引用本文： 吴军, 汤慧芹, 刘群, 干定云, 周曼. α硫辛酸抑制miR-29b表达抗氧化应激促进小鼠糖尿病足愈合的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(8): 1034-1037. doi: 10.7507/1002-1892.20160207 复制
糖尿病足是糖尿病严重慢性并发症之一，不仅导致患者生活质量严重下降，而且治疗困难，是糖尿病患者非外伤性截肢、致死的首要原因[1-2]。探索糖尿病足发生发展的分子机制对于防治这一并发症具有重要意义。研究表明，创面组织中氧化应激增强可能促进糖尿病足的发展，是导致糖尿病足创面难愈的原因之一[3]。改善氧化应激状态有望成为防治糖尿病慢性并发症的有效措施。α硫辛酸是一种高效天然抗氧化剂，可清除活性氧和自由基，螯合金属离子，再生谷胱甘肽、维生素C、维生素E等抗氧化剂，从而减弱氧化应激[4]。目前临床研究表明，α硫辛酸可促进糖尿病足治疗效果[5-6]，但具体分子机制还不完全清楚。
miRNA是近年发现的一组由19～25个核苷酸组成的功能性非编码小RNA，具有保守性、组织特异性和阶段特异性[7]。miRNA表达异常与2型糖尿病的发生发展密切相关[8]。研究证实，has-miR-29b在糖尿病发病过程中发挥重要作用[9]。α硫辛酸是否可以通过抑制miR-29b表达改善糖尿病足创面组织的氧化应激，从而促进其愈合尚不清楚。为此，本研究通过观察α硫辛酸对糖尿病足模型小鼠创面愈合和氧化应激的影响，探讨其具体作用机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
普通级近交系雄性C57BL/6J小鼠60只，体质量200～300 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司。链脲佐菌素（streptozocin，STZ；Sigma公司，美国）；慢病毒包装的miR-29b mimic及其阴性对照（上海吉玛制药技术有限公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）。Image Pro-Plus软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将60只小鼠随机分为4组，每组15只；分别为糖尿病足组（对照组）、α硫辛酸组、miR-29b mimic组及miR-29b mimic阴性对照组（NC组）。各组小鼠每天腹腔注射STZ缓冲液（40 mg/kg），连续注射5 d。4周后测定小鼠尾尖血糖，随机血糖超过11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型制备成功。然后，小鼠腹腔注射0.4%水合氯醛（40 mL/kg）麻醉，下肢脱毛，在后背近腿部皮肤制备大小为5 mm×2 mm的全层创面，建立糖尿病足创面模型。术后对照组给予高脂高糖饮食（含12.0%熟猪油、20.0%蔗糖、2.0%胆固醇、1.0%胆酸盐、65%常规饲料）喂养。α硫辛酸组在高脂高糖饮食基础上，于创面制备当天（第0天）开始，每日尾静脉注射α硫辛酸（100 mg/ kg），连续14 d。miR-29b mimic组及NC组在给予高脂高糖饮食以及注射α硫辛酸基础上，于第0天尾静脉分别注射慢病毒包装后的miR-29b mimic及其阴性对照，病毒注射量为2×107 TU。
1.3 观测指标
1.3.1 创面愈合观测
模型制备后观察各组小鼠存活以及创面愈合情况。第7、14天各组创面照相，采用Image Pro-Plus软件测量创面面积，并按照公式计算相对创面面积，公式为：第n天创面面积/原始创面面积×100%。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测
第0、7、14天，对照组及α硫辛酸组各取5只小鼠脊椎脱臼法处死，切取创面全层组织。PBS洗涤后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol试剂，按TRIzol试剂说明书提取总RNA并测定RNA浓度。然后进行逆转录反应。首先加入RT-PCR反应体系试剂并进行变性退火：RT-PCR引物2 μL，加dd H2O至19 μL；放入PCR仪70℃ 10 min进行变性退火反应。然后继续加入反应体系：缓冲液（Buffer）10 μL，2.5 nmol/L dNTP 2 μL，Prime Script RTase 200 U/ μL 2.5 μL，加dd H2O至50 μL。