引用本文： 方清清, 李志忠, 周建, 闫娟丽, 石文贵, 谢艳芳, 陈克明. 信号分子p38参与低频脉冲电磁场促进成骨细胞矿化成熟的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1238-1243. doi: 10.7507/1002-1892.20160253 复制
骨重建过程是一个动态平衡过程，成骨细胞负责骨形成，而破骨细胞负责骨吸收[1-2]，通过持续不断的重塑维持骨骼结构与功能的稳定性[3]。骨动态平衡一旦遭到破环就会引起一系列疾病。骨质疏松症就是一种常见的骨代谢疾病，多见于老年人，由于患者骨微结构发生改变，骨脆性增加，极易发生骨折，给患者及家人造成了极大的经济负担[4]。低频电磁场作为一种物理疗法，近年来引起了人们的广泛关注。研究表明[5-7]，低频脉冲电磁场可以调节BMSCs的成骨性分化，预防骨量丢失，促进肩袖损伤大鼠模型的腱-骨愈合。然而其作用机制至今仍不十分明确。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）作为普遍存在于哺乳动物细胞中的一条高度保守的信号通路，在调控细胞增殖、分化及对外界环境的应激反应过程中起着重要作用[8-9]。经典的MAPKs家族包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino N-terminal kinases，JNK）以及p38激酶。MAPKs的酪氨酸残基和/或苏氨酸残基被上游激酶磷酸化而活化，活化的MAPKs再通过磷酸化底物的酪氨酸残基和/或苏氨酸残基调节细胞的信号级联反应[10]。研究表明ERK和JNK信号通路参与淫羊藿苷诱导的成骨细胞矿化成熟[11]，p38信号通路对于小鼠的骨骼发育和骨代谢平衡至关重要[12]。本课题组前期研究发现，50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场可显著促进大鼠颅骨成骨细胞的矿化成熟[13]，那么其在促进骨形成的过程中是否激活了MAPKs信号通路尚不可知。我们进一步对此进行了研究，以期更深入了解低频脉冲电磁场促进骨形成的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
出生48 h内的SPF级Wistar大鼠6只，雌雄不限，由甘肃省中医学院动物实验中心提供。
FBS（兰州民海生物工程有限公司）；α-MEM培养液、Ⅱ型胶原酶（GIBCO公司，美国）；胰蛋白酶（西安科昊生物工程有限责任公司）；PIRA蛋白裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL Plus超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司）；p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、p-JNK1/2抗体、JNK1/2抗体、p-p38抗体、p38抗体（Abcam公司，美国）；辣根过氧化物酶标记二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMSO、p-p38抑制剂SB202190、地塞米松、β-甘油磷酸钠、磷酸化的维生素C、α-萘基磷酸钠、茜素红、固蓝B盐（Sigma公司，美国）。
立式电热压力灭菌器（上海申安医疗器械有限公司）；恒温水浴箱（北京长风仪器仪表公司）；CO2培养箱（Thermo Revco公司，美国）；医用净化工作台（吴江市通达空调净化设备厂）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；调速平板振荡器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；全波长酶标仪（Epoch Biotek公司，美国）；台式高速冷冻离心机（Kendro公司，美国）；水平摇床（沃德生物医学仪器公司）；电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；细胞培养皿（Coring Costar公司，美国）；移液枪（Eppendorf公司，德国）。
1.2 低频电磁场细胞处理仪
本实验所用低频电磁场细胞处理仪由本课题组自行研制，整套装置包括电脑控制系统、数模转化系统、信号放大装置、线圈、磁场传感器和温度传感器等，可产生频率5～200 Hz、强度0～9.0 mT的不同类型均匀磁场，保证60 mm培养皿内所有细胞受到相同磁场处理。实验过程中，数模转化系统将电脑控制系统产生的数字信号转化为模拟信号，再经信号放大装置放大后由线圈产生电磁场。其中线圈长27 cm、内径10 cm，经严格消毒后置于37℃恒温培养箱中，通过导线与其他装置连接；磁场传感器和温度传感器实时监测线圈内部区域磁场强度及温度的变化，以确保实验的可控性。
1.3 大鼠颅骨成骨细胞的分离培养
