引用本文： 刘浩, 芮永军, 孙振中, 汤峰林, 丁涛. BMP-14联合Noggin shRNA共转染对脂肪来源干细胞成骨分化能力的影响. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1270-1275. doi: 10.7507/1002-1892.20160259 复制
骨缺损的修复一直是困扰临床骨科医师的难题之一。近年来，随着细胞生物学研究的进展，以基因治疗与骨组织工程相结合的方法修复骨缺损已得到国内外学者的广泛认同，成为目前临床上最有效、副作用最小的骨缺损修复方法[1]。1965年，Urist[2]发现了BMPs，其具有诱导成骨和成软骨的能力，是目前认为诱导成骨能力最强的一类诱导因子。其中重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）和rhBMP-7分别于2002年和2003年被美国食物药品监督管理局（FDA）批准用于临床[3]。除了这两种BMPs外，人们仍在不断寻找新的具有更强骨诱导活性的BMPs，从而为临床修复骨缺损带来新的希望，其中BMP-14是研究热点之一。
BMP-14是Storm于1994年发现的一种生长因子，在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用[4]。BMP-14基因自然突变的小鼠表现为严重的四肢畸形：长骨短缩、指（趾）骨扁平并伴有多关节融合，这提示了BMP-14在生物工程领域的治疗作用。在研究BMPs的过程中，人们发现BMPs修饰的成骨分化被细胞外基质BMPs的抑制剂所调节，包括Noggin、Chordin、Gremlin和Follistatin[5]。其中Noggin是与BMPs最具亲和力的一种蛋白，Noggin通过与细胞表面的BMPs受体相竞争，特异性地与BMPs结合，阻碍BMPs与其自身受体结合及下游区的信号传导，从而拮抗BMPs的作用[6]。
迄今为止，国内外在骨组织工程领域的研究大多集中在某一种骨诱导因子上，如单独使用BMP-2或BMP-7，其结果往往需要使用超生理剂量才能达到促进成骨及骨再生的要求。而对于两种基因联合转染，既往研究通过将具有协同作用的促成骨基因同时过表达来发挥作用，比如BMP-2联合VEGF或BMP-2联合BMP-7，其结果显著改善了干细胞成骨分化的速度和程度。据此我们猜想，若同时干预同一信号通路上的增强性基因BMP-14和抑制性基因Noggin（即沉默细胞中的抑制性基因、联合增强性基因），理论上可以进一步提高干细胞的成骨分化能力，并有望发现一种超越现有骨诱导活性的成骨因子组合；同时还可以制成一种具有临床应用价值及超强骨诱导活性，能促进骨愈合或脊柱融合的自体骨新材料，为临床治疗骨缺损带来重大改变。故本实验针对BMP-14和其拮抗剂Noggin的特点，分别构建慢病毒过表达载体及干扰载体，将两种重组慢病毒共转染大鼠脂肪来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），并检测联合作用下ADSCs的成骨分化能力，为基因治疗骨缺损探索新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雄性SD大鼠5只，体质量250～ 300 g，由无锡市人民医院实验动物中心提供。
Ⅰ型胶原酶、抗坏血酸、地塞米松、胰岛素、茜素红（Sigma公司，美国）；FBS（HyClone公司，美国）；β-甘油磷酸钠、PCR引物（Invitrogen公司，美国）；Trizol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司，美国）；SYBR Green PCR Master Mix（江苏同科医药公司）；慢病毒表达质粒（北京英茂盛业生物科技有限公司）；BMP-14（A-10） 单克隆抗体、Noggin多克隆抗体、β-actin（Santa Cruz公司，美国）。293FT细胞株由本实验室冻存。
CO2培养箱、低温高速离心机（Thermo公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备工程公司）；倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ABI7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）。
1.2 大鼠ADSCs的分离、培养
