引用本文： 唐彬秩, 王德健, 吴青, 李茂军, 阳倩, 陈昌辉. 胞外信号相关蛋白激酶1/2信号通路与人参皂苷Rg1抗新生鼠缺氧缺血性脑损伤后神经元凋亡. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(8): 1011-1018. doi: 10.7507/1002-1892.20160204 复制
围生期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是导致新生儿死亡及伤残的重要原因之一，目前我国新生儿死亡原因中出生窒息死亡占28.6%，位居首位[1]。尽管近年来HIBD的死亡率及神经系统后遗症的发生率较以往有所降低[1]，但新生儿HIBD仍没有安全有效的治疗方法[2]。因此，深入研究HIBD的发病机制，探索干预HIBD损伤的新靶点，对于临床预防和治疗HIBD具有重要意义。
本课题组既往研究已证实人参皂苷Rg1可通过增强并稳定缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信号途径，抑制半胱天冬氨酸酶3（Caspase-3）的活化，在新生鼠HIBD中发挥抗凋亡的神经保护作用[3]。但该作用过程中，有哪些信号通路参与及相关分子机制尚不清楚。本次研究通过建立新生鼠HIBD模型并给予不同干预药物，观察人参皂苷Rg1对HIF-1α信号轴有关的激酶、核转录因子、凋亡相关蛋白等效应分子在HIBD损伤及修复中的作用及相互关系，以期探明人参皂苷Rg1抗HIBD损伤的可能作用机制，为Rg1用于临床新生儿HIBD的治疗提供药理学理论依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10日龄SPF级SD大鼠48只，雌雄不拘，体质量17～21 g，由四川省人民医院动物实验中心提供。
人参皂甙Rg1（纯度 > 98%，南京泽郎医药科技有限公司）；兔抗大鼠胞外信号相关蛋白激酶1/2（extracellular signal-related protein kinase 1/2，Erk1/2）多克隆抗体（1：1 000）、兔抗大鼠磷酸化Erk1/2（phospho-Erk1/2，p-Erk1/2）多克隆抗体（1：1 000）、兔抗大鼠活化Caspase-3（cleaved Caspase-3，CC3）多抗（Cell Signaling公司，美国）；兔抗大鼠HIF-1α多抗（Santa Cruz公司，美国）；U0126小鼠抗大鼠β-actin单抗（Sigma公司，美国）；山羊抗兔/山羊抗小鼠SP免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司，美国）；ECL化学发光显色试剂盒（Millipore公司，美国）；DAB显色试剂盒（KPL公司，美国）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，美国）。显微镜及图象采集与分析系统（Leica公司，德国）；凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将48只大鼠随机分为4组（n=12）：假手术组、模型组（HI组）、模型+人参皂甙Rg1组（HI+ Rg1组）、模型+人参皂甙Rg1+U0126干预组（HI+Rg1+U0126组）。
HI组、HI+Rg1组、HI+Rg1+U0126组大鼠按照文献[3]方法制备HIBD模型。大鼠乙醚麻醉后仰卧位固定，作颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤切口。30 min后放入缺氧容器，92% N2及8% O2的低氧混合气通气2.5 h，制备HIBD模型。假手术组仅分离右侧颈总动脉后关闭切口，不结扎，不进行低氧通气。HI+Rg1+U0126组于造模前1 h右侧脑室注射给药，具体步骤：乙醚麻醉后俯卧位固定，对耳线前缘作头皮正中切口，暴露前囟，于前囟向后1 mm、矢状缝向右1.5 mm处，以与颅骨切线90°的方向进针，进针深度3 mm；注射U0126，给药剂量为25 μg/kg，溶于5 μL PBS（含2% DMSO），注射时间控制在10 min左右，注射完毕原位保持3 min，然后缓缓将注射器拔出，缝合皮肤。为消除侧脑室注射及溶剂本身的影响，除HI+Rg1+U0126组外的其余3组同法注射相同体积溶剂，其中假手术组于分离右侧颈总动脉前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO），HI组及HI+Rg1组于造模前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO）。HI+Rg1组及HI+Rg1+U0126组于术后即刻腹腔内注射0.1 mL含Rg1（40 mg/ kg）的生理盐水；HI组和假手术组于相同时间点腹腔内注射0.1 mL生理盐水。
1.3 观测指标
1.3.1 Western blot检测Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达
各组术后4、24 h取3只实验动物，距离侧脑室注射部位前、后各3 mm，冠状切取右侧半球皮层和海马脑组织，用含有磷酸酶抑制剂的预冷RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，上样量均为100 μg/孔。8%SDS-PAGE（Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和β-actin蛋白）电泳及12%SDS-PAGE（CC3蛋白）电泳，湿法转膜至聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封闭，一抗室温孵育1 h，4℃过夜（抗体稀释浓度分别为HIF-1α 1：200，Erk1/2、p-Erk1/2、CC3均为1：1 000，β-actin 1：3 000），二抗室温孵育1 h（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG，1：3 000），含0.1% Tween20的TBS洗膜后ECL化学发光试剂盒曝光显影，凝胶成像仪获取图像，用成像仪自带分析软件测定条带积分吸光度（IA）值，计算目的蛋白和β-actin的IA比值作为目的蛋白相对表达量。
