引用本文： 王晓旭, 何敏, 谭文甫, 谭光华, 杨俊涛, 洪亮. 腺病毒介导人TGF-β1基因转染自体腘绳肌腱重建兔前交叉韧带术后的表达. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1233-1237. doi: 10.7507/1002-1892.20160252 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤是常见运动损伤，由此引起膝关节生物力学改变，继发关节软骨退变和半月板损伤，从而促进创伤性关节炎的发生及进展[1-3]。关节镜下进行ACL重建是目前主要的治疗方法[4-5]。其中，自体腘绳肌腱是常用移植物，但其腱-骨愈合过程缓慢，而术后远期疗效主要取决于重建后腱-骨界面的愈合情况[6]，因此如何促进ACL重建后的腱-骨愈合是研究重点。生长因子在腱-骨愈合过程中起着重要作用[7-8]。我们的前期研究结果表明，以腺病毒载体介导人TGF-β1（human TGF-β1，hTGF-β1）基因转染腘绳肌腱后重建ACL，可促进腱-骨愈合[9]，但术后hTGF-β1基因在体内的表达情况尚不清楚。本研究拟应用Ad-hTGF-β1转染自体腘绳肌腱并重建兔ACL，采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测hTGF-β1基因在术后不同时间点的表达情况，为ACL重建的基因治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
15～20月龄雄性新西兰大白兔48只，体质量（2.0±0.4）kg，由南华大学动物实验部提供。实验动物双侧后肢膝关节均无肿胀，前抽屉试验及Lachman试验阴性。
重组腺病毒载体Ad-hTGF-β1与腺病毒空载体Ad-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）由上海和元生物公司完成病毒的构建、鉴定及滴度测定。ELISA试剂盒（长沙湘宇生物技术有限公司）；FastQuant RT kit及SuperReal PreMix Plus试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；鼠抗兔GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗抗体IgG（Bioworld公司，美国）。核酸蛋白检测仪（Eppendorf公司，德国）；凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司，美国）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；Image J图像分析软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将48只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组，每组16只。A组以Ad-hTGF-β1转染双侧腘绳肌腱并重建相对应的ACL，B组为Ad-GFP转染重建组，C组为DMEM处理组。
1.2.2 Ad-hTGF-β1及Ad-GFP体外转染腘绳肌腱
实验动物术前禁饮食12h，以10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉。于双侧胫骨结节内侧约0.5cm处作长1.0cm纵切口，在股内侧肌后方游离并切取腘绳肌腱，予以含青霉素的生理盐水反复漂洗后置于6孔板，A、B组分别加入含有Ad-hTGF-β1、Ad-GFP的DMEM培养液（滴度为5×108PFU/mL），C组加入等量DMEM培养液，将培养板置于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱内培养12h。取A、B组转染后肌腱行冰冻切片，荧光显微镜观察其绿色荧光表达；取A组转染后肌腱按照ELISA试剂盒说明，测定肌腱组织中的TGF-β1蛋白表达量。
1.2.3 ACL重建
术前准备及麻醉方法同上，从髌旁内侧入路暴露膝关节（注意避开原切口），将髌骨推至外侧，充分暴露并在上下止点处离断ACL，行Lachman试验及前抽屉试验均为阳性。将处理后的腘绳肌腱折叠成双股并予以尼龙线编织缝合，以ACL股骨侧起点及胫骨侧止点为标志，分别钻取直径1.5mm的股骨及胫骨骨隧道；将双股腘绳肌腱导入骨隧道，于股骨及胫骨骨干距隧道外口约0.5cm处各钻取一骨桥，悬吊法固定肌腱两端，行Lachman试验及前抽屉试验均为阴性后逐层缝合。术后自由放养，予以青霉素20万U肌肉注射1周预防感染。
1.2.4 大体观察
各组分别于术后2、4、6、8周随机取4只动物，采用空气栓塞法处死并取双侧膝关节进行大体观察。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
