引用本文： 雷蕾, 邓伊玲, 陈俊杰, 岑瑛. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ在瘢痕疙瘩组?织?中的表达及意义. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(9): 1143-1145. doi: 10.7507/1002-1892.20160233 复制
瘢痕疙瘩是皮肤损伤愈合过程中，胶原合成代谢机能失去正常约束控制，持续处于亢进状态，导致胶原纤维过度增生的结果。其主要表现为隆出正常皮肤、形状不一、色红质硬的良性肿块。与增生性瘢痕不同的是，瘢痕疙瘩常超过原始损伤界限，治疗后复发率较高。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）是一种由配体激活的核转录因子，其在多种器官的细胞中表达[1]，是核受体超家族成员之一[2]。目前，有关PPAR-γ与瘢痕疙瘩关系的研究报道较少。本实验旨在通过观察PPAR-γ在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达差异，探讨其与瘢痕疙瘩形成之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验标本
实验标本由2012年12月-2014年8月四川大学华西医院烧伤整形科收治的23例瘢痕疙瘩患者自愿捐赠。男11例，女12例；年龄22～61岁，中位年龄48岁。瘢痕疙瘩形成时间2～30年，平均13.8年。瘢痕疙瘩部位：肩部5例，胸部13例，腹部2例，脐部1例，会阴2例。患者均未进行抗瘢痕性药物治疗，无传染、免疫、遗传和皮肤等疾病。所有瘢痕疙瘩标本均经四川大学华西医院病理科确诊。同时以取皮修剪后的剩余正常皮片作为正常对照。取材部位均无感染和溃疡。标本采集后均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋待用。
1.2 主要试剂
兔抗人PPAR-γ多克隆抗体（Abcam公司，英国）；SP试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3 免疫组织化学检测PPAR-γ的表达
取标本石蜡块，切片，片厚4 μm，参照SP试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，PPAR-γ抗体稀释度为1:100，DAB显色，待显色后自来水冲洗3 min，苏木素复染，中性树胶封片。参照Shimizu免疫组织化学评分标准[3]进行半定量分析：在高倍镜（×400）下，无着色为0分，染色面积 < 1/3 1分，1/3～2/3为2分， > 2/3为3分；染色强度：浅着色（黄色或淡棕色）为1分，中度着色（棕黄色或褐色）为2分，深度着色（棕褐色）为3分；两者相加得分为综合评分。由3名研究员分别阅片评分，取均值作为最终评分。总分0～2分判为PPAR-γ染色阴性，3～6分判为阳性，并计算标本阳性率，公式为：阳性标本数/总标本数×100%。于高倍镜（×400）下随机选取5个视野，观察视野里所有细胞，以细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒者记为阳性细胞，记录阳性细胞数，并计算阳性细胞率，公式为：阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
镜下见，PPAR-γ蛋白主要位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，在瘢痕疙瘩和正常皮肤中均有表达。在瘢痕疙瘩中，其位于表皮的棘细胞层、颗粒层以及真皮血管，染色较浅；在正常皮肤中，位于表皮的基底层以及真皮血管壁、汗腺、皮脂腺，染色较深。见图 1。
图1
两组标本PPAR-γ免疫组织化学染色观察（×100）
ⓐ 瘢痕疙瘩组 ⓑ 正常对照组
