引用本文： 王琳, 周立冬, 吴美, 刘理金, 向勇平, 刘谋元, 刘爱兵. 硫酸软骨素促进成肌细胞增殖作用的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1290-1294. doi: 10.7507/1002-1892.20160262 复制
成肌细胞是肌肉组织的前体细胞，来源于卫星细胞，只能单向发展为肌肉[1]，具有自我更新和促进肌纤维再生的能力，在彼此天然融合和核传递时产生收缩蛋白，成功应用于细胞治疗和基因组治疗[2-3]。人成肌细胞移植治疗技术是通过注射所培养的一定数量成肌细胞，使正常人类基因组传递至患者有缺陷基因组的细胞内，从而修补患者细胞遗传缺陷的临床技术[4]，目前已成功用于肌萎缩、心脏病、2型糖尿病、实体癌的治疗[5-8]。成肌细胞是已分化的最原始的肌性细胞，在体外传代培养过程中，融合形成肌管后再形成肌节，肌细胞分化将不可逆性退出细胞周期[9-11]。
硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一类广泛存在于人与动物结缔（软骨）组织中的糖胺聚糖[12]，具有多种重要生物活性。首先，CS具有抗氧化活性，能够清除超氧阴离子自由基、羟自由基、二苯基苦基苯肼自由基；其次，其更多的生理活性也已被证实，如抑制神经细胞生长、调节免疫、促骨组织生成、促进3T3-L1细胞增殖并抑制其成脂的作用[13]；再者，CS除了构成细胞外基质具有支持细胞的作用外，临床上常将其应用于软骨损伤、神经性头痛、神经痛、关节痛、老年退行性关节炎、风湿性关节炎等疾病的辅助治疗，在防治冠心病、动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤等领域亦有一定改善作用[14-16]。
临床报道证明成肌细胞治疗疗效取决于注射细胞的数量，当成肌细胞数＞1×108个时治疗效果明显[17-20]。因此，大量扩增成肌细胞数量和抑制成肌细胞分化，是其应用于临床急需解决的问题。相关研究表明[13]，CS可能有促进成肌细胞增殖、抑制其分化的作用。本研究通过在成肌细胞培养基中添加CS，观察其对成肌细胞增殖以及肌管形成的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器
DMEM/F12 1∶1培养基（HyClone公司，美国）；UltraCULTURETM培养基（Lonza公司，瑞士）；CS（Sigma公司，美国 ）；HE染色试剂盒（Thermo公司，美国）；MTT 试剂盒（Sigma公司，美国）；肌间线蛋白（Desmin）单克隆抗体、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；FBS（HyClone公司，美国）。CO2培养箱（Thermo公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Beckman公司，美国）；细胞计数仪（Mllipore公司，德国）。
1.2 人成肌细胞的分离、培养、鉴定
采集成年志愿者股直肌手术后2 h内的肌肉组织2 g，放入平皿中剪碎为1 mm3的小块，用含1%双抗的PBS溶液冲洗3次；转移至50 mL离心管，加入2 mg/mLⅡ型胶原酶15 mL，用吸管吹打混匀，放入37℃水浴锅2 h；再加入0.25%胰蛋白酶5 mL，用吸管吹打混匀，放入37℃水浴锅30 min。消化完后用200目不锈钢筛过滤，滤液以半径12 cm、2 000 r/ min离心5 min；弃上清，PBS清洗沉淀3次，同上法离心5 min。加入4 mL含1 mg/L IGF-1、10 mg/L bFGF、20%FBS的DMEM/F12 1∶1培养液，接种至T25培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，分别于2、8、12、24、48、72 h时将细胞悬液依次更换至新的培养瓶；最后一次更换培养瓶后，将细胞继续培养3 d，使其充分贴壁；然后更换新鲜培养液，长满90%时可消化传代；用0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化4 min后，加入含10%FBS的培养液2.5 mL终止消化；收集细胞，PBS溶液洗除残余胰蛋白酶，以1∶2比例传代，冻存。选择第5代成肌细胞复苏备用，按本实验室既往实验方法[1]鉴定为成肌细胞。
1.3 实验分组及观测指标
1.3.1 实验分组
取第5代成肌细胞制成浓度为1×108 个/L的细胞悬液，依据在成肌细胞培养基中添加不同浓度CS，将实验分为A组（0 µg/mL）、B组（50 µg/mL）、C组（100 µg/mL）和D组（200 µg/mL）。
1.3.2 形态学观察
取成肌细胞以1×108个/L浓度接种于6孔板，每组3孔，每孔2 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜观察干预后4、5、8 d各组成肌细胞增殖和分化情 况。