按30 ℃ 10 min，42℃ 60 min，70 ℃ 15 min的反应条件进行逆转录反应。miR-29b上游引物：5’-CGAGTAGGACCATTAGAAATCAGTGTTA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’。引物由北京天根生物技术有限公司合成。反应体系：含SYBR的PCR预混合液10 μL，ROX染料0.4 μL，逆转录产物2 μL，上、下游产物各2 μL，加dd H2O至20 μL。扩增过程：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60℃ 34 s；扩增40个循环。根据目标基因miR-29b和内参基因U6的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-29b相对表达量。
1.3.3 氧化应激观测
第14天，miR-29b mimic组及NC组各取5只小鼠，脊椎脱臼法处死后，切取创面全层组织；对照组及α硫辛酸组取同时间点创面组织。采用黄嘌呤氧化酶法和二硫代硝基苯甲酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）染色法分别测定组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 α硫辛酸对创面的作用
2.1.1 创面愈合
模型制备后各组小鼠均存活至实验完成。α硫辛酸组创面愈合快于对照组。α硫辛酸组第7、14天相对创面面积分别为40.7%±3.2%、18.2%±3.0%，显著低于对照组的72.0%±5.9%、50.4%±5.5%，比较差异均有统计学意义（t=9.814，P=0.000；t=11.456，P=0.000）。
2.1.2 创面miR-29b表达
组内比较：对照组及α硫辛酸组创面组织第0、7、14天miR-29b相对表达量呈逐渐降低趋势，各时间点间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间比较：第0天两组间比较差异无统计学意义（t=0.183，P=0.859）；第7、14天α硫辛酸组miR-29b相对表达量显著低于对照组，比较差异有统计学意义（t=9.564，P=0.000；t=11.289，P=0.000）。见图 1。
图1
第0、7、14天对照组及α硫辛酸组创面miR-29b相对表达量
Figure1.
The relative miR-29b expression of wound tissues in control group andα-lipoic acid-treated group at the same day, 7, and 14 days after modeling
2.1.3 创面SOD和GSH活性
第14天α硫辛酸组创面组织中SOD和GSH含量分别为（56.4±3.4）U/mgprot、（15.3±1.3）mg/gprot，显著高于对照组的（34.4±4.0）U/mgprot、（11.2±1.4）mg/gprot，比较差异有统计学意义（t=—9.450，P=0.000；t=—4.879，P=0.001）。
2.2 miR-29b mimic对α硫辛酸处理创面的作用
2.2.1 创面愈合miR-29b
mimic组第7、14天相对创面面积分别为61.4%±3.8%、43.2%±4.2%，显著高于NC组的40.2%±2.6%、18.2%±2.2%，比较差异均有统计学意义（t=—10.345，P=0.000；t=—11.945，P=0.000）。
2.2.2 创面SOD和GSH活性
第14天，miR-29bmimic组创面组织中SOD和GSH含量分别为（40.8±3.6）U/mgprot、（12.0±1.3）mg/gprot，均显著低于NC组的（57.4±4.7）U/mgprot、（15.6±1.1）mg/gprot，比较差异有统计学意义（t=6.274，P=0.000；t=4.790，P=0.001）。
3 讨论