取6只Wistar大鼠采用脱臼法处死后，75%乙醇浸泡消毒；取出颅骨，剔除血管及结缔组织，PBS漂洗后剪成约2 mm2大小的骨碎片，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min；弃消化液，换用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃消化10 min；弃消化液，用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃消化3次，每次20 min；收集消化液，使用含10%FBS的α-MEM培养液终止消化反应，200目细胞筛过滤，除去残余骨碎片，以离心半径15.7 cm、1000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀经反复吹打重悬后，以3×104个/mL浓度接种于90 mm培养皿，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至90%以上融合时消化传代用于实验。
1.4 观测指标
1.4.1 Western
blot检测 取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于60 mm培养皿中，待生长至完全融合时分为7组，分别置于低频电磁场细胞处理仪中，经50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场连续处理0、5、10、20、40、60、120 min后立即取出，弃培养液，用4℃预冷的PBS清洗3次；吸尽残余PBS，加入300 μL含1%PMSF的PIRA蛋白裂解液，于冰上静置10 min裂解细胞；收集细胞裂解液，4℃以离心半径8.7 cm、12 000 r/min离心30 min；收集上清，取20 μL使用BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度，剩余上清加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水浴10min；取20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后电转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗（p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、p- JNK1/2抗体、JNK1/2抗体、p-p38抗体、p38抗体）4℃孵育过夜，TBST清洗5次，每次8 min；加入二抗室温孵育2 h，TBST清洗5次，每次8 min；ECL Plus超敏发光液暗室发光显影，结果条带使用ipp软件扫描量 化。
1.4.2 ALP活性测定
取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于30 mm培养皿中，待生长至完全融合时随机分为对照组（A组）、低频脉冲电磁场处理组（B组）、SB202190组（C组）、SB202190+低频脉冲电磁场处理组（D组）。A组不作任何处理；B组使用50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h；C组仅加入1×10-8 μmol/L SB202190；D组加入1×10-8 μmol/L SB202190，同时采用50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h。连续处理1、4、7 d后弃培养液，用4℃预冷的PBS清洗3次；吸尽残余PBS，按照ALP试剂盒说明书检测细胞ALP活性。
1.4.3 ALP组织化学染色观察
取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于30 mm培养皿中，待生长至90%以上融合时换用成骨诱导培养液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、1×10-8 mol/L地塞米松、1×10-4 mol/L磷酸化的维生素C的α-MEM培养液）培养，同时按照1.4.2方法分组并进行相应处理9 d，然后弃培养液，用37℃预热的PBS清洗3 次，4%甲醛固定10 s；弃甲醛，37℃预热的PBS清洗3次，加入一定量新鲜配制的ALP染色液，37℃避光水浴孵育，至培养皿上ALP阳性染色斑点不再增多时弃染色液，PBS清洗3次，室温晾干，拍照记录实验结果，图片使用ipp软件扫描量化，检测ALP阳性克隆数及阳性克隆面积。
1.4.4 茜素红染色观察
取原代大鼠颅骨成骨细胞，培养及处理方法同1.4.3。细胞经连续处理12d后弃培养液，4℃预冷的PBS清洗3次，吸尽残余PBS，4%甲醛室温固定10 min；弃甲醛，PBS清洗3 次，加入1%茜素红染色液37℃水浴1 h；弃染色液，PBS清洗3次，照相记录实验结果，图片使用ipp软件扫描量化，检测钙结节数量及面积。
1.5 统计学处理
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Western blot检测
处理各时间点p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达量无显著变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。而p-p38蛋白表达量则在处理5 min后开始升高，至40 min时达峰值，之后开始逐步下降，但各时间点均显著高于0min时，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。