1.3.3 细胞增殖情况检测
取成肌细胞以1×108 个 / L浓度接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。按参考文献[1]方法，在培养6 d时细胞增殖进入稳定期，加入MTT溶液160 μL避光孵育，4 h后终止培养，去除上清，每孔滴加1.6 mL DMSO，振荡混匀10 min，使结晶充分溶解，使用酶标仪测定490 nm波长处活细胞吸光度（A） 值。实验重复3次，取均值。
1.3.4 HE染色及肌管形成检测
取成肌细胞以1×108个/L浓度接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。培养8 d弃上清，常规HE染色后倒置显微镜下观察；于20倍镜下计数10个视野所形成的肌管数。实验重复3次，取均值。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 形态学观察
倒置显微镜观察示，细胞贴壁后呈单核梭形，细胞核呈卵圆形，细胞质致密；贴壁90%时整体肌母细胞呈漩涡状走行，长梭状生长。4 d，A、B、C、D组细胞分别贴壁约50%、60%、70%、80%（图 1 a～d）；5 d，A、B、C、D组细胞分别贴壁约60%、70%、80%、90%（图 1 e～h）。继续培养成肌细胞细胞核出现融合现象，形成多核肌管，呈长条状，体积是单个成肌细胞的2～5倍，肌管内细胞核数在2个以上，肌管之间相互连接形成网状。8 d，A组细胞多数已融合形成肌管，B、C组细胞有部分未融合，D组细胞融合形成肌管数最少（图 1 i～l）。
图1
CS干预各时间点各组细胞形态学观察（倒置显微镜×10） ⓐ A组4 d ⓑ B组4 d ⓒ C组4 d ⓓ D组4 d ⓔ A组5 d ⓕ B组5 d ⓖ C组5 d ⓗ D组5 d ⓘ A组8 d ⓙ B组8 d ⓚ C组8 d ⓛ D组8 d 2.2 细胞增殖情况检测
MTT检测示，A、B、C、D组A值分别为0.045 2± 0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0± 0.039 0，A组显著小于B、C、D组，B、C组小于D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 HE染色及肌管形成检测
HE染色示，A组细胞大多数已融合形成肌管；B、C组有少数细胞未融合形成肌管；D组细胞融合形成肌管数相对最少，未融合细胞数稍多。见图 2。A、B、C、D组肌管形成数分别为（222.01±30.02）、（193.13±42.46）、（170.26±11.96）、（136.88±16.78），各组间比较差异无统计学意义（F=1.658，P=0.252）。
3 讨论
成肌细胞是已分化的最原始的肌性细胞，是肌肉组织的前体细胞，虽然目前已成功应用于临床，但成肌细胞治疗疗效取决于注射细胞的数量，促进成肌细胞增殖、抑制其融合形成肌管是成肌细胞培养的重要研究部分。CS具有多种生物学活性，研究报道[13]CS具有促进3T3-L1细胞增殖并抑制其成脂的作用。本实验将不同浓度CS添加至成肌细胞培养基中，探讨其对成肌细胞的增殖作用和对其融合形成肌管的抑制作用。
本研究中形态学观察结果显示，成肌细胞培养4 d时，0、50、100、200 µg/mL CS干预组分别贴壁约50%、60%、70%、80%，5 d时各干预组细胞约同比增长10%，且200 µg/mL CS干预组在第5天贴壁90%时无明显细胞融合现象，是消化传代的最优状态，所以200 µg/mL是成肌细胞培养基添加CS的最适剂量。MTT法检测各组细胞A值以分析细胞活性，结果显示50 µg/mL和100 µg/mL CS干预组间比较差异无统计学意义，其余各组两两比较均存在显著差异，200 µg/mL CS干预组在促进成肌细胞增殖上显著优于其他各组。
肌管形成是成肌细胞发展为肌纤维的标志性形态，在成肌细胞培养中抑制肌管形成可增加成肌细胞的增殖活性，成肌细胞的大量扩增需要抑制肌管形成。前期研究[1]显示成肌细胞在第6天时增殖达到平台期，随后肌管形成逐天增多，8 d时肌管形态最为明显。本实验在CS干预8 d时可见部分成肌细胞融合形成肌管，倒置显微镜可见各干预组肌管形成数差异不显著。进一步行HE染色并计数10个视野所形成的肌管数，结果显示随CS浓度的增加，细胞形成肌管数呈下降趋势。HE染色示，0 µg/mL CS干预组细胞大多数已融合形成肌管；50、100 µg/mL CS干预组有少部分细胞未融合形成肌管；200 µg/ mL CS干预组细胞融合形成肌管数相对最少，未融合细胞数稍多。但各干预组对肌管形成的影响差异无统计学意义，说明不同浓度CS干预成肌细胞生长均未能抑制其融合形成肌管。