研究发现，糖尿病患者的皮肤局部组织长期处于高糖状态，使得氧化产物蓄积，导致氧化应激亢进和抗氧化能力下降，进而促进皮肤组织细胞凋亡，引起神经和微血管损伤，皮肤组织学的改变会加重糖尿病足进程，造成创面难以愈合[3]。因此，降低机体和糖尿病足创面处氧化应激是促进糖尿病足创面愈合的重要方法。α硫辛酸是一种强力抗氧化剂，具有较好的抗氧化应激和减轻炎性反应作用，它在多酶复合体中作为辅酶起作用[10]，可以通过清除自由基和鳌合体内铁、铜等金属离子，减少OH-的形成，抑制神经内氧化应激状态，增加神经营养血管的血流量，加快神经传导速度，提高神经Na+-K+-ATP酶活性，因此在糖尿病及其并发症的治疗中具有广泛的应用前景。目前α硫辛酸已用于糖尿病神经病变的治疗，并发现有显著疗效[11]。已有研究表明，α硫辛酸可通过清除氧自由基，改善氧化应激状态来调整糖尿病小鼠的血糖水平，促进创面愈合[12-13]。α硫辛酸注射液可促进Wagner 1～3级的糖尿病足溃疡愈合，具有较好疗效[5]。本研究中，我们同样发现α硫辛酸可显著促进糖尿病足小鼠创面的愈合，此外还可提高创面组织中抗氧化指标SOD和GSH水平，与既往研究结果一致[12]。然而，关于α硫辛酸提高机体和创面组织抗氧化能力并促进创面愈合的具体分子机制，目前尚不完全清楚。
miRNA主要通过与靶mRNA的3’端非编码区完全或不完全的碱基互补结合，参与近1/3基因表达的调控[7]。大量研究证实miRNA参与了细胞多种生命过程，也是各类疾病发生发展的重要分子机制[13-14]。此外，miRNA被认为可以作为糖尿病发病机制的研究靶点和诊断标志，并有可能用于靶向治疗[15]。近期有研究应用定量PCR检测技术，发现2型糖尿病患者外周血清中miR-29b表达高于正常对照组[16-17]，且炎性细胞因子通过上调miR-29b表达调节抗凋亡蛋白水平诱导胰岛β细胞凋亡，从而促进1型糖尿病的发生[18]，提示miR-29b在糖尿病及其并发症中可能发挥重要作用。目前关于miR-29b对糖尿病足创面愈合的影响及其可能机制罕见报道。本研究中，我们发现α硫辛酸会降低创面组织中miR-29b表达水平；对经α硫辛酸处理的糖尿病模型小鼠分别注射慢病毒包装的miR-29b mimic及其阴性对照后，发现与NC组相比，miR-29b mimic能显著抑制小鼠创面愈合。进一步研究发现，miR-29b mimic同样可抑制α硫辛酸处理糖尿病足模型小鼠SOD和GSH的水平，表明miR-29b可能通过调节氧化应激水平参与糖尿病足的创面愈合。
综上述，α硫辛酸可降低糖尿病足创面组织miR-29b的表达，并通过抑制miR-29b的表达降低创面氧化应激水平，从而促进糖尿病足的创面愈合。本研究结果为明确α硫辛酸保护和治疗糖尿病足机制提供了实验依据，也为miR-29b作为预防和治疗糖尿病及其并发症的分子靶点提供了思路。
糖尿病足是糖尿病严重慢性并发症之一，不仅导致患者生活质量严重下降，而且治疗困难，是糖尿病患者非外伤性截肢、致死的首要原因[1-2]。探索糖尿病足发生发展的分子机制对于防治这一并发症具有重要意义。研究表明，创面组织中氧化应激增强可能促进糖尿病足的发展，是导致糖尿病足创面难愈的原因之一[3]。改善氧化应激状态有望成为防治糖尿病慢性并发症的有效措施。α硫辛酸是一种高效天然抗氧化剂，可清除活性氧和自由基，螯合金属离子，再生谷胱甘肽、维生素C、维生素E等抗氧化剂，从而减弱氧化应激[4]。目前临床研究表明，α硫辛酸可促进糖尿病足治疗效果[5-6]，但具体分子机制还不完全清楚。
miRNA是近年发现的一组由19～25个核苷酸组成的功能性非编码小RNA，具有保守性、组织特异性和阶段特异性[7]。miRNA表达异常与2型糖尿病的发生发展密切相关[8]。研究证实，has-miR-29b在糖尿病发病过程中发挥重要作用[9]。α硫辛酸是否可以通过抑制miR-29b表达改善糖尿病足创面组织的氧化应激，从而促进其愈合尚不清楚。为此，本研究通过观察α硫辛酸对糖尿病足模型小鼠创面愈合和氧化应激的影响，探讨其具体作用机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
普通级近交系雄性C57BL/6J小鼠60只，体质量200～300 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司。链脲佐菌素（streptozocin，STZ；Sigma公司，美国）；慢病毒包装的miR-29b mimic及其阴性对照（上海吉玛制药技术有限公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）。Image Pro-Plus软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将60只小鼠随机分为4组，每组15只；分别为糖尿病足组（对照组）、α硫辛酸组、miR-29b mimic组及miR-29b mimic阴性对照组（NC组）。