采用预冷组织研磨器，将各组重建后的腘绳肌腱加入液氮快速研磨至粉末状，按Trizol试剂盒说明提取肌腱组织总RNA，应用核酸蛋白检测仪检测少许RNA样品的260 nm及280 nm处吸光度（A）值比值（A260/A280），以确定总RNA的浓度及纯度，将剩余样品按FastQuant RT kit说明书合成cDNA第一链。引物设计与合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列（5'→3'）：hTGF-β1上游CTGTCCAACATGATCGTGCG，下游GACACAGAGATCCGCAG-TCC；GAPDH上游TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC，下游TGCCGTGGGT-GGAATCATAC。按SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书建立实时荧光定量PCR 20 μL反应体系；反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，60℃退火32 s，72℃延伸30 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.2.6 Western
blot检测 采用预冷组织研磨器，将各组重建后的腘绳肌腱加入液氮快速研磨至粉末状。将粉末移至EP管中，加入混有蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上静置30 min，4℃、离心半径3 cm、12000 r/min离心10 min，取上清即为组织总蛋白，取少量蛋白样本进行BCA法蛋白定量。将剩余样本加入蛋白上样缓冲液并进行变性，同上法离心10min后4℃保存，制备浓度为15%的SDS-PAGE凝胶。取蛋白样品20 μL上样，行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜，室温下脱脂奶粉封闭1.5h，予以鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（1∶200）及鼠抗兔GAPDH单克隆抗体（1∶5 000），4℃下孵育过夜，TBST洗膜3次，室温下加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗抗体IgG（1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次。将聚偏氟乙烯膜置入发光液中孵育1 min，使用凝胶成像分析系统进行成像，采用Image J图像分析软件测定灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察及ELISA检测
A、B组转染12 h后，荧光显微镜均可见绿色荧光表达（图 1）。A组Ad-hTGF-β1转染腘绳肌腱12h后，TGF-β1蛋白表达量为（221.0±12.2） ng/ mL，表明目的基因经腺病毒载体转染腘绳肌腱后可有效表 达。
图1
A、B组转染12 h后荧光显微镜观察（×200） ⓐ A组 ⓑ B 组
Figure1.
Fluorescence microscopy observation at 12 hours after transfected in groups A and B (×200) ⓐ Group A ⓑ Group B
2.2 大体观察
术后各时间点各组膝关节周围无红肿及发热，切口愈合良好，无感染迹象，关节腔内可见滑膜明显增生，半月板未见明显磨损或破裂，移植肌腱固定牢靠，张力良好。术后2周，可见移植肌腱与骨隧道间仍有间隙；4周，可见骨隧道内口有部分瘢痕组织填充；6周，可见骨隧道内口瘢痕组织填充较前增多；8 周，骨隧道内口可见大量瘢痕组织填充，外口有部分骨样组织生长。
2.3 实时荧光定量PCR检测
术后各时间点B、C组均未能检测到hTGF-β1 mRNA表达；术后2、4、6、8周，A组hTGF-β1 mRNA相对表达量逐渐下降，分别为1.004±0.072、0.785± 0.038、0.469±0.053、0.172±0.021，各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
2.4 Western blot检测
术后各时间点B、C组TGF-β1蛋白条带均为弱阳性，A组TGF-β1蛋白表达量均显著高于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05），B、C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A组TGF-β1蛋白表达量随时间延长逐渐降低，各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。
图2
Western blot检测各组转染后各时间点TGF-β1蛋白表达 ⓐ TGF-β1蛋白条带 1：2周 2：4周 3：6周 4：8周 ⓑ TGF-β1蛋白表达量
Figure2.
