨分化影响做了初步对比，但下一步还需要对不同浓度及不同作用时间点进行对比研究，并进一步研究具体分子机制。