将SD大鼠断颈处死后，在超净工作台中分离腹股沟脂肪组织，PBS清洗后剪成1 mm3左右小块；转移至5 mL离心管中，加入5倍体积的0.1% Ⅰ型胶原酶溶液，置入37℃恒温振荡箱中振荡消化60～90 min；用含10%FBS的DMEM培养液等体积中和，以离心半径15 cm、1 500 r/min离心10 min后弃上清；160 mmol/L NH4Cl裂解红细胞10 min，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心10 min，弃上清。用含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞并计数，按2×105个/瓶密度接种于35 cm2培养瓶内，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。培养48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以PBS冲洗3次，之后每2～3 d换液1次，5～7 d细胞生长融合至80%～90%时，进行传代培养。按雷蕙嘉等[7]的方法鉴定为ADSCs。
1.3 BMP-14、Noggin shRNA重组慢病毒的构建
1.3.1 大鼠BMP-14表达载体构建
收集大鼠ADSCs，抽提RNA，严格按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行体外反转录得到cDNA，以此作为模板，结合引物进行PCR扩增得到BMP-14产物，引物序列：BMP-14上游5'-ATGAGACTCCCCAAACTCCT-3'，下游5'-CTACCTACAGCCACAAGATTC-3'，产物片段1 488 bp；通过XbaⅠ/EcoRⅠ酶切位点将BMP-14克隆入过表达载体pLV-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）-Puro。酶切鉴定结果显示1、2、3、4、6均成功插入目的片段BMP-14，证明成功获得BMP-14过表达载体。见图 1。后续实验选用pLV-EGFP-Puro-BMP-14-1。
图1
pLV-EGFP-Puro-BMP-14酶切鉴定图谱 M：2 000 bp marker 1～8：pLV-BMP-14酶切产物 1.3.2 大鼠Noggin
shRNA干扰载体构建 根据小干扰RNA的设计原则，针对目的基因Noggin的序列，合成一对验证有效的shRNA寡核苷酸序列：上游5'-CCGGGCCAGCACTATCTACACATCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGCTTTTTG-3'，下游5'-AATTCAAAAAGCCAGCACTATCTACACA-TCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGC-3'，经退火使其变为双链。pLKO.1质粒AgeⅠ/EcoRⅠ双酶切后将Noggin shRNA插入pLKO.1，连接转化后进行测序鉴定。通过序列比对，确认序列与Gene Bank中的序列完全一致，载体构建成功。见图 2。
1.3.3 病毒包装
使用Lipofectamine 2000转染试剂将慢病毒包装辅助质粒PLP1、PLP2、PLP-VSVG混合物与构建的BMP-14、Noggin shRNA表达质粒共转染至293FT细胞，转染后48 h观察转染效率，收集培养上清进行浓缩，转染后72 h再次收集浓缩。将上清以离心半径15 cm、3 000 r/min离心15 min后，上清用0.45 μm滤器过滤以去除细胞碎片。由此包装出携带BMP-14、Noggin shRNA的重组慢病毒（Lv-BMP-14、Lv-Noggin shRNA），分装于-80℃冰箱冻存备用。Lv-EGFP已有备用冻存。
1.4 基因转染及实验分组
实验分为3组，分别为对照组（A组，空载体病毒Lv-EGFP转染ADSCs）、BMP-14组（B组，Lv-BMP-14转染ADSCs）和BMP-14+Noggin shRNA组（C组，Lv-BMP-14+Lv-Noggin shRNA转染ADSCs）。具体转染方法：取状态良好的第3代ADSCs，以3×105个 /孔密度铺于6孔板，37℃培养过夜；转染前从冰箱取出病毒在冰上缓慢融化，用含10%FBS的DMEM培养液准确稀释慢病毒原液；吸去细胞原有培养基，加入1/2体积的已稀释慢病毒液，轻轻“8”字混匀。37℃孵育4～6 h后更换新鲜培养液；48～72 h后倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，倒置相差显微镜观察细胞生长情况并及时换液。
1.5 观测指标
1.5.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