Figure1. Immunohistochemistry staining of PPAR-γ in 2 groups (×100)ⓐ Keloid group ⓑ Control group
瘢痕疙瘩组免疫组织化学染色评分为（2.65±0.78）分，低于正常对照组的（3.65±1.19）分，比较差异有统计学意义（t=5.030，P=0.000）；标本阳性率为52.17%（12/23），显著低于正常对照组的82.61%（19/23），差异有统计学意义（χ2=4.847，P=0.028）；阳性细胞率为46.04%±8.61%，显著低于正常对照组的59.39%±11.26%，差异有统计学意义（t=5.974，P=0.000）。
3 讨论
目前，学者们对于PPAR-γ抗纤维化作用机制进行了大量研究。研究发现，PPAR-γ参与了多种组织器官纤维化的病理生理过程，通过拮抗TGF-β1的促纤维化、调控TGF/Smad通路等效应发挥抗纤维化作用[4-6]。PPAR-γ配体通过与Smad3竞争性结合P300，抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，发挥抗肺纤维化作用[7]。PPAR-γ活化可以抑制细胞外基质mRNA表达，使细胞外基质合成减少，从而发挥抗肝纤维化作用[8]。纤维化细胞因子α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和羟脯氨酸水平可被肝星状细胞中过量表达的PPAR-γ降低，达到抑制肝纤维化的目的[9]。肝纤维化程度越严重，PPAR-γ mRNA表达越少，而α-平滑肌肌动蛋白表达越高，从而表明PPAR-γ表达的下降，可能使α-平滑肌肌动蛋白的数量增加，加速肝纤维化的形成，提示提高PPAR-γ表达可能改善肝纤维化程度[10]。NO在纤维化的发生过程中起重要作用，采用PPAR-γ激动剂干预人肝星状细胞，能降低诱导性一氧化氮合酶的表达及活性，从而降低NO的合成，减少肝星状细胞活化和增殖引起的炎性介质释放，最终达到抗肝纤维化的作用[11]。PPAR-γ的合成激动剂罗格列酮能通过减少肝星状细胞的增殖和增加其凋亡来抑制肝纤维化的发生、发展[12-13]。罗格列酮还能治疗大鼠以纤维化为特征的肾损伤[14]。血管紧张素1～7能使糖尿病大鼠TGF-β、α-平滑肌肌动蛋白mRNA及蛋白水平上调、PPAR-γ mRNA及蛋白水平表达下调，从而显著抑制肾小管纤维化，间接表明PPAR-γ表达上调可能有抑制肾小管纤维化的作用[15]。PPAR-γ激动剂吡格列酮能通过刺激5-AMP激活性蛋白激酶和抑制炎性反应及氧化应激，修复足细胞损伤，改善肾组织纤维化[16]。增殖性玻璃体视网膜病变以纤维性细胞膜性组织在玻璃体和视网膜周围广泛增生为特征，是眼科常见致盲疾病之一。色素上皮细胞向间质细胞转变是该病发病机制，其中TGF-β在此转变过程中起重要作用，而研究证明PPAR-γ激动剂能降低TGF-β的表达，提示PPAR-γ能改善以纤维化为特征的增殖性玻璃体视网膜病变[17]。PPAR-γ通路激活可抑制糖尿病心肌纤维化的发生、发展，在病程早期即可改善心脏功能[18]。PPAR-γ配体15-脱氧前列腺素J2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮均能减少TGF-β1诱导的合成，表明PPAR-γ通过抑制TGF-β1诱导的瘢痕成纤维细胞细胞外基质的合成，发挥抗瘢痕成纤维细胞纤维化的作用[19]。
有研究证实，PPAR-γ在增生性瘢痕成纤维细胞中表达下降，提示其表达的下降可能参与了增生性瘢痕的形成过程[20]。而瘢痕疙瘩与增生性瘢痕均是机体对皮肤创伤后的过度反应，发病机制、临床表现及治疗方法均类似，提示PPAR-γ在瘢痕疙瘩中可能存在相似的表达情况。但瘢痕疙瘩与增生性瘢痕也存在诸多不同，如瘢痕疙瘩常超出原始创伤的边界生长，各种治疗方法均有较高复发率，其组织成分也与增生性瘢痕不同。因此，研究PPAR-γ在瘢痕疙瘩组织中的表达及作用有重要意义。