1.3.2 免疫组织化学染色检测Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表达
各组术后4、24 h另取3只实验动物，距离侧脑室注射部位前、后各1 mm，冠状切取右侧半球皮层和海马脑组织，用预冷4%多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，抗原热修复后山羊血清封闭30 min，滴加HIF-1α抗体（1：50）或Erk1/2、p-Erk1/2、CC3抗体（1：200），PBS代替一抗作为阴性对照。37℃孵育1 h，4℃孵育过夜。后续步骤参照文献[3]方法进行。光镜下观察阳性细胞显色为棕黄色或棕褐色，每个标本于400倍镜下观察2个视野，图像分析软件测定阳性染色IA值，取均值。
1.3.3 TUNEL染色检测原位神经元凋亡
取1.3.2中制备的部分切片，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，DAB显色。结果判定：胞核为棕黄色或棕褐色的细胞为凋亡细胞。每个标本于400倍镜下随机观察2个视野，计数阳性细胞数和细胞总数，取均值；并根据以下公式计算凋亡指数（apoptotic index，AI），AI=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Western blot检测
各时间点各组均有Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表达（图 1）。术后4、24 h各组Erk1/2蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI组HIF-1α、CC3蛋白表达均较假手术组明显增加（P < 0.05）；术后4 h，HI组p-Erk1/2蛋白表达较假手术组明显增加（P < 0.05），24 h时差异无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1组p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表达较HI组明显上调（P < 0.05），而CC3蛋白表达明显下调（P < 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1+U0126组p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表达较HI+Rg1组明显下调（P < 0.05），而CC3蛋白表达则明显上调（P < 0.05）。见表 1。
图1
Western blot检测各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达 1：假手术组4 h 2：HI组4 h 3：HI+Rg1组4 h 4：HI+ Rg1+U0126组4 h 5：假手术组24 h 6：HI组24 h 7：HI+Rg1组24 h 8：HI+Rg1+U0126组24 h
Figure1.
Expressions of Erk1/2, p-Erk1/2, HIF-1α, and CC3 proteins by Western blot 1: Sham group at 4 hours 2: HI group at 4 hours 3: HI+Rg1 group at 4 hours 4: HI+Rg1+U0126 group at 4 hours 5: Sham group at 24 hours 6: HI group at 24 hours 7: HI+Rg1 group at 24 hours 8: HI+Rg1+U0126 group at 24 hours
表1
术后4、24 h各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白表达比较（n=3，2.2 免疫组织化学染色观察
镜下各组均可见Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白阳性染色。其中，Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达主要分布于脑皮层和海马区等，亚细胞定位主要集中在细胞质（图 2、3）；HIF-1α蛋白表达主要分布于大脑皮层、海马区、齿状回及灰质核，亚细胞定位主要集中在细胞核及细胞质（图 4）；CC3蛋白主要分布于皮层及海马区等，亚细胞定位于细胞核和细胞质（图 5）。
图2
免疫组织化学染色观察术后24 h各组Erk1/2蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+ U0126组 图 3 免疫组织化学染色观察术后24 h各组p-Erk1/2蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组 图 4 免疫组织化学染色观察术后24 h各组HIF-1α蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组
Figure2.