The expression of TGF-β1 protein by Western blot after transfection ⓐ TGF-β1 protein bands 1: At 2 weeks 2: At 4weeks 3: At 6 weeks 4: At 8 weeks ⓑ The expression of TGF-β1 protein
3 讨论
生长因子能够促进ACL重建后的腱-骨愈合，然而外源性生长因子的半衰期非常短（常为几分钟至几小时），局部应用的最佳浓度难以确定，关节液的灌洗及蛋白酶类的水解作用也限制了其在ACL重建中的应用[10-11]。基因工程技术能延长生长因子的表达时间，为促进ACL重建的腱-骨愈合提供了新的思路。
3.1 TGF-β1基因的选择
TGF-β1是具有多种生物学效应的多肽类物质，能调节细胞的增殖与分化，促进组织的生长与修复。TGF-β1能促进成纤维细胞的增殖，提高胶原蛋白、纤维连接蛋白的合成及细胞外基质的沉积，抑制新合成的细胞外基质降解[12-13]。Yamazaki等[14]应用犬自体屈肌腱进行ACL重建，将TGF-β1蛋白注射至骨隧道内，结果表明TGF-β1能促进骨隧道内Sharpy纤维及新骨的生成，提高移植肌腱的抗拉力负荷。还有研究将携带TGF-β1基因的质粒与脂质体的混合物注射至ACL重建的骨隧道内，其能促进成纤维细胞的增殖与胶原的合成，加速腱-骨界面组织结构的成熟，提高移植腱的力学性能[15]。因此，TGF-β1是能有效促进ACL重建术后腱-骨愈合的生长因子，TGF-β1基因可作为基因治疗的目的基因。
3.2 腺病毒载体的选择
腺病毒的病毒粒子相对稳定，故载体易于制备及纯化，从而获得较高的滴度及纯度；腺病毒载体的基因容量较大且感染范围广，分裂期及静止期的细胞均能被其感染；此外，目的基因不会被整合入宿主基因组，故不会有插入突变和导致恶性肿瘤的风险。因此，腺病毒是目前基因治疗中应用最为广泛的病毒载体[16-17]。其在ACL重建领域的应用也有相关报道，有研究以腺病毒为载体将TGF-β1及VEGF165基因转染至BMSCs并应用于ACL重建，证实其对腱-骨愈合有促进作用[18]。但腺病毒载体仍有一些缺陷，如存在一定的免疫原性，会引起机体的免疫应答，目的基因表达的持续时间相对较短等。随着对腺病毒载体相关研究的逐步深入，其不足得到了一定改进。
3.3 基因转移的方式
目的基因转移的方式包括体内基因转移与体外基因转移。其中，体外基因转移具有更高的准确性、目的性和安全性。有研究将携带BMP-2基因的重组腺病毒载体（Ad-BMP-2）体外转染兔的半腱肌并重建ACL，结果表明Ad-BMP-2能成功转染半腱肌并能促进腱-骨愈合[19]。该实验方法完成了基因的体外转移，其实验步骤较为精简，实验技术要求较低。本研究也采取体外基因转移法，将自体腘绳肌腱置于含有Ad-hTGF-β1及Ad-GFP的培养基中进行培养，从而完成hTGF-β1基因的体外转移。培养12h后荧光显微镜观察示两组均可见绿色荧光表达且无明显差异，表明Ad-hTGF-β1及Ad-GFP在体外条件下均可成功转染腘绳肌腱，其转染效果无明显差异。ELISA检测示A组腘绳肌腱组织中有较高含量的TGF-β1蛋白，表明目的基因在转染后能进行有效表达。
3.4 术后hTGF-β1基因的表达
由于腺病毒载体不会将目的基因整合至宿主的染色体，且腺病毒载体具有一定免疫原性从而在体内引起免疫应答，使得目的基因在体内表达的时间相对较短。然而，有研究将重组腺病毒载体直接注射至兔的髌腱，其表达时间可持续6周以上，这可能是因为肌腱组织血运较少，从而具有较低的免疫反应性[20]。ACL重建的骨隧道较为封闭，局部血运相对较差，使得局部免疫应答相对较弱，从而有利于目的基因在腱-骨界面的表达。本研究对术后各时间点hTGF-β1基因表达产物的检测显示，重组腺病毒载体组中的hTGF-β1基因表达产物可持续至术后第8周。这表明Ad-hTGF-β1能在体外条件下成功转染腘绳肌腱，其在ACL重建术后能有效表达较长时间，为促进腱-骨愈合的基因治疗提供了实验依据。此外，本实验结果还显示hTGF-β1基因的表达随时间推移逐渐减少，表明其在腱-骨界面的表达和作用是暂时的，不会引起胶原纤维、细胞外基质及骨质等过度增生。Western blot检测示，各时间点B、C组TGF-β1蛋白条带均为弱阳性，这可能是由于肌腱组织本身具有少量TGF-β1，而不同种属来源的TGF-β1具有高度同源性。