各组分别于转染后3、7、14 d收集细胞，抽提RNA，反转录为cDNA，根据检测基因的不同，使用 Primer Premier 5.0 软件设计相应引物。引物序列：BMP-14上游5'-TGTCCGATGCTGACAGAAAG-3'，下游5'-TCCTTCTCCAAGGCACTGAT-3'；成骨相关基因Ⅰ型胶原上游5'-GTCTCAAGATGGTGGCCGTT-3'，下游5'-TCCGCTCTTCCAGTCAGAGT-3'；ALP上游5'-CAAGGACATCGCCTATCAG-3'，下游5'-CAGTGCGGTTCCAGACATA-3'；骨钙素（osteocalcin ，OCN）上游5'-TCTGAAATACGGTAACCCG-3'，下游5'-GAGTTCTACAAGACAGCAGGC-3'。反应体系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/ L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O补足至总体积20 μL；混匀后上机。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法并以GAPDH为内参计算BMP-14及成骨相关基因Ⅰ型胶原、ALP、OCN mRNA相对表达量，根据BMP-14的mRNA相对表达量评估Noggin基因沉默的效率。
1.5.2 茜素红染色观察
转染后14 d取3组细胞，PBS清洗后，95%乙醇固定10 min，0.1%茜素红染液染色5 min，ddH2O清洗后，倒置相差显微镜观察。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示；组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 转染效率观察
转染后48 h荧光倒置显微镜观察示，各组ADSCs荧光阳性细胞比率均达90%以上；倒置相差显微镜观察示各组细胞生长状态良好。说明重组慢病毒转染效率高，外源基因可有效表达。见图 3、4。
2.2 实时荧光定量PCR检测
2.2.1 Noggin基因沉默效率观察
转染后3 d，各组BMP-14 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后7、14 d，C组BMP-14 mRNA相对表达量高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
实时荧光定量PCR检测各组各时间点各基因mRNA相对表达量（n=9，x±s）
Table1.
Comparison of gene mRNA expression levels among groups at each time point by real time fluorescence quantitative PCR（n=9，x±s）
2.2.2 成骨相关基因表达
转染后3 d，C组各基因mRNA相对表达量均显著高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A、B组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后7、14 d，C组各基因mRNA相对表达量显著高于A、B组，B组高于A组，除转染后7 d A、B组间Ⅰ型胶原mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
2.3 茜素红染色观察
转染后14 d 茜素红染色示，A、B、C组钙结节量呈递增趋势（图 5）。
3 讨论
近年来，由于创伤、先天畸形、肿瘤等原因引起的骨缺损在临床上越来越多见，大面积骨缺损的修复是临床治疗中的一大难题。治疗骨缺损最常用方法是自体骨移植及同种异体骨移植。但自体骨移植存在供区骨量不足、供区损伤、延长手术时间及增加手术风险等问题，同种异体骨移植可能会引起机体排斥反应、疾病传播和骨不连等术后并发症，使得这两种方法在临床应用受限[8-10]。目前，组织工程技术联合转基因治疗的开展可改进上述弊端，成为解决这一难题的有效方法[11]。
组织工程技术的三大要素是种子细胞、诱导因子、支架材料，其中种子细胞的获得、培养与分化是组织工程的前提和基础[12]。随着组织工程学研究的进展，目前已证实种子细胞的来源多种多样，包括骨、骨膜、骨髓、骨外组织、早期胚胎等，各种来源均有其优缺点。Zuk等[13]首次提出了ADSCs，因其具有取材方便、生长增殖能力强以及多向分化潜能等优点而受到广泛关注，成为目前种子细胞的研究热点。故本实验选择大鼠ADSCs作为研究细胞。