Expression of Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 3 Expression of p-Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 4 Expression of HIF-1αprotein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group
图5
免疫组织化学染色观察术后24 h各组CC3蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组图 6 TUNEL染色观察术后24 h各组神经元凋亡情况（×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组
Figure5.
Expression of CC3 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 6 Apoptosis of neuron in each group at 24 hours by TUNEL staining (×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group
图像分析软件测定示，术后4 h，HI组p-Erk1/2蛋白阳性染色IA值与假手术组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；24 h时两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1组p-Erk1/2蛋白阳性染色IA值较HI组升高，HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显降低，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，HI组HIF-1α蛋白阳性染色IA值较假手术组升高，HI+Rg1组亦较HI组升高，但HI+Rg1+U0126组HIF-1α蛋白阳性染色IA值较HI+Rg1组明显降低，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，HI组CC3蛋白阳性染色IA值较假手术组升高，HI+Rg1组较HI组降低，但HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，各组Erk1/2蛋白阳性染色IA值比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
术后4、24 h各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白阳性染色IA值比较（n=3，2.3 TUNEL染色结果
各时间点各组均见阳性细胞，TUNEL阳性细胞主要分布于脑皮层及海马区，细胞核呈典型棕黄色至棕褐色颗粒（图 6）。假手术组有少量细胞凋亡；HI组术后凋亡细胞持续增加；HI+Rg1组术后4 h凋亡细胞较多，24 h时较前减少。HI+Rg1+U0126组凋亡细胞多于同一时间点HI+Rg1组。
HI组术后4、24 h AI与假手术组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。术后4 h，HI组、HI+Rg1组以及HI+Rg1+U0126组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后24 h，HI+Rg1组AI较HI组明显降低，HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
术后4、24 h各组AI比较（n=3，%，3 讨论
新生儿HIBD时缺氧缺血引起的一系列分子信号通路和能量代谢异常，会导致线粒体功能损伤，细胞凋亡信号过度激活，打破了细胞原有的凋亡/抗凋亡通路平衡，启动细胞凋亡程序[4-5]。而神经元凋亡程度直接决定着HIBD的转归及预后，因此如何增强神经元对HIBD损伤的应激能力，减少其凋亡，成为HIBD损伤后脑组织修复研究的关键。
HIF-1是缺氧条件下广泛存在于人类和哺乳动物细胞内的一种核转录因子，是由HIF-1α和HIF-1β亚基构成的异二聚体，HIF-1α是其调节亚基和功能亚基。我们既往研究已证实包括HIBD在内的许多缺氧缺血相关性病理生理过程中有HIF-1α参与[2-3, 5-8]。
局灶性脑缺血所引起的供血障碍可使局部脑组织发生缺血、缺氧，其细胞损害主要表现为凋亡和死亡两种形式，在发育期脑损伤中以凋亡多见[3, 9]。HIBD损伤引起细胞线粒体膜通透性增高最终会导致Caspase-3活化，Caspase-3是Caspase家族激联激活后的共同通路和诱导凋亡的关键因子，在细胞凋亡进程中处于中心地位，Caspase-3活化形式CC3的出现是神经元凋亡的特征之一[3-4]。其中在缺血半暗带，即缺血侧大脑半球皮层及海马区域，是细胞凋亡的集中表现区域。因此，本研究中我们选择上述区域脑组织进行免疫组织化学染色和TUNEL染色分析及Western blot检测。结果表明，TUNEL阳性细胞率与CC3蛋白表达变化趋势基本一致，而HIF-1α与CC3蛋白表达呈不同的变化趋势，这与前期研究结果一致[3, 9]。