综上述，本研究初步表明，在腺病毒载体介导下，hTGF-β1基因能成功转染至腘绳肌腱并能在ACL重建术后有效表达。但本实验也存在一些缺陷和问题，如重组腺病毒载体与腺病毒空载体均能在体外成功转染腘绳肌腱，但未对其转染效率进行有效的定量分析；本实验对hTGF-β1的检测只持续至术后8周，其更长时间的表达情况及表达终止时间尚不清楚；目的基因的表达受多种因素调控，其表达产物发挥生物学效应也受多种因素的影响，这些具体机制需要进一步研究。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤是常见运动损伤，由此引起膝关节生物力学改变，继发关节软骨退变和半月板损伤，从而促进创伤性关节炎的发生及进展[1-3]。关节镜下进行ACL重建是目前主要的治疗方法[4-5]。其中，自体腘绳肌腱是常用移植物，但其腱-骨愈合过程缓慢，而术后远期疗效主要取决于重建后腱-骨界面的愈合情况[6]，因此如何促进ACL重建后的腱-骨愈合是研究重点。生长因子在腱-骨愈合过程中起着重要作用[7-8]。我们的前期研究结果表明，以腺病毒载体介导人TGF-β1（human TGF-β1，hTGF-β1）基因转染腘绳肌腱后重建ACL，可促进腱-骨愈合[9]，但术后hTGF-β1基因在体内的表达情况尚不清楚。本研究拟应用Ad-hTGF-β1转染自体腘绳肌腱并重建兔ACL，采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测hTGF-β1基因在术后不同时间点的表达情况，为ACL重建的基因治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
15～20月龄雄性新西兰大白兔48只，体质量（2.0±0.4）kg，由南华大学动物实验部提供。实验动物双侧后肢膝关节均无肿胀，前抽屉试验及Lachman试验阴性。
重组腺病毒载体Ad-hTGF-β1与腺病毒空载体Ad-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）由上海和元生物公司完成病毒的构建、鉴定及滴度测定。ELISA试剂盒（长沙湘宇生物技术有限公司）；FastQuant RT kit及SuperReal PreMix Plus试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；鼠抗兔GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗抗体IgG（Bioworld公司，美国）。核酸蛋白检测仪（Eppendorf公司，德国）；凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司，美国）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；Image J图像分析软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将48只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组，每组16只。A组以Ad-hTGF-β1转染双侧腘绳肌腱并重建相对应的ACL，B组为Ad-GFP转染重建组，C组为DMEM处理组。
1.2.2 Ad-hTGF-β1及Ad-GFP体外转染腘绳肌腱
实验动物术前禁饮食12h，以10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉。于双侧胫骨结节内侧约0.5cm处作长1.0cm纵切口，在股内侧肌后方游离并切取腘绳肌腱，予以含青霉素的生理盐水反复漂洗后置于6孔板，A、B组分别加入含有Ad-hTGF-β1、Ad-GFP的DMEM培养液（滴度为5×108PFU/mL），C组加入等量DMEM培养液，将培养板置于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱内培养12h。取A、B组转染后肌腱行冰冻切片，荧光显微镜观察其绿色荧光表达；取A组转染后肌腱按照ELISA试剂盒说明，测定肌腱组织中的TGF-β1蛋白表达量。
1.2.3 ACL重建
术前准备及麻醉方法同上，从髌旁内侧入路暴露膝关节（注意避开原切口），将髌骨推至外侧，充分暴露并在上下止点处离断ACL，行Lachman试验及前抽屉试验均为阳性。将处理后的腘绳肌腱折叠成双股并予以尼龙线编织缝合，以ACL股骨侧起点及胫骨侧止点为标志，分别钻取直径1.5mm的股骨及胫骨骨隧道；将双股腘绳肌腱导入骨隧道，于股骨及胫骨骨干距隧道外口约0.5cm处各钻取一骨桥，悬吊法固定肌腱两端，行Lachman试验及前抽屉试验均为阴性后逐层缝合。术后自由放养，予以青霉素20万U肌肉注射1周预防感染。
1.2.4 大体观察
各组分别于术后2、4、6、8周随机取4只动物，采用空气栓塞法处死并取双侧膝关节进行大体观察。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