本实验免疫组织化学染色结果表明，PPAR-γ在瘢痕疙瘩中的表达较正常皮肤低，提示PPAR-γ可能在瘢痕疙瘩形成中发挥重要的调节作用，其作用可能是通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞转分化效应、降低细胞外基质合成等机制实现的，PPAR-γ激动剂有望用于治疗瘢痕疙瘩，但有待进一步研究明确。
瘢痕疙瘩是皮肤损伤愈合过程中，胶原合成代谢机能失去正常约束控制，持续处于亢进状态，导致胶原纤维过度增生的结果。其主要表现为隆出正常皮肤、形状不一、色红质硬的良性肿块。与增生性瘢痕不同的是，瘢痕疙瘩常超过原始损伤界限，治疗后复发率较高。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）是一种由配体激活的核转录因子，其在多种器官的细胞中表达[1]，是核受体超家族成员之一[2]。目前，有关PPAR-γ与瘢痕疙瘩关系的研究报道较少。本实验旨在通过观察PPAR-γ在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达差异，探讨其与瘢痕疙瘩形成之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验标本
实验标本由2012年12月-2014年8月四川大学华西医院烧伤整形科收治的23例瘢痕疙瘩患者自愿捐赠。男11例，女12例；年龄22～61岁，中位年龄48岁。瘢痕疙瘩形成时间2～30年，平均13.8年。瘢痕疙瘩部位：肩部5例，胸部13例，腹部2例，脐部1例，会阴2例。患者均未进行抗瘢痕性药物治疗，无传染、免疫、遗传和皮肤等疾病。所有瘢痕疙瘩标本均经四川大学华西医院病理科确诊。同时以取皮修剪后的剩余正常皮片作为正常对照。取材部位均无感染和溃疡。标本采集后均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋待用。
1.2 主要试剂
兔抗人PPAR-γ多克隆抗体（Abcam公司，英国）；SP试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3 免疫组织化学检测PPAR-γ的表达
取标本石蜡块，切片，片厚4 μm，参照SP试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，PPAR-γ抗体稀释度为1:100，DAB显色，待显色后自来水冲洗3 min，苏木素复染，中性树胶封片。参照Shimizu免疫组织化学评分标准[3]进行半定量分析：在高倍镜（×400）下，无着色为0分，染色面积 < 1/3 1分，1/3～2/3为2分， > 2/3为3分；染色强度：浅着色（黄色或淡棕色）为1分，中度着色（棕黄色或褐色）为2分，深度着色（棕褐色）为3分；两者相加得分为综合评分。由3名研究员分别阅片评分，取均值作为最终评分。总分0～2分判为PPAR-γ染色阴性，3～6分判为阳性，并计算标本阳性率，公式为：阳性标本数/总标本数×100%。于高倍镜（×400）下随机选取5个视野，观察视野里所有细胞，以细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒者记为阳性细胞，记录阳性细胞数，并计算阳性细胞率，公式为：阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
镜下见，PPAR-γ蛋白主要位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，在瘢痕疙瘩和正常皮肤中均有表达。在瘢痕疙瘩中，其位于表皮的棘细胞层、颗粒层以及真皮血管，染色较浅；在正常皮肤中，位于表皮的基底层以及真皮血管壁、汗腺、皮脂腺，染色较深。见图 1。
图1
两组标本PPAR-γ免疫组织化学染色观察（×100）
ⓐ 瘢痕疙瘩组 ⓑ 正常对照组
Figure1. Immunohistochemistry staining of PPAR-γ in 2 groups (×100)ⓐ Keloid group ⓑ Control group