近年来研究表明，从五加科植物人参的根茎中提取的活性单体成分——人参皂甙Rg1，具有广泛的药理学活性，尤其对神经的保护作用日益受到人们重视[10]。尽管迄今为止尚无人参或人参皂甙Rg1在新生儿临床应用的报道，但目前所有证据均表明人参成分的毒性与不良反应通常较轻微[11]，提示其具有用于新生儿的可能性。
早期研究发现，人参活性提取物成分可有效减少新生鼠HIBD中海马神经元的凋亡，从而提高HIBD损伤后新生鼠的存活率[12]。随后在模拟缺氧缺血环境的体外实验中发现，人参抗神经元凋亡的保护作用可能与人参皂苷Rg1稳定细胞生物膜功能[13]，刺激脑源性神经营养因子表达[14]以及抑制凋亡相关分子Caspase-3的活化有关[3]，且这一过程伴随着HIF-1α蛋白表达升高和维持较长时间高表达[3]。这与既往有关中药复方制剂参麦注射液有助于增强HIBD后HIF-1α表达，从而减少海马神经元的凋亡[15]，以及在心血管系统中观察到Rg1对HIF-1α及其下游促血管生成因子的诱导表达一致[16-17]。然而目前尚不清楚人参皂苷Rg1是通过何种信号转导途径实现对HIF-1α及其下游凋亡相关效应分子的表达或活性的调控。
Erk1/2属于丝裂原激活蛋白激酶信号通路，既往研究已明确发育期缺氧缺血鼠脑组织Erk1/2信号通路参与了HIF-1α及其靶基因VEGF的表达调节[18]。最新发表的两项研究表明，Rg1延缓阿尔茨海默病发生、发展及促进鼠胚胎干细胞向神经元分化的效应可被Erk1/2信号通路的抑制剂阻断，提示Rg1的上述生物学效应依赖于Erk1/2信号通路的活化[19-20]。那么Erk1/2是否也参与了新生鼠HIBD后Rg1对HIF-1α及其下游凋亡相关效应分子的表达调控，我们进行了相关研究。
本研究结果显示，假手术组p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达处于较低水平，HI组造模术后4 h，Erk1/2磷酸化水平较假手术组显著增加，但24 h后Erk1/2的磷酸化已降至与假手术组相当的水平；术后4、24 h，HI组HIF-1α蛋白表达水平均较假手术组增加。经腹腔注射Rg1后，HI+Rg1组术后4、24 h Erk1/2磷酸化水平和HIF-1α蛋白表达水平均较HI组上调。与p-Erk1/2、HIF-1α类似，HI组CC3蛋白表达在缺血缺氧后也较假手术组显著增加；而与腹内注射Rg1导致HIBD后p-Erk1/2和HIF-1α表达上调相反，腹内注射Rg1导致HIBD后CC3蛋白表达水平均较同一时间点HI组明显降低，并在HIBD后24 h观察到神经元AI下降。
U0126是目前公认的Erk1/2信号通路抑制剂之一，可在体内外针对Erk1/2信号通路发挥高度特异和高亲和度的抑制作用[18]。我们通过使用U0126干预Erk1/2信号通路后，发现上述Rg1对p-Erk1/2、HIF-1α蛋白的表达上调和CC3蛋白的表达抑制，以及减少后续神经元凋亡的药理学效应明显减弱，即HI+Rg1+U0126组p-Erk1/2、HIF-1α蛋白表达水平较同一时间点HI+Rg1组降低，而CC3蛋白表达水平和HIBD后24 h神经元凋亡水平较同一时间点HI+Rg1组升高。值得注意的是，缺氧缺血应激诱导的Erk1/2磷酸化水平维持时间较短，在HIBD后24 h HIF-1α蛋白表达仍维持在较高水平时Erk1/2已出现去磷酸化改变，提示缺氧缺血刺激Erk1/2磷酸化的高峰可能出现在HIF-1α之前，即缺氧缺血刺激先诱导一过性的Erk1/2磷酸化，以及后续HIF-1α的持续表达；其次，我们发现Rg1可增强并维持缺氧缺血诱导的Erk1/2磷酸化和HIF-1α的持续表达，并抑制Caspase-3活化及后续的神经元凋亡，而用U0126干预后，可抑制Rg1诱导的Erk1/2磷酸化和HIF-1α持续表达，增强Caspase-3的活化并伴随后续神经元凋亡增加。结合既往研究结果[3, 18]，我们认为Rg1通过Erk1/2信号通路增强缺氧缺血刺激对HIF-1α的诱导表达，从而抑制Caspase-3的活化并最终增强神经元的存活能力，可能是新生鼠HIBD损伤后修复的机制之一。
围生期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是导致新生儿死亡及伤残的重要原因之一，目前我国新生儿死亡原因中出生窒息死亡占28.6%，位居首位[1]。尽管近年来HIBD的死亡率及神经系统后遗症的发生率较以往有所降低[1]，但新生儿HIBD仍没有安全有效的治疗方法[2]。因此，深入研究HIBD的发病机制，探索干预HIBD损伤的新靶点，对于临床预防和治疗HIBD具有重要意义。
本课题组既往研究已证实人参皂苷Rg1可通过增强并稳定缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信号途径，抑制半胱天冬氨酸酶3（Caspase-3）的活化，在新生鼠HIBD中发挥抗凋亡的神经保护作用[3]。但该作用过程中，有哪些信号通路参与及相关分子机制尚不清楚。本次研究通过建立新生鼠HIBD模型并给予不同干预药物，观察人参皂苷Rg1对HIF-1α信号轴有关的激酶、核转录因子、凋亡相关蛋白等效应分子在HIBD损伤及修复中的作用及相互关系，以期探明人参皂苷Rg1抗HIBD损伤的可能作用机制，为Rg1用于临床新生儿HIBD的治疗提供药理学理论依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10日龄SPF级SD大鼠48只，雌雄不拘，体质量17～21 g，由四川省人民医院动物实验中心提供。