综上述，CS可促进成肌细胞增殖且最佳浓度为200 µg/mL。本研究为成肌细胞高剂量临床应用提供了研究基础，但成肌细胞的大规模扩增还有待进一步研究。
成肌细胞是肌肉组织的前体细胞，来源于卫星细胞，只能单向发展为肌肉[1]，具有自我更新和促进肌纤维再生的能力，在彼此天然融合和核传递时产生收缩蛋白，成功应用于细胞治疗和基因组治疗[2-3]。人成肌细胞移植治疗技术是通过注射所培养的一定数量成肌细胞，使正常人类基因组传递至患者有缺陷基因组的细胞内，从而修补患者细胞遗传缺陷的临床技术[4]，目前已成功用于肌萎缩、心脏病、2型糖尿病、实体癌的治疗[5-8]。成肌细胞是已分化的最原始的肌性细胞，在体外传代培养过程中，融合形成肌管后再形成肌节，肌细胞分化将不可逆性退出细胞周期[9-11]。
硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一类广泛存在于人与动物结缔（软骨）组织中的糖胺聚糖[12]，具有多种重要生物活性。首先，CS具有抗氧化活性，能够清除超氧阴离子自由基、羟自由基、二苯基苦基苯肼自由基；其次，其更多的生理活性也已被证实，如抑制神经细胞生长、调节免疫、促骨组织生成、促进3T3-L1细胞增殖并抑制其成脂的作用[13]；再者，CS除了构成细胞外基质具有支持细胞的作用外，临床上常将其应用于软骨损伤、神经性头痛、神经痛、关节痛、老年退行性关节炎、风湿性关节炎等疾病的辅助治疗，在防治冠心病、动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤等领域亦有一定改善作用[14-16]。
临床报道证明成肌细胞治疗疗效取决于注射细胞的数量，当成肌细胞数＞1×108个时治疗效果明显[17-20]。因此，大量扩增成肌细胞数量和抑制成肌细胞分化，是其应用于临床急需解决的问题。相关研究表明[13]，CS可能有促进成肌细胞增殖、抑制其分化的作用。本研究通过在成肌细胞培养基中添加CS，观察其对成肌细胞增殖以及肌管形成的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器
DMEM/F12 1∶1培养基（HyClone公司，美国）；UltraCULTURETM培养基（Lonza公司，瑞士）；CS（Sigma公司，美国 ）；HE染色试剂盒（Thermo公司，美国）；MTT 试剂盒（Sigma公司，美国）；肌间线蛋白（Desmin）单克隆抗体、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；FBS（HyClone公司，美国）。CO2培养箱（Thermo公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Beckman公司，美国）；细胞计数仪（Mllipore公司，德国）。
1.2 人成肌细胞的分离、培养、鉴定
采集成年志愿者股直肌手术后2 h内的肌肉组织2 g，放入平皿中剪碎为1 mm3的小块，用含1%双抗的PBS溶液冲洗3次；转移至50 mL离心管，加入2 mg/mLⅡ型胶原酶15 mL，用吸管吹打混匀，放入37℃水浴锅2 h；再加入0.25%胰蛋白酶5 mL，用吸管吹打混匀，放入37℃水浴锅30 min。消化完后用200目不锈钢筛过滤，滤液以半径12 cm、2 000 r/ min离心5 min；弃上清，PBS清洗沉淀3次，同上法离心5 min。加入4 mL含1 mg/L IGF-1、10 mg/L bFGF、20%FBS的DMEM/F12 1∶1培养液，接种至T25培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，分别于2、8、12、24、48、72 h时将细胞悬液依次更换至新的培养瓶；最后一次更换培养瓶后，将细胞继续培养3 d，使其充分贴壁；然后更换新鲜培养液，长满90%时可消化传代；用0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化4 min后，加入含10%FBS的培养液2.5 mL终止消化；收集细胞，PBS溶液洗除残余胰蛋白酶，以1∶2比例传代，冻存。选择第5代成肌细胞复苏备用，按本实验室既往实验方法[1]鉴定为成肌细胞。
1.3 实验分组及观测指标
1.3.1 实验分组
取第5代成肌细胞制成浓度为1×108 个/L的细胞悬液，依据在成肌细胞培养基中添加不同浓度CS，将实验分为A组（0 µg/mL）、B组（50 µg/mL）、C组（100 µg/mL）和D组（200 µg/mL）。
1.3.2 形态学观察
取成肌细胞以1×108个/L浓度接种于6孔板，每组3孔，每孔2 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜观察干预后4、5、8 d各组成肌细胞增殖和分化情 况。
1.3.3 细胞增殖情况检测
