引用本文： 张钊, 李晓飞, 王燕燕, 崔召伟, 陈著科, 张海宁. 慢病毒介导的多基因联合转染BMSCs注射治疗食蟹猴膝关节炎的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(9): 1153-1159. doi: 10.7507/1002-1892.20160235 复制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是机械性和生物性因素共同作用，导致关节软骨细胞、细胞外基质等合成和降解失平衡，呈进行性加重的关节疾病。随年龄增长OA发病率逐渐增加，70岁以上人群发病率高达80%[1-2]。目前OA治疗包括非药物治疗、药物治疗、手术治疗等，药物治疗效果有限，且副作用较多；手术治疗虽效果明确，但费用高、创伤大。基因治疗是将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞，以纠正基因缺陷或发挥治疗作用。研究表明，增强保护性基因与抑制破坏性基因联合治疗有利于OA软骨的修复[3]。环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）[4]、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）[5]、IGF-1[6]与关节软骨的损伤修复关系密切，本实验通过构建携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA、IGF-1过表达基因的慢病毒载体，将其转染至BMSCs后，注射至食蟹猴骨关节炎模型膝关节腔内，观察关节液中炎性因子及关节软骨的变化，从而为OA基因治疗的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康3岁食蟹猴9只，雌性5只、雄性4只，体质量（6.0±0.3）kg，由济南林业局提供。FBS、胰蛋白酶、青霉素-链霉素（GIBCO公司，美国）；IL-1、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、Aggrecanase-1、IGF-1 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；Ⅱ型胶原一抗、二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）。3.0T MRI仪（GE公司，美国）。
本实验携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siR NA、IGF-1过表达基因的慢病毒载体及慢病毒均由上海吉玛制药技术有限公司构建完成，病毒自身携带绿色荧光蛋白基因。经预实验检测重组慢病毒最佳转染复数为40。
1.2 慢病毒介导多基因共转染BMSCs
1.2.1 BMSCs分离培养及传代
实验用骨髓组织由2015年2月-3月青岛大学附属医院收治的10例髋关节OA患者自愿捐赠，其中男5例、女5例；年龄59～71岁，平均65岁。本实验经青岛大学附属医院伦理委员会批准。于人工全髋关节置换术中取5 mL骨髓，与含0.01mol/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM混匀后，移入25 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2保温箱中培养，3 d后半定量换液，去除非贴壁细胞，之后每2～3天全换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态、贴壁情况，待细胞融合达70%～80%后进行传代。取第3代细胞进行实验。
1.2.2 细胞转染
第3代BMSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化后接种至6孔板，每孔5×105个细胞；分为病毒组及空病毒组。病毒组以最佳转染复数加入慢病毒（每孔2 μL）转染细胞，空病毒组以不含目的基因的空慢病毒转染。转染24 h后更换含血清培养液进行培养。
1.2.3 转染后细胞观测
①细胞生长观察：倒置相差显微镜下观察两组细胞每天生长状态；培养8 d内，每天利用细胞计数板进行细胞计数，并绘制生长曲线。以正常细胞作为对照。②RT-PCR检测：于转染培养1周后，取病毒组、空病毒组细胞及正常BMSCs（正常对照组），参照RT-PCR试剂盒说明书，检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表达。以GAPDH作为内参，以目的基因与GAPDH表达量的比值，作为目的基因相对表达量。实验重复3次。
1.3 实验分组及方法
9只食蟹猴肌肉注射安定（1 mg/kg）与氯胺酮（1 mg/kg）麻醉后，按照Hulth造模法[7]制备OA模型。于右膝髌骨正中作一纵切口，逐层切开暴露膝关节，切断前、后交叉韧带与内侧半月板，关闭切口。术后3 d内肌肉注射克林霉素（15～25 mg/kg），预防感染。术后实验动物不限制活动。
将OA模型随机分为3组，每组3只，分别为病毒组、空病毒组、空白对照组。模型制备术后6周，病毒组及空病毒组动物右膝关节腔内分别注射1.2.2获得的对应1 mL BMSCs（约1×107个），空白对照组注射1 mL生理盐水。实验动物左膝作为正常对照组。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察各组动物存活以及切口愈合、饮食等情况。
1.4.2 ELISA检测
注射后1、4、6周，抽取各组动物双膝关节液0.5 mL，参照ELISA试剂盒说明书检测PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度。