人参皂甙Rg1（纯度 > 98%，南京泽郎医药科技有限公司）；兔抗大鼠胞外信号相关蛋白激酶1/2（extracellular signal-related protein kinase 1/2，Erk1/2）多克隆抗体（1：1 000）、兔抗大鼠磷酸化Erk1/2（phospho-Erk1/2，p-Erk1/2）多克隆抗体（1：1 000）、兔抗大鼠活化Caspase-3（cleaved Caspase-3，CC3）多抗（Cell Signaling公司，美国）；兔抗大鼠HIF-1α多抗（Santa Cruz公司，美国）；U0126小鼠抗大鼠β-actin单抗（Sigma公司，美国）；山羊抗兔/山羊抗小鼠SP免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司，美国）；ECL化学发光显色试剂盒（Millipore公司，美国）；DAB显色试剂盒（KPL公司，美国）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，美国）。显微镜及图象采集与分析系统（Leica公司，德国）；凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将48只大鼠随机分为4组（n=12）：假手术组、模型组（HI组）、模型+人参皂甙Rg1组（HI+ Rg1组）、模型+人参皂甙Rg1+U0126干预组（HI+Rg1+U0126组）。
HI组、HI+Rg1组、HI+Rg1+U0126组大鼠按照文献[3]方法制备HIBD模型。大鼠乙醚麻醉后仰卧位固定，作颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤切口。30 min后放入缺氧容器，92% N2及8% O2的低氧混合气通气2.5 h，制备HIBD模型。假手术组仅分离右侧颈总动脉后关闭切口，不结扎，不进行低氧通气。HI+Rg1+U0126组于造模前1 h右侧脑室注射给药，具体步骤：乙醚麻醉后俯卧位固定，对耳线前缘作头皮正中切口，暴露前囟，于前囟向后1 mm、矢状缝向右1.5 mm处，以与颅骨切线90°的方向进针，进针深度3 mm；注射U0126，给药剂量为25 μg/kg，溶于5 μL PBS（含2% DMSO），注射时间控制在10 min左右，注射完毕原位保持3 min，然后缓缓将注射器拔出，缝合皮肤。为消除侧脑室注射及溶剂本身的影响，除HI+Rg1+U0126组外的其余3组同法注射相同体积溶剂，其中假手术组于分离右侧颈总动脉前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO），HI组及HI+Rg1组于造模前1 h注射5 μL PBS（含2% DMSO）。HI+Rg1组及HI+Rg1+U0126组于术后即刻腹腔内注射0.1 mL含Rg1（40 mg/ kg）的生理盐水；HI组和假手术组于相同时间点腹腔内注射0.1 mL生理盐水。
1.3 观测指标
1.3.1 Western blot检测Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达
各组术后4、24 h取3只实验动物，距离侧脑室注射部位前、后各3 mm，冠状切取右侧半球皮层和海马脑组织，用含有磷酸酶抑制剂的预冷RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，上样量均为100 μg/孔。8%SDS-PAGE（Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和β-actin蛋白）电泳及12%SDS-PAGE（CC3蛋白）电泳，湿法转膜至聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封闭，一抗室温孵育1 h，4℃过夜（抗体稀释浓度分别为HIF-1α 1：200，Erk1/2、p-Erk1/2、CC3均为1：1 000，β-actin 1：3 000），二抗室温孵育1 h（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG，1：3 000），含0.1% Tween20的TBS洗膜后ECL化学发光试剂盒曝光显影，凝胶成像仪获取图像，用成像仪自带分析软件测定条带积分吸光度（IA）值，计算目的蛋白和β-actin的IA比值作为目的蛋白相对表达量。
1.3.2 免疫组织化学染色检测Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表达
各组术后4、24 h另取3只实验动物，距离侧脑室注射部位前、后各1 mm，冠状切取右侧半球皮层和海马脑组织，用预冷4%多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，抗原热修复后山羊血清封闭30 min，滴加HIF-1α抗体（1：50）或Erk1/2、p-Erk1/2、CC3抗体（1：200），PBS代替一抗作为阴性对照。37℃孵育1 h，4℃孵育过夜。后续步骤参照文献[3]方法进行。光镜下观察阳性细胞显色为棕黄色或棕褐色，每个标本于400倍镜下观察2个视野，图像分析软件测定阳性染色IA值，取均值。