骨诱导因子是一种蛋白质或多肽，具有促进MSCs生长、增殖、成骨分化和基质合成等作用，在骨组织工程中具有重要作用[14]。BMPs属于TGF-β超家族成员，部分成员具有诱导成骨和成软骨的能力，其作用于未分化的MSCs，能跨种属诱导成骨。除了已在临床应用的BMP-2和BMP-7外，研究人员仍在积极探索其他更具成骨活性的BMPs。前期研究发现，BMP-14可能同样具有良好的骨诱导潜力，引起了学者们的广泛关注。体外实验证明BMP-14能诱导MSCs向软骨细胞方向分化[15]；同时，BMP-14能诱导多能间充质细胞[16]、ADSCs[17]、BMSCs[18]和骨膜细胞[19]等多种细胞向成骨细胞分化。BMP-14在诱导软骨分化过程中发挥的重要作用已被广泛接受，但其促进成骨诱导的作用却鲜有报道。因此，本实验选择BMP-14作为骨诱导因子作进一步研究。根据实验结果，B组成骨相关基因mRNA相对表达量高于A组，我们初步认为BMP-14能够诱导大鼠ADSCs向成骨细胞分化，而BMP-14的成骨诱导水平究竟如何还有待更多研究明确。
在研究BMPs的过程中，人们发现了包括Noggin、Chordin、Gremlin等在内的BMP拮抗剂。在众多可下调BMP信号的细胞外拮抗剂中，Noggin是与 BMPs最具亲和力的一种蛋白。本实验通过构建有效的慢病毒干扰载体（Lv-Noggin shRNA），联合Lv-BMP-14共转染大鼠ADSCs，结果发现联合转染组BMP-14 mRNA相对表达量明显高于BMP-14单独转染组，表明Lv-Noggin shRNA成功干扰了Noggin基因。
若是单纯将细胞因子使用于机体内，往往会因机体的降解、稀释作用及其半衰期过短等因素而很难有效发挥作用[20]。所以我们采用了转基因治疗，即利用载体将目的基因转运到细胞内，使细胞表达并产生蛋白[21]。这样不仅克服了外源性蛋白价格昂贵和效果不理想等缺点，还能够更强地促进骨形成[22]。本实验选择使用的慢病毒载体成功将目的基因运载到细胞中，转染后ADSCs荧光阳性细胞比率均高达90%以上，且细胞生长状态良好，外源基因得到了有效表达。
单独使用一种BMP，往往需要使用超生理剂量才能达到促进成骨的要求[23]。而联合转染多种基因不仅可产生协同作用，更将显著缩短转染所需时间及减少诱导因子所需剂量[24-26]。本实验根据“基因强化组织工程”的原理，利用慢病毒载体分别将两种目的基因（BMP-14、Noggin shRNA）同时转运至大鼠ADSCs，从正向、反向两个方面同时干预，结果极大地提高了干细胞的成骨分化能力。
根据本实验结果可以发现，应用转基因干细胞治疗骨缺损拥有巨大潜力。我们验证了同时干预增强性和抑制性基因的可行性和优越性，并且评估了大鼠ADSCs的转基因效果和体外成骨分化能力。这为基因治疗骨缺损探索出一种新的思路，同时为以后研究其他诱导因子联合转染提供了实验参考。但体内环境下的骨修复过程比体外复杂得多，其受到多方面因素的影响，还有待进一步深入研究。
骨缺损的修复一直是困扰临床骨科医师的难题之一。近年来，随着细胞生物学研究的进展，以基因治疗与骨组织工程相结合的方法修复骨缺损已得到国内外学者的广泛认同，成为目前临床上最有效、副作用最小的骨缺损修复方法[1]。1965年，Urist[2]发现了BMPs，其具有诱导成骨和成软骨的能力，是目前认为诱导成骨能力最强的一类诱导因子。其中重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）和rhBMP-7分别于2002年和2003年被美国食物药品监督管理局（FDA）批准用于临床[3]。除了这两种BMPs外，人们仍在不断寻找新的具有更强骨诱导活性的BMPs，从而为临床修复骨缺损带来新的希望，其中BMP-14是研究热点之一。
BMP-14是Storm于1994年发现的一种生长因子，在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用[4]。BMP-14基因自然突变的小鼠表现为严重的四肢畸形：长骨短缩、指（趾）骨扁平并伴有多关节融合，这提示了BMP-14在生物工程领域的治疗作用。在研究BMPs的过程中，人们发现BMPs修饰的成骨分化被细胞外基质BMPs的抑制剂所调节，包括Noggin、Chordin、Gremlin和Follistatin[5]。其中Noggin是与BMPs最具亲和力的一种蛋白，Noggin通过与细胞表面的BMPs受体相竞争，特异性地与BMPs结合，阻碍BMPs与其自身受体结合及下游区的信号传导，从而拮抗BMPs的作用[6]。