取成肌细胞以1×108 个 / L浓度接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。按参考文献[1]方法，在培养6 d时细胞增殖进入稳定期，加入MTT溶液160 μL避光孵育，4 h后终止培养，去除上清，每孔滴加1.6 mL DMSO，振荡混匀10 min，使结晶充分溶解，使用酶标仪测定490 nm波长处活细胞吸光度（A） 值。实验重复3次，取均值。
1.3.4 HE染色及肌管形成检测
取成肌细胞以1×108个/L浓度接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5 mL，按分组干预后于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。培养8 d弃上清，常规HE染色后倒置显微镜下观察；于20倍镜下计数10个视野所形成的肌管数。实验重复3次，取均值。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 形态学观察
倒置显微镜观察示，细胞贴壁后呈单核梭形，细胞核呈卵圆形，细胞质致密；贴壁90%时整体肌母细胞呈漩涡状走行，长梭状生长。4 d，A、B、C、D组细胞分别贴壁约50%、60%、70%、80%（图 1 a～d）；5 d，A、B、C、D组细胞分别贴壁约60%、70%、80%、90%（图 1 e～h）。继续培养成肌细胞细胞核出现融合现象，形成多核肌管，呈长条状，体积是单个成肌细胞的2～5倍，肌管内细胞核数在2个以上，肌管之间相互连接形成网状。8 d，A组细胞多数已融合形成肌管，B、C组细胞有部分未融合，D组细胞融合形成肌管数最少（图 1 i～l）。
图1
CS干预各时间点各组细胞形态学观察（倒置显微镜×10） ⓐ A组4 d ⓑ B组4 d ⓒ C组4 d ⓓ D组4 d ⓔ A组5 d ⓕ B组5 d ⓖ C组5 d ⓗ D组5 d ⓘ A组8 d ⓙ B组8 d ⓚ C组8 d ⓛ D组8 d 2.2 细胞增殖情况检测
MTT检测示，A、B、C、D组A值分别为0.045 2± 0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0± 0.039 0，A组显著小于B、C、D组，B、C组小于D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 HE染色及肌管形成检测
HE染色示，A组细胞大多数已融合形成肌管；B、C组有少数细胞未融合形成肌管；D组细胞融合形成肌管数相对最少，未融合细胞数稍多。见图 2。A、B、C、D组肌管形成数分别为（222.01±30.02）、（193.13±42.46）、（170.26±11.96）、（136.88±16.78），各组间比较差异无统计学意义（F=1.658，P=0.252）。
3 讨论
成肌细胞是已分化的最原始的肌性细胞，是肌肉组织的前体细胞，虽然目前已成功应用于临床，但成肌细胞治疗疗效取决于注射细胞的数量，促进成肌细胞增殖、抑制其融合形成肌管是成肌细胞培养的重要研究部分。CS具有多种生物学活性，研究报道[13]CS具有促进3T3-L1细胞增殖并抑制其成脂的作用。本实验将不同浓度CS添加至成肌细胞培养基中，探讨其对成肌细胞的增殖作用和对其融合形成肌管的抑制作用。
本研究中形态学观察结果显示，成肌细胞培养4 d时，0、50、100、200 µg/mL CS干预组分别贴壁约50%、60%、70%、80%，5 d时各干预组细胞约同比增长10%，且200 µg/mL CS干预组在第5天贴壁90%时无明显细胞融合现象，是消化传代的最优状态，所以200 µg/mL是成肌细胞培养基添加CS的最适剂量。MTT法检测各组细胞A值以分析细胞活性，结果显示50 µg/mL和100 µg/mL CS干预组间比较差异无统计学意义，其余各组两两比较均存在显著差异，200 µg/mL CS干预组在促进成肌细胞增殖上显著优于其他各组。
肌管形成是成肌细胞发展为肌纤维的标志性形态，在成肌细胞培养中抑制肌管形成可增加成肌细胞的增殖活性，成肌细胞的大量扩增需要抑制肌管形成。前期研究[1]显示成肌细胞在第6天时增殖达到平台期，随后肌管形成逐天增多，8 d时肌管形态最为明显。本实验在CS干预8 d时可见部分成肌细胞融合形成肌管，倒置显微镜可见各干预组肌管形成数差异不显著。进一步行HE染色并计数10个视野所形成的肌管数，结果显示随CS浓度的增加，细胞形成肌管数呈下降趋势。HE染色示，0 µg/mL CS干预组细胞大多数已融合形成肌管；50、100 µg/mL CS干预组有少部分细胞未融合形成肌管；200 µg/ mL CS干预组细胞融合形成肌管数相对最少，未融合细胞数稍多。但各干预组对肌管形成的影响差异无统计学意义，说明不同浓度CS干预成肌细胞生长均未能抑制其融合形成肌管。
综上述，CS可促进成肌细胞增殖且最佳浓度为200 µg/mL。本研究为成肌细胞高剂量临床应用提供了研究基础，但成肌细胞的大规模扩增还有待进一步研究。