采用预冷组织研磨器，将各组重建后的腘绳肌腱加入液氮快速研磨至粉末状，按Trizol试剂盒说明提取肌腱组织总RNA，应用核酸蛋白检测仪检测少许RNA样品的260 nm及280 nm处吸光度（A）值比值（A260/A280），以确定总RNA的浓度及纯度，将剩余样品按FastQuant RT kit说明书合成cDNA第一链。引物设计与合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列（5'→3'）：hTGF-β1上游CTGTCCAACATGATCGTGCG，下游GACACAGAGATCCGCAG-TCC；GAPDH上游TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC，下游TGCCGTGGGT-GGAATCATAC。按SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书建立实时荧光定量PCR 20 μL反应体系；反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，60℃退火32 s，72℃延伸30 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.2.6 Western
blot检测 采用预冷组织研磨器，将各组重建后的腘绳肌腱加入液氮快速研磨至粉末状。将粉末移至EP管中，加入混有蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上静置30 min，4℃、离心半径3 cm、12000 r/min离心10 min，取上清即为组织总蛋白，取少量蛋白样本进行BCA法蛋白定量。将剩余样本加入蛋白上样缓冲液并进行变性，同上法离心10min后4℃保存，制备浓度为15%的SDS-PAGE凝胶。取蛋白样品20 μL上样，行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜，室温下脱脂奶粉封闭1.5h，予以鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（1∶200）及鼠抗兔GAPDH单克隆抗体（1∶5 000），4℃下孵育过夜，TBST洗膜3次，室温下加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗抗体IgG（1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次。将聚偏氟乙烯膜置入发光液中孵育1 min，使用凝胶成像分析系统进行成像，采用Image J图像分析软件测定灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察及ELISA检测
A、B组转染12 h后，荧光显微镜均可见绿色荧光表达（图 1）。A组Ad-hTGF-β1转染腘绳肌腱12h后，TGF-β1蛋白表达量为（221.0±12.2） ng/ mL，表明目的基因经腺病毒载体转染腘绳肌腱后可有效表 达。
图1
A、B组转染12 h后荧光显微镜观察（×200） ⓐ A组 ⓑ B 组
Figure1.
Fluorescence microscopy observation at 12 hours after transfected in groups A and B (×200) ⓐ Group A ⓑ Group B
2.2 大体观察
术后各时间点各组膝关节周围无红肿及发热，切口愈合良好，无感染迹象，关节腔内可见滑膜明显增生，半月板未见明显磨损或破裂，移植肌腱固定牢靠，张力良好。术后2周，可见移植肌腱与骨隧道间仍有间隙；4周，可见骨隧道内口有部分瘢痕组织填充；6周，可见骨隧道内口瘢痕组织填充较前增多；8 周，骨隧道内口可见大量瘢痕组织填充，外口有部分骨样组织生长。
2.3 实时荧光定量PCR检测
术后各时间点B、C组均未能检测到hTGF-β1 mRNA表达；术后2、4、6、8周，A组hTGF-β1 mRNA相对表达量逐渐下降，分别为1.004±0.072、0.785± 0.038、0.469±0.053、0.172±0.021，各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。
2.4 Western blot检测
术后各时间点B、C组TGF-β1蛋白条带均为弱阳性，A组TGF-β1蛋白表达量均显著高于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05），B、C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A组TGF-β1蛋白表达量随时间延长逐渐降低，各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。
图2
Western blot检测各组转染后各时间点TGF-β1蛋白表达 ⓐ TGF-β1蛋白条带 1：2周 2：4周 3：6周 4：8周 ⓑ TGF-β1蛋白表达量
Figure2.