1.3.3 TUNEL染色检测原位神经元凋亡
取1.3.2中制备的部分切片，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，DAB显色。结果判定：胞核为棕黄色或棕褐色的细胞为凋亡细胞。每个标本于400倍镜下随机观察2个视野，计数阳性细胞数和细胞总数，取均值；并根据以下公式计算凋亡指数（apoptotic index，AI），AI=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Western blot检测
各时间点各组均有Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、CC3蛋白表达（图 1）。术后4、24 h各组Erk1/2蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI组HIF-1α、CC3蛋白表达均较假手术组明显增加（P < 0.05）；术后4 h，HI组p-Erk1/2蛋白表达较假手术组明显增加（P < 0.05），24 h时差异无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1组p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表达较HI组明显上调（P < 0.05），而CC3蛋白表达明显下调（P < 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1+U0126组p-Erk1/2及HIF-1α蛋白表达较HI+Rg1组明显下调（P < 0.05），而CC3蛋白表达则明显上调（P < 0.05）。见表 1。
图1
Western blot检测各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达 1：假手术组4 h 2：HI组4 h 3：HI+Rg1组4 h 4：HI+ Rg1+U0126组4 h 5：假手术组24 h 6：HI组24 h 7：HI+Rg1组24 h 8：HI+Rg1+U0126组24 h
Figure1.
Expressions of Erk1/2, p-Erk1/2, HIF-1α, and CC3 proteins by Western blot 1: Sham group at 4 hours 2: HI group at 4 hours 3: HI+Rg1 group at 4 hours 4: HI+Rg1+U0126 group at 4 hours 5: Sham group at 24 hours 6: HI group at 24 hours 7: HI+Rg1 group at 24 hours 8: HI+Rg1+U0126 group at 24 hours
表1
术后4、24 h各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白表达比较（n=3，2.2 免疫组织化学染色观察
镜下各组均可见Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白阳性染色。其中，Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达主要分布于脑皮层和海马区等，亚细胞定位主要集中在细胞质（图 2、3）；HIF-1α蛋白表达主要分布于大脑皮层、海马区、齿状回及灰质核，亚细胞定位主要集中在细胞核及细胞质（图 4）；CC3蛋白主要分布于皮层及海马区等，亚细胞定位于细胞核和细胞质（图 5）。
图2
免疫组织化学染色观察术后24 h各组Erk1/2蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+ U0126组 图 3 免疫组织化学染色观察术后24 h各组p-Erk1/2蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组 图 4 免疫组织化学染色观察术后24 h各组HIF-1α蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组
Figure2.
Expression of Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 3 Expression of p-Erk1/2 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 4 Expression of HIF-1αprotein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group
图5
免疫组织化学染色观察术后24 h各组CC3蛋白表达（SABC×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组图 6 TUNEL染色观察术后24 h各组神经元凋亡情况（×400） ⓐ 假手术组 ⓑ HI组 ⓒ HI+Rg1组 ⓓ HI+Rg1+U0126组
Figure5.