各组小鼠每天腹腔注射STZ缓冲液（40 mg/kg），连续注射5 d。4周后测定小鼠尾尖血糖，随机血糖超过11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型制备成功。然后，小鼠腹腔注射0.4%水合氯醛（40 mL/kg）麻醉，下肢脱毛，在后背近腿部皮肤制备大小为5 mm×2 mm的全层创面，建立糖尿病足创面模型。术后对照组给予高脂高糖饮食（含12.0%熟猪油、20.0%蔗糖、2.0%胆固醇、1.0%胆酸盐、65%常规饲料）喂养。α硫辛酸组在高脂高糖饮食基础上，于创面制备当天（第0天）开始，每日尾静脉注射α硫辛酸（100 mg/ kg），连续14 d。miR-29b mimic组及NC组在给予高脂高糖饮食以及注射α硫辛酸基础上，于第0天尾静脉分别注射慢病毒包装后的miR-29b mimic及其阴性对照，病毒注射量为2×107 TU。
1.3 观测指标
1.3.1 创面愈合观测
模型制备后观察各组小鼠存活以及创面愈合情况。第7、14天各组创面照相，采用Image Pro-Plus软件测量创面面积，并按照公式计算相对创面面积，公式为：第n天创面面积/原始创面面积×100%。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测
第0、7、14天，对照组及α硫辛酸组各取5只小鼠脊椎脱臼法处死，切取创面全层组织。PBS洗涤后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol试剂，按TRIzol试剂说明书提取总RNA并测定RNA浓度。然后进行逆转录反应。首先加入RT-PCR反应体系试剂并进行变性退火：RT-PCR引物2 μL，加dd H2O至19 μL；放入PCR仪70℃ 10 min进行变性退火反应。然后继续加入反应体系：缓冲液（Buffer）10 μL，2.5 nmol/L dNTP 2 μL，Prime Script RTase 200 U/ μL 2.5 μL，加dd H2O至50 μL。按30 ℃ 10 min，42℃ 60 min，70 ℃ 15 min的反应条件进行逆转录反应。miR-29b上游引物：5’-CGAGTAGGACCATTAGAAATCAGTGTTA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’。引物由北京天根生物技术有限公司合成。反应体系：含SYBR的PCR预混合液10 μL，ROX染料0.4 μL，逆转录产物2 μL，上、下游产物各2 μL，加dd H2O至20 μL。扩增过程：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60℃ 34 s；扩增40个循环。根据目标基因miR-29b和内参基因U6的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-29b相对表达量。
1.3.3 氧化应激观测
第14天，miR-29b mimic组及NC组各取5只小鼠，脊椎脱臼法处死后，切取创面全层组织；对照组及α硫辛酸组取同时间点创面组织。采用黄嘌呤氧化酶法和二硫代硝基苯甲酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）染色法分别测定组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 α硫辛酸对创面的作用
2.1.1 创面愈合
模型制备后各组小鼠均存活至实验完成。α硫辛酸组创面愈合快于对照组。α硫辛酸组第7、14天相对创面面积分别为40.7%±3.2%、18.2%±3.0%，显著低于对照组的72.0%±5.9%、50.4%±5.5%，比较差异均有统计学意义（t=9.814，P=0.000；t=11.456，P=0.000）。
2.1.2 创面miR-29b表达
组内比较：对照组及α硫辛酸组创面组织第0、7、14天miR-29b相对表达量呈逐渐降低趋势，各时间点间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间比较：第0天两组间比较差异无统计学意义（t=0.183，P=0.859）；第7、14天α硫辛酸组miR-29b相对表达量显著低于对照组，比较差异有统计学意义（t=9.564，P=0.000；t=11.289，P=0.000）。见图 1。
图1
第0、7、14天对照组及α硫辛酸组创面miR-29b相对表达量
Figure1.