1.4.3 MRI检查
注射后6周，各组动物同上法麻醉，进行双膝关节MRI扫描，观察膝关节软骨有无异常信号。
1.4.4 大体观察
MRI检查后，放血处死各组动物，按照原手术切口入路，观察关节软骨缺损及增生情况，并与正常膝关节软骨进行比较。
1.4.5 组织学及免疫组织化学染色观察
大体观察后，取各组缺损区周围膝关节软骨以及健侧膝关节软骨，石蜡固定后切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，镜下观察软骨细胞大小及排列情况。于200倍镜下，取3个视野，参照改良Pineda评分标准[8]对关节软骨缺损修复区进行组织学评价，包括以下方面：①细胞形态：透明软骨0分，以透明软骨为主1分，以纤维软骨为主2分，以非软骨为主3分，全部非软骨4分。②基质染色：正常染色0分，轻度减弱1分，明显减弱2分，未着色3分。③表面平整：平整范围 > 3/4，0分；1/2～3/4，1分；1/4～1/2，2分；未达 < 1/4，3分。④软骨厚度：达正常厚度的2/3，0分；1/3～2/3，1分；未达1/3，2分。⑤与宿主结合：两边结合0分，一边结合1分，不结合2分。
其余切片行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，镜下观察软骨基质染色情况及分布。
1.4.6 RT-PCR检测
取各组缺损区周围膝关节软骨以及健侧膝关节软骨，同1.2.3方法检测组织COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Bonferroni法检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒转染后细胞观察
2.1.1细胞生长观察倒置相差显微镜下观察，两组细胞转染后形态无明显差异，均呈梭形（图 1）。通过细胞计数，发现转染细胞经1～2 d潜伏期后即进入对数生长期，6～8 d达平台期，各组细胞生长曲线基本平行，提示慢病毒转染对细胞生长无明显不良影响（图 2）。
图1
病毒转染后72 h两组细胞形态观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 图 2 病毒转染后各组细胞生长曲线
Figure1.
Cell morphology at 72 hours after transfection (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group Fig.2 The growth curve of BMSCs after transfection
2.1.2 RT-PCR检测
与空病毒组、正常对照组比较，病毒组COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表达明显降低，IGF-1 mRNA表达明显增加，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。空病毒组与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
表1
RT-PCR检测各组细胞COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相对表达量（n=3, x±s）
Table1.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(n=3, x±s)
2.2 动物实验观察
2.2.1 一般情况
各组动物均存活至实验完成，切口愈合、饮食情况良好。
2.2.2 ELISA检测
注射后1、4、6周，病毒组PGE2、Aggrecanase-1、IL-1浓度明显低于空病毒组、空白对照组，但IGF-1浓度明显增高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。空病毒组与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。病毒组、空病毒组、空白对照组以上指标均显著高于正常对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
ELISA检测各组膝关节液中PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度（ng/L，x±s）
Table2.
Concentrations of PGE2, IL-1, Aggrecanase-1, and IGF-1 in each group by ELISAng/L, x±s)
2.2.3 MRI检查
正常对照组关节面未见明显异常。病毒组、空病毒组及空白对照组关节面均出现异常高密度影，其中病毒组区域最小，空病毒组可见较大异常信号区，空白对照组高密度影区面积最大。见图 3。
图3
注射后6周各组MRI检查 ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 4 注射后6周各组关节软骨大体观察 ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 5 注射后6周各组关节软骨组织学观察（HE×200） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 6 注射后6周各组关节软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×200） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组
Figure3.