Expression of CC3 protein at 24 hours by immunohistochemistry staining (SABC×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group Fig. 6 Apoptosis of neuron in each group at 24 hours by TUNEL staining (×400) ⓐ Sham group ⓑ HI group ⓒ HI+Rg1 group ⓓ HI+Rg1+U0126 group
图像分析软件测定示，术后4 h，HI组p-Erk1/2蛋白阳性染色IA值与假手术组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；24 h时两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。术后4、24 h，HI+Rg1组p-Erk1/2蛋白阳性染色IA值较HI组升高，HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显降低，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，HI组HIF-1α蛋白阳性染色IA值较假手术组升高，HI+Rg1组亦较HI组升高，但HI+Rg1+U0126组HIF-1α蛋白阳性染色IA值较HI+Rg1组明显降低，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，HI组CC3蛋白阳性染色IA值较假手术组升高，HI+Rg1组较HI组降低，但HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
术后4、24 h，各组Erk1/2蛋白阳性染色IA值比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
术后4、24 h各组Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α及CC3蛋白阳性染色IA值比较（n=3，2.3 TUNEL染色结果
各时间点各组均见阳性细胞，TUNEL阳性细胞主要分布于脑皮层及海马区，细胞核呈典型棕黄色至棕褐色颗粒（图 6）。假手术组有少量细胞凋亡；HI组术后凋亡细胞持续增加；HI+Rg1组术后4 h凋亡细胞较多，24 h时较前减少。HI+Rg1+U0126组凋亡细胞多于同一时间点HI+Rg1组。
HI组术后4、24 h AI与假手术组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。术后4 h，HI组、HI+Rg1组以及HI+Rg1+U0126组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后24 h，HI+Rg1组AI较HI组明显降低，HI+Rg1+U0126组较HI+Rg1组明显升高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
术后4、24 h各组AI比较（n=3，%，3 讨论
新生儿HIBD时缺氧缺血引起的一系列分子信号通路和能量代谢异常，会导致线粒体功能损伤，细胞凋亡信号过度激活，打破了细胞原有的凋亡/抗凋亡通路平衡，启动细胞凋亡程序[4-5]。而神经元凋亡程度直接决定着HIBD的转归及预后，因此如何增强神经元对HIBD损伤的应激能力，减少其凋亡，成为HIBD损伤后脑组织修复研究的关键。
HIF-1是缺氧条件下广泛存在于人类和哺乳动物细胞内的一种核转录因子，是由HIF-1α和HIF-1β亚基构成的异二聚体，HIF-1α是其调节亚基和功能亚基。我们既往研究已证实包括HIBD在内的许多缺氧缺血相关性病理生理过程中有HIF-1α参与[2-3, 5-8]。
局灶性脑缺血所引起的供血障碍可使局部脑组织发生缺血、缺氧，其细胞损害主要表现为凋亡和死亡两种形式，在发育期脑损伤中以凋亡多见[3, 9]。HIBD损伤引起细胞线粒体膜通透性增高最终会导致Caspase-3活化，Caspase-3是Caspase家族激联激活后的共同通路和诱导凋亡的关键因子，在细胞凋亡进程中处于中心地位，Caspase-3活化形式CC3的出现是神经元凋亡的特征之一[3-4]。其中在缺血半暗带，即缺血侧大脑半球皮层及海马区域，是细胞凋亡的集中表现区域。因此，本研究中我们选择上述区域脑组织进行免疫组织化学染色和TUNEL染色分析及Western blot检测。结果表明，TUNEL阳性细胞率与CC3蛋白表达变化趋势基本一致，而HIF-1α与CC3蛋白表达呈不同的变化趋势，这与前期研究结果一致[3, 9]。