图1
低频脉冲电磁场处理不同时间后MAPKs磷酸化水平的变化 ⓐ 电泳 2.2 ALP活性测定
处理1、4、7 d，B组ALP活性显著高于A、C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A、C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。
2.3 ALP染色观察
A、B、C、D组ALP阳性克隆数分别为（968±22）、（1 280±21）、（945±19）、（1 086±24）个，ALP阳性克隆面积分别为（1.452 6±0.114 6）、（2.115 6±0.096 4）、（1.4200±0.087 6）、（1.579 8±0.115 6） cm2，B组均显著多于A、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；此外，D组ALP阳性克隆数显著高于A组（P＜0.01）。见图 3。
图3
各组处理9 d时ALP组织化学染色观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.4 茜素红染色观察
A、B、C、D组钙结节数量分别为（1 779±76）、（2529±120）、（1 827±42）、（2 067±46）个，钙结节面积分别为（0.656 1±0.060 6）、（0.953 8±0.034 4）、（0.6625± 0.039 8）、（0.745 9±0.052 3） cm2，B组均显著多于A、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；此外，D组钙结节数量显著多于A组（P＜0.01）。见图 4。
3 讨论
作为细胞信号转导过程中的重要分子，经典MAPKs的磷酸化水平受到严格调控，细胞外信号分子通过与受体相互作用而激活受体，活化的受体结合鸟苷酸释放因子和GTP酶活化蛋白而调节Ras的活性，使GTP与GDP之间发生交换，从而启动级联反应，激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases，MAPKKKs），活化的MAPKKKs结合并磷酸化MAPKKs（mitogen-activated protein kinase kinases）的丝氨酸/苏氨酸残基，使其活化，进而磷酸化MAPKs的丝氨酸/苏氨酸残基，激活一系列底物，从而引起相应的生物效应[14]。研究表明其在骨重建过程中发挥重要作用：ERK和p38 MAPK信号通路在人参属三七皂苷促进BMSCs成骨分化的过程中扮演重要角色[15]；雌激素介导的MEK-ERK信号通路参与接骨木提取物香草酸促进骨形成的过程[16]；p-JNK参与BMP诱导的成骨细胞骨钙素的分泌[17]。
低频电磁场在骨骼肌肉系统疾病方面的治疗效果已得到了广泛认可[18-20]，研究者们对其作用机制也进行了探讨，文献报道低频电磁场可通过Ca2+/钙调蛋白、NO-cGMP-PKG、Wnt/Lrp5/β-catenin等信号通路参与促进骨形成[21-23]。然而MAPKs信号通路与低频电磁场促进骨形成之间的关系却鲜有报道，对此本研究通过检测50 Hz、0.6 mT低频脉冲 电 磁场处理后MAPKs磷酸化水平的变化及其与大鼠 颅骨成骨细胞矿化成熟之间的关系发现，p38参与50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进骨形成的过 程。
通过采用Western blot检测低频脉冲电磁场处理不同时间后MAPKs磷酸化水平的变化发现，p- ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白表达量无明显变化，而p-p38的蛋白表达量却发生显著变化，说明50 Hz、0.6mT低频脉冲电磁场激活了信号分子p38；而使用抑制剂SB202190抑制p-p38的活性后，由低频脉冲电磁场所引起的ALP活性升高、ALP染色阳性克隆及钙化结节数量和面积的增加被削弱，说明信号分子p38参与了50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进大鼠颅骨成骨细胞矿化成熟的过程。
然而，在实验过程中我们发现，使用SB202190抑制p-p38活性后，由低频脉冲电磁场所引起的ALP染色阳性克隆及钙化结节阳性克隆并未完全回归对照组水平（D组仍显著高于A组），提示我们在50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进骨形成的过程中，尚有其他信号通路参与其中，这也与文献报道结果相吻合。此外，在经典的信号分子p-p38的激活过程中，MAPKKKs中的MEKK1-3、MLK2/3、ASK1、Tpl2、TAK1和TAO1/2等，MAPKKs中的MEK3和MEK6参与其中，逐级激活[10]。那么50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场是通过经典的信号转导方式激活p-p38，还是通过其他信号通路激活p-p38，仍有待研究，以明确在细胞这个非线性的系统中，各个信号通路之间的相互联系、协调作用以及低频电磁场促进骨形成的具体机制。