MRI examination at 6 weeks after injection ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.4 General observation of cartilage at 6 weeks after injection ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.5 Histological observation of cartilage at 6 weeks after injection (HE×200) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.6 Immunohistochemical observation of collagen type Ⅱ of cartilage at 6 weeks after injection (×200) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group
2.2.4 大体观察
正常对照组膝关节面光滑，无明显缺损。病毒组、空病毒组及空白对照组膝关节内、外髁软骨均出现磨损，周围骨质增生，呈早期OA表现；其中病毒组软骨修复情况优于空病毒组及空白对照组，仅内髁可见一软骨缺损区，外髁基本正常；空病毒组内髁软骨缺损较大，外髁无明显缺损增生；空白对照组内髁可见较大面积软骨缺损，外髁可见骨质增生。见图 4。
2.2.5 组织学观察
镜下见，正常对照组软骨细胞分布均匀，排列整齐，层次清楚，无簇集软骨细胞，潮线完整。空白对照组和空病毒组软骨细胞排列紊乱，出现细胞分离和簇集现象；病毒组软骨细胞增生明显，与空病毒组及空白对照组相比密度较大，细胞核大，染色深。病毒组、空病毒组及空白对照组参照Mankin关节软骨病理评分标准[9]均符合早期OA表现。见图 5。
参照改良Pineda评分标准，正常对照组、病毒组、空病毒组及空白对照组评分分别为0、（3.256±0.658）、（7.435±0.875）、（12.754±0.986）分，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.2.6 免疫组织化学染色
正常对照组细胞质呈棕黄色染色，较均匀，细胞核呈蓝色；病毒组细胞质染色较空病毒组及空白对照组深，偶尔可见棕黄色颗粒，软骨细胞较多；空病毒组及空白对照组染色浅，软骨细胞较少。见图 6。
2.2.7 RT-PCR检测
与空病毒组和空白对照组相比，病毒组COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表达明显降低，IGF-1 mRNA表达明显增高，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；空病毒组与空白对照组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。病毒组、空病毒组、空白对照组以上指标均显著高于正常对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
RT-PCR检测各组软骨组织COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相对表达量（x±s）
Table3.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(x±s)
3 讨论
BMSCs作为组织工程与转基因技术种子细胞，具有多向分化能力，能在体外诱导分化为不同细胞，如成骨、软骨、脂肪、肌样细胞等[10-11]，通过组织工程技术能修复关节炎软骨损伤，在兔OA模型中干细胞分化成骨也取得成功[12]。在OA的发生发展过程中，COX-2、Aggrecanase-1、IGF-1是关键基因，目前研究较多。COX-2表达增多使PGE2的合成上升，会促进炎症发展，进一步导致关节损害[13]。Ag gre ca nase-1活性增强后会导致更多的蛋白多糖被降解，软骨进一步缺损，加重关节的器质性损害及功能障碍[13-14]。IGF-1是调节软骨细胞基质合成最重要的细胞因子，可以有效促进软骨基质合成，抑制软骨基质降解，从而维持关节软骨的正常功能[15-16]。
在基因治疗领域中，单基因或者双基因研究相对较多，但多基因研究较少，本实验同时转入3个基因，以期抑制破坏性基因的表达，增强有益性基因的表达，减少有害炎性因子的产生，增加有益细胞因子的表达，共同保护关节软骨，充分发挥基因治疗的优势。通过构建携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1过表达基因的慢病毒载体，然后转染BMSCs，成功地在细胞水平抑制了COX-2和Aggre canase-1基因表达，增强了IGF-1基因的表达；把基因转染后的干细胞注入食蟹猴OA模型膝关节腔后，测得关节软骨的基因表达发生了与细胞水平一致的变化，其关节液中炎性因子PGE2、IL-1含量显著降低，Aggrecanase-1含量也进一步下降，而IGF-1含量升高，与Yuan等[17]的体外研究结果相符，并且该作用可持续6周。组织学观察显示，该方法能较好地保护软骨基质，促进软骨基质和软骨细胞的生成，提示基因治疗早期OA的有效性。