The relative miR-29b expression of wound tissues in control group andα-lipoic acid-treated group at the same day, 7, and 14 days after modeling
2.1.3 创面SOD和GSH活性
第14天α硫辛酸组创面组织中SOD和GSH含量分别为（56.4±3.4）U/mgprot、（15.3±1.3）mg/gprot，显著高于对照组的（34.4±4.0）U/mgprot、（11.2±1.4）mg/gprot，比较差异有统计学意义（t=—9.450，P=0.000；t=—4.879，P=0.001）。
2.2 miR-29b mimic对α硫辛酸处理创面的作用
2.2.1 创面愈合miR-29b
mimic组第7、14天相对创面面积分别为61.4%±3.8%、43.2%±4.2%，显著高于NC组的40.2%±2.6%、18.2%±2.2%，比较差异均有统计学意义（t=—10.345，P=0.000；t=—11.945，P=0.000）。
2.2.2 创面SOD和GSH活性
第14天，miR-29bmimic组创面组织中SOD和GSH含量分别为（40.8±3.6）U/mgprot、（12.0±1.3）mg/gprot，均显著低于NC组的（57.4±4.7）U/mgprot、（15.6±1.1）mg/gprot，比较差异有统计学意义（t=6.274，P=0.000；t=4.790，P=0.001）。
3 讨论
研究发现，糖尿病患者的皮肤局部组织长期处于高糖状态，使得氧化产物蓄积，导致氧化应激亢进和抗氧化能力下降，进而促进皮肤组织细胞凋亡，引起神经和微血管损伤，皮肤组织学的改变会加重糖尿病足进程，造成创面难以愈合[3]。因此，降低机体和糖尿病足创面处氧化应激是促进糖尿病足创面愈合的重要方法。α硫辛酸是一种强力抗氧化剂，具有较好的抗氧化应激和减轻炎性反应作用，它在多酶复合体中作为辅酶起作用[10]，可以通过清除自由基和鳌合体内铁、铜等金属离子，减少OH-的形成，抑制神经内氧化应激状态，增加神经营养血管的血流量，加快神经传导速度，提高神经Na+-K+-ATP酶活性，因此在糖尿病及其并发症的治疗中具有广泛的应用前景。目前α硫辛酸已用于糖尿病神经病变的治疗，并发现有显著疗效[11]。已有研究表明，α硫辛酸可通过清除氧自由基，改善氧化应激状态来调整糖尿病小鼠的血糖水平，促进创面愈合[12-13]。α硫辛酸注射液可促进Wagner 1～3级的糖尿病足溃疡愈合，具有较好疗效[5]。本研究中，我们同样发现α硫辛酸可显著促进糖尿病足小鼠创面的愈合，此外还可提高创面组织中抗氧化指标SOD和GSH水平，与既往研究结果一致[12]。然而，关于α硫辛酸提高机体和创面组织抗氧化能力并促进创面愈合的具体分子机制，目前尚不完全清楚。
miRNA主要通过与靶mRNA的3’端非编码区完全或不完全的碱基互补结合，参与近1/3基因表达的调控[7]。大量研究证实miRNA参与了细胞多种生命过程，也是各类疾病发生发展的重要分子机制[13-14]。此外，miRNA被认为可以作为糖尿病发病机制的研究靶点和诊断标志，并有可能用于靶向治疗[15]。近期有研究应用定量PCR检测技术，发现2型糖尿病患者外周血清中miR-29b表达高于正常对照组[16-17]，且炎性细胞因子通过上调miR-29b表达调节抗凋亡蛋白水平诱导胰岛β细胞凋亡，从而促进1型糖尿病的发生[18]，提示miR-29b在糖尿病及其并发症中可能发挥重要作用。目前关于miR-29b对糖尿病足创面愈合的影响及其可能机制罕见报道。本研究中，我们发现α硫辛酸会降低创面组织中miR-29b表达水平；对经α硫辛酸处理的糖尿病模型小鼠分别注射慢病毒包装的miR-29b mimic及其阴性对照后，发现与NC组相比，miR-29b mimic能显著抑制小鼠创面愈合。进一步研究发现，miR-29b mimic同样可抑制α硫辛酸处理糖尿病足模型小鼠SOD和GSH的水平，表明miR-29b可能通过调节氧化应激水平参与糖尿病足的创面愈合。
综上述，α硫辛酸可降低糖尿病足创面组织miR-29b的表达，并通过抑制miR-29b的表达降低创面氧化应激水平，从而促进糖尿病足的创面愈合。本研究结果为明确α硫辛酸保护和治疗糖尿病足机制提供了实验依据，也为miR-29b作为预防和治疗糖尿病及其并发症的分子靶点提供了思路。