骨重建过程是一个动态平衡过程，成骨细胞负责骨形成，而破骨细胞负责骨吸收[1-2]，通过持续不断的重塑维持骨骼结构与功能的稳定性[3]。骨动态平衡一旦遭到破环就会引起一系列疾病。骨质疏松症就是一种常见的骨代谢疾病，多见于老年人，由于患者骨微结构发生改变，骨脆性增加，极易发生骨折，给患者及家人造成了极大的经济负担[4]。低频电磁场作为一种物理疗法，近年来引起了人们的广泛关注。研究表明[5-7]，低频脉冲电磁场可以调节BMSCs的成骨性分化，预防骨量丢失，促进肩袖损伤大鼠模型的腱-骨愈合。然而其作用机制至今仍不十分明确。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）作为普遍存在于哺乳动物细胞中的一条高度保守的信号通路，在调控细胞增殖、分化及对外界环境的应激反应过程中起着重要作用[8-9]。经典的MAPKs家族包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino N-terminal kinases，JNK）以及p38激酶。MAPKs的酪氨酸残基和/或苏氨酸残基被上游激酶磷酸化而活化，活化的MAPKs再通过磷酸化底物的酪氨酸残基和/或苏氨酸残基调节细胞的信号级联反应[10]。研究表明ERK和JNK信号通路参与淫羊藿苷诱导的成骨细胞矿化成熟[11]，p38信号通路对于小鼠的骨骼发育和骨代谢平衡至关重要[12]。本课题组前期研究发现，50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场可显著促进大鼠颅骨成骨细胞的矿化成熟[13]，那么其在促进骨形成的过程中是否激活了MAPKs信号通路尚不可知。我们进一步对此进行了研究，以期更深入了解低频脉冲电磁场促进骨形成的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
出生48 h内的SPF级Wistar大鼠6只，雌雄不限，由甘肃省中医学院动物实验中心提供。
FBS（兰州民海生物工程有限公司）；α-MEM培养液、Ⅱ型胶原酶（GIBCO公司，美国）；胰蛋白酶（西安科昊生物工程有限责任公司）；PIRA蛋白裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL Plus超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司）；p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、p-JNK1/2抗体、JNK1/2抗体、p-p38抗体、p38抗体（Abcam公司，美国）；辣根过氧化物酶标记二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMSO、p-p38抑制剂SB202190、地塞米松、β-甘油磷酸钠、磷酸化的维生素C、α-萘基磷酸钠、茜素红、固蓝B盐（Sigma公司，美国）。
立式电热压力灭菌器（上海申安医疗器械有限公司）；恒温水浴箱（北京长风仪器仪表公司）；CO2培养箱（Thermo Revco公司，美国）；医用净化工作台（吴江市通达空调净化设备厂）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；调速平板振荡器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；全波长酶标仪（Epoch Biotek公司，美国）；台式高速冷冻离心机（Kendro公司，美国）；水平摇床（沃德生物医学仪器公司）；电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；细胞培养皿（Coring Costar公司，美国）；移液枪（Eppendorf公司，德国）。
1.2 低频电磁场细胞处理仪
本实验所用低频电磁场细胞处理仪由本课题组自行研制，整套装置包括电脑控制系统、数模转化系统、信号放大装置、线圈、磁场传感器和温度传感器等，可产生频率5～200 Hz、强度0～9.0 mT的不同类型均匀磁场，保证60 mm培养皿内所有细胞受到相同磁场处理。实验过程中，数模转化系统将电脑控制系统产生的数字信号转化为模拟信号，再经信号放大装置放大后由线圈产生电磁场。其中线圈长27 cm、内径10 cm，经严格消毒后置于37℃恒温培养箱中，通过导线与其他装置连接；磁场传感器和温度传感器实时监测线圈内部区域磁场强度及温度的变化，以确保实验的可控性。
1.3 大鼠颅骨成骨细胞的分离培养