迄今为止，国内外在骨组织工程领域的研究大多集中在某一种骨诱导因子上，如单独使用BMP-2或BMP-7，其结果往往需要使用超生理剂量才能达到促进成骨及骨再生的要求。而对于两种基因联合转染，既往研究通过将具有协同作用的促成骨基因同时过表达来发挥作用，比如BMP-2联合VEGF或BMP-2联合BMP-7，其结果显著改善了干细胞成骨分化的速度和程度。据此我们猜想，若同时干预同一信号通路上的增强性基因BMP-14和抑制性基因Noggin（即沉默细胞中的抑制性基因、联合增强性基因），理论上可以进一步提高干细胞的成骨分化能力，并有望发现一种超越现有骨诱导活性的成骨因子组合；同时还可以制成一种具有临床应用价值及超强骨诱导活性，能促进骨愈合或脊柱融合的自体骨新材料，为临床治疗骨缺损带来重大改变。故本实验针对BMP-14和其拮抗剂Noggin的特点，分别构建慢病毒过表达载体及干扰载体，将两种重组慢病毒共转染大鼠脂肪来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），并检测联合作用下ADSCs的成骨分化能力，为基因治疗骨缺损探索新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雄性SD大鼠5只，体质量250～ 300 g，由无锡市人民医院实验动物中心提供。
Ⅰ型胶原酶、抗坏血酸、地塞米松、胰岛素、茜素红（Sigma公司，美国）；FBS（HyClone公司，美国）；β-甘油磷酸钠、PCR引物（Invitrogen公司，美国）；Trizol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司，美国）；SYBR Green PCR Master Mix（江苏同科医药公司）；慢病毒表达质粒（北京英茂盛业生物科技有限公司）；BMP-14（A-10） 单克隆抗体、Noggin多克隆抗体、β-actin（Santa Cruz公司，美国）。293FT细胞株由本实验室冻存。
CO2培养箱、低温高速离心机（Thermo公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备工程公司）；倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ABI7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）。
1.2 大鼠ADSCs的分离、培养
将SD大鼠断颈处死后，在超净工作台中分离腹股沟脂肪组织，PBS清洗后剪成1 mm3左右小块；转移至5 mL离心管中，加入5倍体积的0.1% Ⅰ型胶原酶溶液，置入37℃恒温振荡箱中振荡消化60～90 min；用含10%FBS的DMEM培养液等体积中和，以离心半径15 cm、1 500 r/min离心10 min后弃上清；160 mmol/L NH4Cl裂解红细胞10 min，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心10 min，弃上清。用含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞并计数，按2×105个/瓶密度接种于35 cm2培养瓶内，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。培养48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以PBS冲洗3次，之后每2～3 d换液1次，5～7 d细胞生长融合至80%～90%时，进行传代培养。按雷蕙嘉等[7]的方法鉴定为ADSCs。
1.3 BMP-14、Noggin shRNA重组慢病毒的构建
1.3.1 大鼠BMP-14表达载体构建
收集大鼠ADSCs，抽提RNA，严格按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行体外反转录得到cDNA，以此作为模板，结合引物进行PCR扩增得到BMP-14产物，引物序列：BMP-14上游5'-ATGAGACTCCCCAAACTCCT-3'，下游5'-CTACCTACAGCCACAAGATTC-3'，产物片段1 488 bp；通过XbaⅠ/EcoRⅠ酶切位点将BMP-14克隆入过表达载体pLV-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）-Puro。酶切鉴定结果显示1、2、3、4、6均成功插入目的片段BMP-14，证明成功获得BMP-14过表达载体。见图 1。后续实验选用pLV-EGFP-Puro-BMP-14-1。
图1
pLV-EGFP-Puro-BMP-14酶切鉴定图谱 M：2 000 bp marker 1～8：pLV-BMP-14酶切产物 1.3.2 大鼠Noggin