基因治疗往往针对OA发病过程中的某一个环节，但病情发展是动态的，涉及的关节也多样，不同的病损区域处于不同的病理阶段，所以合理的基因治疗要以OA病理机制为前提，对病情进展中的多个环节进行多点干预，阻断或者延缓病情的发展[18-20]。本实验研究对象为灵长类动物食蟹猴，膝关节受力特点与人类相近，因此提高了实验结论的参考价值。但由于实验动物昂贵，本实验样本量相对较少，且观察时间相对较短，同时实验动物基本为早期OA表现，有关基因治疗中晚期OA的可行性及疗效有待进一步观察。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是机械性和生物性因素共同作用，导致关节软骨细胞、细胞外基质等合成和降解失平衡，呈进行性加重的关节疾病。随年龄增长OA发病率逐渐增加，70岁以上人群发病率高达80%[1-2]。目前OA治疗包括非药物治疗、药物治疗、手术治疗等，药物治疗效果有限，且副作用较多；手术治疗虽效果明确，但费用高、创伤大。基因治疗是将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞，以纠正基因缺陷或发挥治疗作用。研究表明，增强保护性基因与抑制破坏性基因联合治疗有利于OA软骨的修复[3]。环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）[4]、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）[5]、IGF-1[6]与关节软骨的损伤修复关系密切，本实验通过构建携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA、IGF-1过表达基因的慢病毒载体，将其转染至BMSCs后，注射至食蟹猴骨关节炎模型膝关节腔内，观察关节液中炎性因子及关节软骨的变化，从而为OA基因治疗的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康3岁食蟹猴9只，雌性5只、雄性4只，体质量（6.0±0.3）kg，由济南林业局提供。FBS、胰蛋白酶、青霉素-链霉素（GIBCO公司，美国）；IL-1、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、Aggrecanase-1、IGF-1 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；Ⅱ型胶原一抗、二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）。3.0T MRI仪（GE公司，美国）。
本实验携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siR NA、IGF-1过表达基因的慢病毒载体及慢病毒均由上海吉玛制药技术有限公司构建完成，病毒自身携带绿色荧光蛋白基因。经预实验检测重组慢病毒最佳转染复数为40。
1.2 慢病毒介导多基因共转染BMSCs
1.2.1 BMSCs分离培养及传代
实验用骨髓组织由2015年2月-3月青岛大学附属医院收治的10例髋关节OA患者自愿捐赠，其中男5例、女5例；年龄59～71岁，平均65岁。本实验经青岛大学附属医院伦理委员会批准。于人工全髋关节置换术中取5 mL骨髓，与含0.01mol/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM混匀后，移入25 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2保温箱中培养，3 d后半定量换液，去除非贴壁细胞，之后每2～3天全换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态、贴壁情况，待细胞融合达70%～80%后进行传代。取第3代细胞进行实验。
1.2.2 细胞转染
第3代BMSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化后接种至6孔板，每孔5×105个细胞；分为病毒组及空病毒组。病毒组以最佳转染复数加入慢病毒（每孔2 μL）转染细胞，空病毒组以不含目的基因的空慢病毒转染。转染24 h后更换含血清培养液进行培养。
1.2.3 转染后细胞观测
①细胞生长观察：倒置相差显微镜下观察两组细胞每天生长状态；培养8 d内，每天利用细胞计数板进行细胞计数，并绘制生长曲线。以正常细胞作为对照。②RT-PCR检测：于转染培养1周后，取病毒组、空病毒组细胞及正常BMSCs（正常对照组），参照RT-PCR试剂盒说明书，检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表达。以GAPDH作为内参，以目的基因与GAPDH表达量的比值，作为目的基因相对表达量。实验重复3次。
1.3 实验分组及方法
9只食蟹猴肌肉注射安定（1 mg/kg）与氯胺酮（1 mg/kg）麻醉后，按照Hulth造模法[7]制备OA模型。于右膝髌骨正中作一纵切口，逐层切开暴露膝关节，切断前、后交叉韧带与内侧半月板，关闭切口。术后3 d内肌肉注射克林霉素（15～25 mg/kg），预防感染。术后实验动物不限制活动。
将OA模型随机分为3组，每组3只，分别为病毒组、空病毒组、空白对照组。模型制备术后6周，病毒组及空病毒组动物右膝关节腔内分别注射1.2.2获得的对应1 mL BMSCs（约1×107个），空白对照组注射1 mL生理盐水。实验动物左膝作为正常对照组。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察各组动物存活以及切口愈合、饮食等情况。
1.4.2 ELISA检测
注射后1、4、6周，抽取各组动物双膝关节液0.5 mL，参照ELISA试剂盒说明书检测PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度。