取6只Wistar大鼠采用脱臼法处死后，75%乙醇浸泡消毒；取出颅骨，剔除血管及结缔组织，PBS漂洗后剪成约2 mm2大小的骨碎片，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min；弃消化液，换用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃消化10 min；弃消化液，用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃消化3次，每次20 min；收集消化液，使用含10%FBS的α-MEM培养液终止消化反应，200目细胞筛过滤，除去残余骨碎片，以离心半径15.7 cm、1000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀经反复吹打重悬后，以3×104个/mL浓度接种于90 mm培养皿，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至90%以上融合时消化传代用于实验。
1.4 观测指标
1.4.1 Western
blot检测 取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于60 mm培养皿中，待生长至完全融合时分为7组，分别置于低频电磁场细胞处理仪中，经50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场连续处理0、5、10、20、40、60、120 min后立即取出，弃培养液，用4℃预冷的PBS清洗3次；吸尽残余PBS，加入300 μL含1%PMSF的PIRA蛋白裂解液，于冰上静置10 min裂解细胞；收集细胞裂解液，4℃以离心半径8.7 cm、12 000 r/min离心30 min；收集上清，取20 μL使用BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度，剩余上清加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水浴10min；取20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后电转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗（p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、p- JNK1/2抗体、JNK1/2抗体、p-p38抗体、p38抗体）4℃孵育过夜，TBST清洗5次，每次8 min；加入二抗室温孵育2 h，TBST清洗5次，每次8 min；ECL Plus超敏发光液暗室发光显影，结果条带使用ipp软件扫描量 化。
1.4.2 ALP活性测定
取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于30 mm培养皿中，待生长至完全融合时随机分为对照组（A组）、低频脉冲电磁场处理组（B组）、SB202190组（C组）、SB202190+低频脉冲电磁场处理组（D组）。A组不作任何处理；B组使用50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h；C组仅加入1×10-8 μmol/L SB202190；D组加入1×10-8 μmol/L SB202190，同时采用50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h。连续处理1、4、7 d后弃培养液，用4℃预冷的PBS清洗3次；吸尽残余PBS，按照ALP试剂盒说明书检测细胞ALP活性。
1.4.3 ALP组织化学染色观察
取原代大鼠颅骨成骨细胞，以3×104个/mL浓度接种于30 mm培养皿中，待生长至90%以上融合时换用成骨诱导培养液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、1×10-8 mol/L地塞米松、1×10-4 mol/L磷酸化的维生素C的α-MEM培养液）培养，同时按照1.4.2方法分组并进行相应处理9 d，然后弃培养液，用37℃预热的PBS清洗3 次，4%甲醛固定10 s；弃甲醛，37℃预热的PBS清洗3次，加入一定量新鲜配制的ALP染色液，37℃避光水浴孵育，至培养皿上ALP阳性染色斑点不再增多时弃染色液，PBS清洗3次，室温晾干，拍照记录实验结果，图片使用ipp软件扫描量化，检测ALP阳性克隆数及阳性克隆面积。
1.4.4 茜素红染色观察
取原代大鼠颅骨成骨细胞，培养及处理方法同1.4.3。细胞经连续处理12d后弃培养液，4℃预冷的PBS清洗3次，吸尽残余PBS，4%甲醛室温固定10 min；弃甲醛，PBS清洗3 次，加入1%茜素红染色液37℃水浴1 h；弃染色液，PBS清洗3次，照相记录实验结果，图片使用ipp软件扫描量化，检测钙结节数量及面积。
1.5 统计学处理
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Western blot检测
处理各时间点p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达量无显著变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。而p-p38蛋白表达量则在处理5 min后开始升高，至40 min时达峰值，之后开始逐步下降，但各时间点均显著高于0min时，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。