shRNA干扰载体构建 根据小干扰RNA的设计原则，针对目的基因Noggin的序列，合成一对验证有效的shRNA寡核苷酸序列：上游5'-CCGGGCCAGCACTATCTACACATCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGCTTTTTG-3'，下游5'-AATTCAAAAAGCCAGCACTATCTACACA-TCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGC-3'，经退火使其变为双链。pLKO.1质粒AgeⅠ/EcoRⅠ双酶切后将Noggin shRNA插入pLKO.1，连接转化后进行测序鉴定。通过序列比对，确认序列与Gene Bank中的序列完全一致，载体构建成功。见图 2。
1.3.3 病毒包装
使用Lipofectamine 2000转染试剂将慢病毒包装辅助质粒PLP1、PLP2、PLP-VSVG混合物与构建的BMP-14、Noggin shRNA表达质粒共转染至293FT细胞，转染后48 h观察转染效率，收集培养上清进行浓缩，转染后72 h再次收集浓缩。将上清以离心半径15 cm、3 000 r/min离心15 min后，上清用0.45 μm滤器过滤以去除细胞碎片。由此包装出携带BMP-14、Noggin shRNA的重组慢病毒（Lv-BMP-14、Lv-Noggin shRNA），分装于-80℃冰箱冻存备用。Lv-EGFP已有备用冻存。
1.4 基因转染及实验分组
实验分为3组，分别为对照组（A组，空载体病毒Lv-EGFP转染ADSCs）、BMP-14组（B组，Lv-BMP-14转染ADSCs）和BMP-14+Noggin shRNA组（C组，Lv-BMP-14+Lv-Noggin shRNA转染ADSCs）。具体转染方法：取状态良好的第3代ADSCs，以3×105个 /孔密度铺于6孔板，37℃培养过夜；转染前从冰箱取出病毒在冰上缓慢融化，用含10%FBS的DMEM培养液准确稀释慢病毒原液；吸去细胞原有培养基，加入1/2体积的已稀释慢病毒液，轻轻“8”字混匀。37℃孵育4～6 h后更换新鲜培养液；48～72 h后倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，倒置相差显微镜观察细胞生长情况并及时换液。
1.5 观测指标
1.5.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达
各组分别于转染后3、7、14 d收集细胞，抽提RNA，反转录为cDNA，根据检测基因的不同，使用 Primer Premier 5.0 软件设计相应引物。引物序列：BMP-14上游5'-TGTCCGATGCTGACAGAAAG-3'，下游5'-TCCTTCTCCAAGGCACTGAT-3'；成骨相关基因Ⅰ型胶原上游5'-GTCTCAAGATGGTGGCCGTT-3'，下游5'-TCCGCTCTTCCAGTCAGAGT-3'；ALP上游5'-CAAGGACATCGCCTATCAG-3'，下游5'-CAGTGCGGTTCCAGACATA-3'；骨钙素（osteocalcin ，OCN）上游5'-TCTGAAATACGGTAACCCG-3'，下游5'-GAGTTCTACAAGACAGCAGGC-3'。反应体系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/ L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O补足至总体积20 μL；混匀后上机。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法并以GAPDH为内参计算BMP-14及成骨相关基因Ⅰ型胶原、ALP、OCN mRNA相对表达量，根据BMP-14的mRNA相对表达量评估Noggin基因沉默的效率。
1.5.2 茜素红染色观察
转染后14 d取3组细胞，PBS清洗后，95%乙醇固定10 min，0.1%茜素红染液染色5 min，ddH2O清洗后，倒置相差显微镜观察。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示；组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 转染效率观察
转染后48 h荧光倒置显微镜观察示，各组ADSCs荧光阳性细胞比率均达90%以上；倒置相差显微镜观察示各组细胞生长状态良好。说明重组慢病毒转染效率高，外源基因可有效表达。见图 3、4。
2.2 实时荧光定量PCR检测
2.2.1 Noggin基因沉默效率观察
转染后3 d，各组BMP-14 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后7、14 d，C组BMP-14 mRNA相对表达量高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
实时荧光定量PCR检测各组各时间点各基因mRNA相对表达量（n=9，x±s）
Table1.