1.4.3 MRI检查
注射后6周，各组动物同上法麻醉，进行双膝关节MRI扫描，观察膝关节软骨有无异常信号。
1.4.4 大体观察
MRI检查后，放血处死各组动物，按照原手术切口入路，观察关节软骨缺损及增生情况，并与正常膝关节软骨进行比较。
1.4.5 组织学及免疫组织化学染色观察
大体观察后，取各组缺损区周围膝关节软骨以及健侧膝关节软骨，石蜡固定后切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，镜下观察软骨细胞大小及排列情况。于200倍镜下，取3个视野，参照改良Pineda评分标准[8]对关节软骨缺损修复区进行组织学评价，包括以下方面：①细胞形态：透明软骨0分，以透明软骨为主1分，以纤维软骨为主2分，以非软骨为主3分，全部非软骨4分。②基质染色：正常染色0分，轻度减弱1分，明显减弱2分，未着色3分。③表面平整：平整范围 > 3/4，0分；1/2～3/4，1分；1/4～1/2，2分；未达 < 1/4，3分。④软骨厚度：达正常厚度的2/3，0分；1/3～2/3，1分；未达1/3，2分。⑤与宿主结合：两边结合0分，一边结合1分，不结合2分。
其余切片行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，镜下观察软骨基质染色情况及分布。
1.4.6 RT-PCR检测
取各组缺损区周围膝关节软骨以及健侧膝关节软骨，同1.2.3方法检测组织COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Bonferroni法检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒转染后细胞观察
2.1.1细胞生长观察倒置相差显微镜下观察，两组细胞转染后形态无明显差异，均呈梭形（图 1）。通过细胞计数，发现转染细胞经1～2 d潜伏期后即进入对数生长期，6～8 d达平台期，各组细胞生长曲线基本平行，提示慢病毒转染对细胞生长无明显不良影响（图 2）。
图1
病毒转染后72 h两组细胞形态观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 图 2 病毒转染后各组细胞生长曲线
Figure1.
Cell morphology at 72 hours after transfection (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group Fig.2 The growth curve of BMSCs after transfection
2.1.2 RT-PCR检测
与空病毒组、正常对照组比较，病毒组COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表达明显降低，IGF-1 mRNA表达明显增加，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。空病毒组与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
表1
RT-PCR检测各组细胞COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相对表达量（n=3, x±s）
Table1.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(n=3, x±s)
2.2 动物实验观察
2.2.1 一般情况
各组动物均存活至实验完成，切口愈合、饮食情况良好。
2.2.2 ELISA检测
注射后1、4、6周，病毒组PGE2、Aggrecanase-1、IL-1浓度明显低于空病毒组、空白对照组，但IGF-1浓度明显增高，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。空病毒组与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。病毒组、空病毒组、空白对照组以上指标均显著高于正常对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
ELISA检测各组膝关节液中PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度（ng/L，x±s）
Table2.
Concentrations of PGE2, IL-1, Aggrecanase-1, and IGF-1 in each group by ELISAng/L, x±s)
2.2.3 MRI检查
正常对照组关节面未见明显异常。病毒组、空病毒组及空白对照组关节面均出现异常高密度影，其中病毒组区域最小，空病毒组可见较大异常信号区，空白对照组高密度影区面积最大。见图 3。
图3
注射后6周各组MRI检查 ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 4 注射后6周各组关节软骨大体观察 ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 5 注射后6周各组关节软骨组织学观察（HE×200） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组 图 6 注射后6周各组关节软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×200） ⓐ 病毒组 ⓑ 空病毒组 ⓒ 空白对照组 ⓓ 正常对照组
Figure3.