近年来研究表明，从五加科植物人参的根茎中提取的活性单体成分——人参皂甙Rg1，具有广泛的药理学活性，尤其对神经的保护作用日益受到人们重视[10]。尽管迄今为止尚无人参或人参皂甙Rg1在新生儿临床应用的报道，但目前所有证据均表明人参成分的毒性与不良反应通常较轻微[11]，提示其具有用于新生儿的可能性。
早期研究发现，人参活性提取物成分可有效减少新生鼠HIBD中海马神经元的凋亡，从而提高HIBD损伤后新生鼠的存活率[12]。随后在模拟缺氧缺血环境的体外实验中发现，人参抗神经元凋亡的保护作用可能与人参皂苷Rg1稳定细胞生物膜功能[13]，刺激脑源性神经营养因子表达[14]以及抑制凋亡相关分子Caspase-3的活化有关[3]，且这一过程伴随着HIF-1α蛋白表达升高和维持较长时间高表达[3]。这与既往有关中药复方制剂参麦注射液有助于增强HIBD后HIF-1α表达，从而减少海马神经元的凋亡[15]，以及在心血管系统中观察到Rg1对HIF-1α及其下游促血管生成因子的诱导表达一致[16-17]。然而目前尚不清楚人参皂苷Rg1是通过何种信号转导途径实现对HIF-1α及其下游凋亡相关效应分子的表达或活性的调控。
Erk1/2属于丝裂原激活蛋白激酶信号通路，既往研究已明确发育期缺氧缺血鼠脑组织Erk1/2信号通路参与了HIF-1α及其靶基因VEGF的表达调节[18]。最新发表的两项研究表明，Rg1延缓阿尔茨海默病发生、发展及促进鼠胚胎干细胞向神经元分化的效应可被Erk1/2信号通路的抑制剂阻断，提示Rg1的上述生物学效应依赖于Erk1/2信号通路的活化[19-20]。那么Erk1/2是否也参与了新生鼠HIBD后Rg1对HIF-1α及其下游凋亡相关效应分子的表达调控，我们进行了相关研究。
本研究结果显示，假手术组p-Erk1/2、HIF-1α和CC3蛋白表达处于较低水平，HI组造模术后4 h，Erk1/2磷酸化水平较假手术组显著增加，但24 h后Erk1/2的磷酸化已降至与假手术组相当的水平；术后4、24 h，HI组HIF-1α蛋白表达水平均较假手术组增加。经腹腔注射Rg1后，HI+Rg1组术后4、24 h Erk1/2磷酸化水平和HIF-1α蛋白表达水平均较HI组上调。与p-Erk1/2、HIF-1α类似，HI组CC3蛋白表达在缺血缺氧后也较假手术组显著增加；而与腹内注射Rg1导致HIBD后p-Erk1/2和HIF-1α表达上调相反，腹内注射Rg1导致HIBD后CC3蛋白表达水平均较同一时间点HI组明显降低，并在HIBD后24 h观察到神经元AI下降。
U0126是目前公认的Erk1/2信号通路抑制剂之一，可在体内外针对Erk1/2信号通路发挥高度特异和高亲和度的抑制作用[18]。我们通过使用U0126干预Erk1/2信号通路后，发现上述Rg1对p-Erk1/2、HIF-1α蛋白的表达上调和CC3蛋白的表达抑制，以及减少后续神经元凋亡的药理学效应明显减弱，即HI+Rg1+U0126组p-Erk1/2、HIF-1α蛋白表达水平较同一时间点HI+Rg1组降低，而CC3蛋白表达水平和HIBD后24 h神经元凋亡水平较同一时间点HI+Rg1组升高。值得注意的是，缺氧缺血应激诱导的Erk1/2磷酸化水平维持时间较短，在HIBD后24 h HIF-1α蛋白表达仍维持在较高水平时Erk1/2已出现去磷酸化改变，提示缺氧缺血刺激Erk1/2磷酸化的高峰可能出现在HIF-1α之前，即缺氧缺血刺激先诱导一过性的Erk1/2磷酸化，以及后续HIF-1α的持续表达；其次，我们发现Rg1可增强并维持缺氧缺血诱导的Erk1/2磷酸化和HIF-1α的持续表达，并抑制Caspase-3活化及后续的神经元凋亡，而用U0126干预后，可抑制Rg1诱导的Erk1/2磷酸化和HIF-1α持续表达，增强Caspase-3的活化并伴随后续神经元凋亡增加。结合既往研究结果[3, 18]，我们认为Rg1通过Erk1/2信号通路增强缺氧缺血刺激对HIF-1α的诱导表达，从而抑制Caspase-3的活化并最终增强神经元的存活能力，可能是新生鼠HIBD损伤后修复的机制之一。