图1
低频脉冲电磁场处理不同时间后MAPKs磷酸化水平的变化 ⓐ 电泳 2.2 ALP活性测定
处理1、4、7 d，B组ALP活性显著高于A、C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A、C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。
2.3 ALP染色观察
A、B、C、D组ALP阳性克隆数分别为（968±22）、（1 280±21）、（945±19）、（1 086±24）个，ALP阳性克隆面积分别为（1.452 6±0.114 6）、（2.115 6±0.096 4）、（1.4200±0.087 6）、（1.579 8±0.115 6） cm2，B组均显著多于A、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；此外，D组ALP阳性克隆数显著高于A组（P＜0.01）。见图 3。
图3
各组处理9 d时ALP组织化学染色观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.4 茜素红染色观察
A、B、C、D组钙结节数量分别为（1 779±76）、（2529±120）、（1 827±42）、（2 067±46）个，钙结节面积分别为（0.656 1±0.060 6）、（0.953 8±0.034 4）、（0.6625± 0.039 8）、（0.745 9±0.052 3） cm2，B组均显著多于A、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；此外，D组钙结节数量显著多于A组（P＜0.01）。见图 4。
3 讨论
作为细胞信号转导过程中的重要分子，经典MAPKs的磷酸化水平受到严格调控，细胞外信号分子通过与受体相互作用而激活受体，活化的受体结合鸟苷酸释放因子和GTP酶活化蛋白而调节Ras的活性，使GTP与GDP之间发生交换，从而启动级联反应，激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases，MAPKKKs），活化的MAPKKKs结合并磷酸化MAPKKs（mitogen-activated protein kinase kinases）的丝氨酸/苏氨酸残基，使其活化，进而磷酸化MAPKs的丝氨酸/苏氨酸残基，激活一系列底物，从而引起相应的生物效应[14]。研究表明其在骨重建过程中发挥重要作用：ERK和p38 MAPK信号通路在人参属三七皂苷促进BMSCs成骨分化的过程中扮演重要角色[15]；雌激素介导的MEK-ERK信号通路参与接骨木提取物香草酸促进骨形成的过程[16]；p-JNK参与BMP诱导的成骨细胞骨钙素的分泌[17]。
低频电磁场在骨骼肌肉系统疾病方面的治疗效果已得到了广泛认可[18-20]，研究者们对其作用机制也进行了探讨，文献报道低频电磁场可通过Ca2+/钙调蛋白、NO-cGMP-PKG、Wnt/Lrp5/β-catenin等信号通路参与促进骨形成[21-23]。然而MAPKs信号通路与低频电磁场促进骨形成之间的关系却鲜有报道，对此本研究通过检测50 Hz、0.6 mT低频脉冲 电 磁场处理后MAPKs磷酸化水平的变化及其与大鼠 颅骨成骨细胞矿化成熟之间的关系发现，p38参与50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进骨形成的过 程。
通过采用Western blot检测低频脉冲电磁场处理不同时间后MAPKs磷酸化水平的变化发现，p- ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白表达量无明显变化，而p-p38的蛋白表达量却发生显著变化，说明50 Hz、0.6mT低频脉冲电磁场激活了信号分子p38；而使用抑制剂SB202190抑制p-p38的活性后，由低频脉冲电磁场所引起的ALP活性升高、ALP染色阳性克隆及钙化结节数量和面积的增加被削弱，说明信号分子p38参与了50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进大鼠颅骨成骨细胞矿化成熟的过程。
然而，在实验过程中我们发现，使用SB202190抑制p-p38活性后，由低频脉冲电磁场所引起的ALP染色阳性克隆及钙化结节阳性克隆并未完全回归对照组水平（D组仍显著高于A组），提示我们在50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场促进骨形成的过程中，尚有其他信号通路参与其中，这也与文献报道结果相吻合。此外，在经典的信号分子p-p38的激活过程中，MAPKKKs中的MEKK1-3、MLK2/3、ASK1、Tpl2、TAK1和TAO1/2等，MAPKKs中的MEK3和MEK6参与其中，逐级激活[10]。那么50 Hz、0.6 mT低频脉冲电磁场是通过经典的信号转导方式激活p-p38，还是通过其他信号通路激活p-p38，仍有待研究，以明确在细胞这个非线性的系统中，各个信号通路之间的相互联系、协调作用以及低频电磁场促进骨形成的具体机制。