MRI examination at 6 weeks after injection ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.4 General observation of cartilage at 6 weeks after injection ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.5 Histological observation of cartilage at 6 weeks after injection (HE×200) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group Fig.6 Immunohistochemical observation of collagen type Ⅱ of cartilage at 6 weeks after injection (×200) ⓐ Virus group ⓑ Blank-virus group ⓒ Blank control group ⓓ Normal control group
2.2.4 大体观察
正常对照组膝关节面光滑，无明显缺损。病毒组、空病毒组及空白对照组膝关节内、外髁软骨均出现磨损，周围骨质增生，呈早期OA表现；其中病毒组软骨修复情况优于空病毒组及空白对照组，仅内髁可见一软骨缺损区，外髁基本正常；空病毒组内髁软骨缺损较大，外髁无明显缺损增生；空白对照组内髁可见较大面积软骨缺损，外髁可见骨质增生。见图 4。
2.2.5 组织学观察
镜下见，正常对照组软骨细胞分布均匀，排列整齐，层次清楚，无簇集软骨细胞，潮线完整。空白对照组和空病毒组软骨细胞排列紊乱，出现细胞分离和簇集现象；病毒组软骨细胞增生明显，与空病毒组及空白对照组相比密度较大，细胞核大，染色深。病毒组、空病毒组及空白对照组参照Mankin关节软骨病理评分标准[9]均符合早期OA表现。见图 5。
参照改良Pineda评分标准，正常对照组、病毒组、空病毒组及空白对照组评分分别为0、（3.256±0.658）、（7.435±0.875）、（12.754±0.986）分，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.2.6 免疫组织化学染色
正常对照组细胞质呈棕黄色染色，较均匀，细胞核呈蓝色；病毒组细胞质染色较空病毒组及空白对照组深，偶尔可见棕黄色颗粒，软骨细胞较多；空病毒组及空白对照组染色浅，软骨细胞较少。见图 6。
2.2.7 RT-PCR检测
与空病毒组和空白对照组相比，病毒组COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表达明显降低，IGF-1 mRNA表达明显增高，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；空病毒组与空白对照组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。病毒组、空病毒组、空白对照组以上指标均显著高于正常对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
RT-PCR检测各组软骨组织COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相对表达量（x±s）
Table3.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(x±s)
3 讨论
BMSCs作为组织工程与转基因技术种子细胞，具有多向分化能力，能在体外诱导分化为不同细胞，如成骨、软骨、脂肪、肌样细胞等[10-11]，通过组织工程技术能修复关节炎软骨损伤，在兔OA模型中干细胞分化成骨也取得成功[12]。在OA的发生发展过程中，COX-2、Aggrecanase-1、IGF-1是关键基因，目前研究较多。COX-2表达增多使PGE2的合成上升，会促进炎症发展，进一步导致关节损害[13]。Ag gre ca nase-1活性增强后会导致更多的蛋白多糖被降解，软骨进一步缺损，加重关节的器质性损害及功能障碍[13-14]。IGF-1是调节软骨细胞基质合成最重要的细胞因子，可以有效促进软骨基质合成，抑制软骨基质降解，从而维持关节软骨的正常功能[15-16]。
在基因治疗领域中，单基因或者双基因研究相对较多，但多基因研究较少，本实验同时转入3个基因，以期抑制破坏性基因的表达，增强有益性基因的表达，减少有害炎性因子的产生，增加有益细胞因子的表达，共同保护关节软骨，充分发挥基因治疗的优势。通过构建携带COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1过表达基因的慢病毒载体，然后转染BMSCs，成功地在细胞水平抑制了COX-2和Aggre canase-1基因表达，增强了IGF-1基因的表达；把基因转染后的干细胞注入食蟹猴OA模型膝关节腔后，测得关节软骨的基因表达发生了与细胞水平一致的变化，其关节液中炎性因子PGE2、IL-1含量显著降低，Aggrecanase-1含量也进一步下降，而IGF-1含量升高，与Yuan等[17]的体外研究结果相符，并且该作用可持续6周。组织学观察显示，该方法能较好地保护软骨基质，促进软骨基质和软骨细胞的生成，提示基因治疗早期OA的有效性。
基因治疗往往针对OA发病过程中的某一个环节，但病情发展是动态的，涉及的关节也多样，不同的病损区域处于不同的病理阶段，所以合理的基因治疗要以OA病理机制为前提，对病情进展中的多个环节进行多点干预，阻断或者延缓病情的发展[18-20]。本实验研究对象为灵长类动物食蟹猴，膝关节受力特点与人类相近，因此提高了实验结论的参考价值。但由于实验动物昂贵，本实验样本量相对较少，且观察时间相对较短，同时实验动物基本为早期OA表现，有关基因治疗中晚期OA的可行性及疗效有待进一步观察。