瘢痕疙瘩组免疫组织化学染色评分为（2.65±0.78）分，低于正常对照组的（3.65±1.19）分，比较差异有统计学意义（t=5.030，P=0.000）；标本阳性率为52.17%（12/23），显著低于正常对照组的82.61%（19/23），差异有统计学意义（χ2=4.847，P=0.028）；阳性细胞率为46.04%±8.61%，显著低于正常对照组的59.39%±11.26%，差异有统计学意义（t=5.974，P=0.000）。
3 讨论
目前，学者们对于PPAR-γ抗纤维化作用机制进行了大量研究。研究发现，PPAR-γ参与了多种组织器官纤维化的病理生理过程，通过拮抗TGF-β1的促纤维化、调控TGF/Smad通路等效应发挥抗纤维化作用[4-6]。PPAR-γ配体通过与Smad3竞争性结合P300，抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，发挥抗肺纤维化作用[7]。PPAR-γ活化可以抑制细胞外基质mRNA表达，使细胞外基质合成减少，从而发挥抗肝纤维化作用[8]。纤维化细胞因子α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和羟脯氨酸水平可被肝星状细胞中过量表达的PPAR-γ降低，达到抑制肝纤维化的目的[9]。肝纤维化程度越严重，PPAR-γ mRNA表达越少，而α-平滑肌肌动蛋白表达越高，从而表明PPAR-γ表达的下降，可能使α-平滑肌肌动蛋白的数量增加，加速肝纤维化的形成，提示提高PPAR-γ表达可能改善肝纤维化程度[10]。NO在纤维化的发生过程中起重要作用，采用PPAR-γ激动剂干预人肝星状细胞，能降低诱导性一氧化氮合酶的表达及活性，从而降低NO的合成，减少肝星状细胞活化和增殖引起的炎性介质释放，最终达到抗肝纤维化的作用[11]。PPAR-γ的合成激动剂罗格列酮能通过减少肝星状细胞的增殖和增加其凋亡来抑制肝纤维化的发生、发展[12-13]。罗格列酮还能治疗大鼠以纤维化为特征的肾损伤[14]。血管紧张素1～7能使糖尿病大鼠TGF-β、α-平滑肌肌动蛋白mRNA及蛋白水平上调、PPAR-γ mRNA及蛋白水平表达下调，从而显著抑制肾小管纤维化，间接表明PPAR-γ表达上调可能有抑制肾小管纤维化的作用[15]。PPAR-γ激动剂吡格列酮能通过刺激5-AMP激活性蛋白激酶和抑制炎性反应及氧化应激，修复足细胞损伤，改善肾组织纤维化[16]。增殖性玻璃体视网膜病变以纤维性细胞膜性组织在玻璃体和视网膜周围广泛增生为特征，是眼科常见致盲疾病之一。色素上皮细胞向间质细胞转变是该病发病机制，其中TGF-β在此转变过程中起重要作用，而研究证明PPAR-γ激动剂能降低TGF-β的表达，提示PPAR-γ能改善以纤维化为特征的增殖性玻璃体视网膜病变[17]。PPAR-γ通路激活可抑制糖尿病心肌纤维化的发生、发展，在病程早期即可改善心脏功能[18]。PPAR-γ配体15-脱氧前列腺素J2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮均能减少TGF-β1诱导的合成，表明PPAR-γ通过抑制TGF-β1诱导的瘢痕成纤维细胞细胞外基质的合成，发挥抗瘢痕成纤维细胞纤维化的作用[19]。
有研究证实，PPAR-γ在增生性瘢痕成纤维细胞中表达下降，提示其表达的下降可能参与了增生性瘢痕的形成过程[20]。而瘢痕疙瘩与增生性瘢痕均是机体对皮肤创伤后的过度反应，发病机制、临床表现及治疗方法均类似，提示PPAR-γ在瘢痕疙瘩中可能存在相似的表达情况。但瘢痕疙瘩与增生性瘢痕也存在诸多不同，如瘢痕疙瘩常超出原始创伤的边界生长，各种治疗方法均有较高复发率，其组织成分也与增生性瘢痕不同。因此，研究PPAR-γ在瘢痕疙瘩组织中的表达及作用有重要意义。
本实验免疫组织化学染色结果表明，PPAR-γ在瘢痕疙瘩中的表达较正常皮肤低，提示PPAR-γ可能在瘢痕疙瘩形成中发挥重要的调节作用，其作用可能是通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞转分化效应、降低细胞外基质合成等机制实现的，PPAR-γ激动剂有望用于治疗瘢痕疙瘩，但有待进一步研究明确。