Comparison of gene mRNA expression levels among groups at each time point by real time fluorescence quantitative PCR（n=9，x±s）
2.2.2 成骨相关基因表达
转染后3 d，C组各基因mRNA相对表达量均显著高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A、B组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后7、14 d，C组各基因mRNA相对表达量显著高于A、B组，B组高于A组，除转染后7 d A、B组间Ⅰ型胶原mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
2.3 茜素红染色观察
转染后14 d 茜素红染色示，A、B、C组钙结节量呈递增趋势（图 5）。
3 讨论
近年来，由于创伤、先天畸形、肿瘤等原因引起的骨缺损在临床上越来越多见，大面积骨缺损的修复是临床治疗中的一大难题。治疗骨缺损最常用方法是自体骨移植及同种异体骨移植。但自体骨移植存在供区骨量不足、供区损伤、延长手术时间及增加手术风险等问题，同种异体骨移植可能会引起机体排斥反应、疾病传播和骨不连等术后并发症，使得这两种方法在临床应用受限[8-10]。目前，组织工程技术联合转基因治疗的开展可改进上述弊端，成为解决这一难题的有效方法[11]。
组织工程技术的三大要素是种子细胞、诱导因子、支架材料，其中种子细胞的获得、培养与分化是组织工程的前提和基础[12]。随着组织工程学研究的进展，目前已证实种子细胞的来源多种多样，包括骨、骨膜、骨髓、骨外组织、早期胚胎等，各种来源均有其优缺点。Zuk等[13]首次提出了ADSCs，因其具有取材方便、生长增殖能力强以及多向分化潜能等优点而受到广泛关注，成为目前种子细胞的研究热点。故本实验选择大鼠ADSCs作为研究细胞。
骨诱导因子是一种蛋白质或多肽，具有促进MSCs生长、增殖、成骨分化和基质合成等作用，在骨组织工程中具有重要作用[14]。BMPs属于TGF-β超家族成员，部分成员具有诱导成骨和成软骨的能力，其作用于未分化的MSCs，能跨种属诱导成骨。除了已在临床应用的BMP-2和BMP-7外，研究人员仍在积极探索其他更具成骨活性的BMPs。前期研究发现，BMP-14可能同样具有良好的骨诱导潜力，引起了学者们的广泛关注。体外实验证明BMP-14能诱导MSCs向软骨细胞方向分化[15]；同时，BMP-14能诱导多能间充质细胞[16]、ADSCs[17]、BMSCs[18]和骨膜细胞[19]等多种细胞向成骨细胞分化。BMP-14在诱导软骨分化过程中发挥的重要作用已被广泛接受，但其促进成骨诱导的作用却鲜有报道。因此，本实验选择BMP-14作为骨诱导因子作进一步研究。根据实验结果，B组成骨相关基因mRNA相对表达量高于A组，我们初步认为BMP-14能够诱导大鼠ADSCs向成骨细胞分化，而BMP-14的成骨诱导水平究竟如何还有待更多研究明确。
在研究BMPs的过程中，人们发现了包括Noggin、Chordin、Gremlin等在内的BMP拮抗剂。在众多可下调BMP信号的细胞外拮抗剂中，Noggin是与 BMPs最具亲和力的一种蛋白。本实验通过构建有效的慢病毒干扰载体（Lv-Noggin shRNA），联合Lv-BMP-14共转染大鼠ADSCs，结果发现联合转染组BMP-14 mRNA相对表达量明显高于BMP-14单独转染组，表明Lv-Noggin shRNA成功干扰了Noggin基因。
若是单纯将细胞因子使用于机体内，往往会因机体的降解、稀释作用及其半衰期过短等因素而很难有效发挥作用[20]。所以我们采用了转基因治疗，即利用载体将目的基因转运到细胞内，使细胞表达并产生蛋白[21]。这样不仅克服了外源性蛋白价格昂贵和效果不理想等缺点，还能够更强地促进骨形成[22]。本实验选择使用的慢病毒载体成功将目的基因运载到细胞中，转染后ADSCs荧光阳性细胞比率均高达90%以上，且细胞生长状态良好，外源基因得到了有效表达。
单独使用一种BMP，往往需要使用超生理剂量才能达到促进成骨的要求[23]。而联合转染多种基因不仅可产生协同作用，更将显著缩短转染所需时间及减少诱导因子所需剂量[24-26]。本实验根据“基因强化组织工程”的原理，利用慢病毒载体分别将两种目的基因（BMP-14、Noggin shRNA）同时转运至大鼠ADSCs，从正向、反向两个方面同时干预，结果极大地提高了干细胞的成骨分化能力。
根据本实验结果可以发现，应用转基因干细胞治疗骨缺损拥有巨大潜力。我们验证了同时干预增强性和抑制性基因的可行性和优越性，并且评估了大鼠ADSCs的转基因效果和体外成骨分化能力。这为基因治疗骨缺损探索出一种新的思路，同时为以后研究其他诱导因子联合转染提供了实验参考。但体内环境下的骨修复过程比体外复杂得多，其受到多方面因素的影响，还有待进一步深入研究。