The expression of TGF-β1 protein by Western blot after transfection ⓐ TGF-β1 protein bands 1: At 2 weeks 2: At 4weeks 3: At 6 weeks 4: At 8 weeks ⓑ The expression of TGF-β1 protein
3 讨论
生长因子能够促进ACL重建后的腱-骨愈合，然而外源性生长因子的半衰期非常短（常为几分钟至几小时），局部应用的最佳浓度难以确定，关节液的灌洗及蛋白酶类的水解作用也限制了其在ACL重建中的应用[10-11]。基因工程技术能延长生长因子的表达时间，为促进ACL重建的腱-骨愈合提供了新的思路。
3.1 TGF-β1基因的选择
TGF-β1是具有多种生物学效应的多肽类物质，能调节细胞的增殖与分化，促进组织的生长与修复。TGF-β1能促进成纤维细胞的增殖，提高胶原蛋白、纤维连接蛋白的合成及细胞外基质的沉积，抑制新合成的细胞外基质降解[12-13]。Yamazaki等[14]应用犬自体屈肌腱进行ACL重建，将TGF-β1蛋白注射至骨隧道内，结果表明TGF-β1能促进骨隧道内Sharpy纤维及新骨的生成，提高移植肌腱的抗拉力负荷。还有研究将携带TGF-β1基因的质粒与脂质体的混合物注射至ACL重建的骨隧道内，其能促进成纤维细胞的增殖与胶原的合成，加速腱-骨界面组织结构的成熟，提高移植腱的力学性能[15]。因此，TGF-β1是能有效促进ACL重建术后腱-骨愈合的生长因子，TGF-β1基因可作为基因治疗的目的基因。
3.2 腺病毒载体的选择
腺病毒的病毒粒子相对稳定，故载体易于制备及纯化，从而获得较高的滴度及纯度；腺病毒载体的基因容量较大且感染范围广，分裂期及静止期的细胞均能被其感染；此外，目的基因不会被整合入宿主基因组，故不会有插入突变和导致恶性肿瘤的风险。因此，腺病毒是目前基因治疗中应用最为广泛的病毒载体[16-17]。其在ACL重建领域的应用也有相关报道，有研究以腺病毒为载体将TGF-β1及VEGF165基因转染至BMSCs并应用于ACL重建，证实其对腱-骨愈合有促进作用[18]。但腺病毒载体仍有一些缺陷，如存在一定的免疫原性，会引起机体的免疫应答，目的基因表达的持续时间相对较短等。随着对腺病毒载体相关研究的逐步深入，其不足得到了一定改进。
3.3 基因转移的方式
目的基因转移的方式包括体内基因转移与体外基因转移。其中，体外基因转移具有更高的准确性、目的性和安全性。有研究将携带BMP-2基因的重组腺病毒载体（Ad-BMP-2）体外转染兔的半腱肌并重建ACL，结果表明Ad-BMP-2能成功转染半腱肌并能促进腱-骨愈合[19]。该实验方法完成了基因的体外转移，其实验步骤较为精简，实验技术要求较低。本研究也采取体外基因转移法，将自体腘绳肌腱置于含有Ad-hTGF-β1及Ad-GFP的培养基中进行培养，从而完成hTGF-β1基因的体外转移。培养12h后荧光显微镜观察示两组均可见绿色荧光表达且无明显差异，表明Ad-hTGF-β1及Ad-GFP在体外条件下均可成功转染腘绳肌腱，其转染效果无明显差异。ELISA检测示A组腘绳肌腱组织中有较高含量的TGF-β1蛋白，表明目的基因在转染后能进行有效表达。
3.4 术后hTGF-β1基因的表达
由于腺病毒载体不会将目的基因整合至宿主的染色体，且腺病毒载体具有一定免疫原性从而在体内引起免疫应答，使得目的基因在体内表达的时间相对较短。然而，有研究将重组腺病毒载体直接注射至兔的髌腱，其表达时间可持续6周以上，这可能是因为肌腱组织血运较少，从而具有较低的免疫反应性[20]。ACL重建的骨隧道较为封闭，局部血运相对较差，使得局部免疫应答相对较弱，从而有利于目的基因在腱-骨界面的表达。本研究对术后各时间点hTGF-β1基因表达产物的检测显示，重组腺病毒载体组中的hTGF-β1基因表达产物可持续至术后第8周。这表明Ad-hTGF-β1能在体外条件下成功转染腘绳肌腱，其在ACL重建术后能有效表达较长时间，为促进腱-骨愈合的基因治疗提供了实验依据。此外，本实验结果还显示hTGF-β1基因的表达随时间推移逐渐减少，表明其在腱-骨界面的表达和作用是暂时的，不会引起胶原纤维、细胞外基质及骨质等过度增生。Western blot检测示，各时间点B、C组TGF-β1蛋白条带均为弱阳性，这可能是由于肌腱组织本身具有少量TGF-β1，而不同种属来源的TGF-β1具有高度同源性。
综上述，本研究初步表明，在腺病毒载体介导下，hTGF-β1基因能成功转染至腘绳肌腱并能在ACL重建术后有效表达。但本实验也存在一些缺陷和问题，如重组腺病毒载体与腺病毒空载体均能在体外成功转染腘绳肌腱，但未对其转染效率进行有效的定量分析；本实验对hTGF-β1的检测只持续至术后8周，其更长时间的表达情况及表达终止时间尚不清楚；目的基因的表达受多种因素调控，其表达产物发挥生物学效应也受多种因素的影响，这些具体机制需要进一步研究。
