引用本文： 高尚, 唐康来, 张吉强, 李跑, 杨志金, 崔海峰, 杨明宇, 唐红, 周梅. 不同强度跑台训练对大鼠跟腱微损伤修复影响的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(5): 574-581. doi: 10.7507/1002-1892.201611054 复制
肌腱微损伤是肌腱微观结构的破坏，表现为肌腱纤维变形、分离、断裂，常由反复过度牵拉引起[1-2]。由于细胞外基质等因素改变，肌腱微损伤后得不到有效修复，最终出现局部肿痛、功能障碍等肌腱病表现[3]。目前临床上采用的促进肌腱修复方法主要包括非甾体类抗炎药物治疗、离心性牵伸训练、生物工程治疗以及超声、冲击波理疗等[4-8]，但是由于肌腱损伤修复机制尚不清楚，各种治疗手段均有其局限性。
运动作为一种促进肌腱修复的方法，其有效性已在大量研究中得到了证实[8-11]。与其他治疗方法相比，运动疗法具有简单易行、创伤小、成本低等优点。但目前有关运动强度对肌腱修复影响的研究较少。为此，本研究通过组织学和生物力学观察不同强度运动对大鼠跟腱微损伤修复的影响，为阐明运动促进肌腱损伤修复的机制提供实验依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，体质量 200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供；实验前所有大鼠均进行为期 1 周的适应性跑台训练。Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司，美国），采用 PBS 配制成浓度为 10 mg/mL 的溶液。计算机控制动物实验跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）；微机控制电子万能试验机（深圳瑞格尔仪器有限公司）；光学显微镜（Olympus 公司，日本）；游标卡尺（精确度 0.02 mm；哈尔滨量具刃具有限公司）。
1.2 大鼠跟腱微损伤模型制备
参照 Dirks 等[12]的方法制备大鼠跟腱微损伤模型。72 只大鼠经吸入麻醉后，用 5 号针头经皮在距离腱-骨连接部 2 mm 处的双侧跟腱内，注射浓度为 10 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶溶液 30 μL。注射后饲养 1 周，待急性炎性反应期结束后[12-13]进行分组干预。
为验证模型制备方法有效性，本研究进行了预实验。分别于大鼠右侧跟腱注射浓度为 10 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶溶液 30 μL（实验侧），左侧注射等量 PBS 溶液（对照侧）。注射后 1 周，大体观察见与对照侧相比，实验侧跟腱腱旁组织增生明显，跟腱缺乏光泽；HE 染色示实验侧跟腱纤维排列紊乱、断裂，异常形态细胞增生明显。实验侧符合肌腱微损伤特征，提示模型制备成功。见图 1、2。
图1
预实验跟腱大体观察 左侧：对照侧；右侧：实验侧
Figure1.
Gross observation of Achilles tendons in pre-experiment Leftside: control side; Right side: experimental side
图2
预实验跟腱 HE 染色观察 a. 对照侧（×100）；b. 对照侧（×200）；c. 实验侧（×100）；d. 实验侧（×200）
Figure2.
HE staining of Achilles tendons in pre-experiment a. Control side (×100); b. Control side (×200); c. Experimental side (×100); d. Experimental side (×200)
1.3 实验分组及方法
模型制备后，将 72 只大鼠随机分为 3 组，分别为对照组、低强度组、高强度组，每组 24 只。对照组大鼠正常饲养，可自由活动。低、高强度组采用计算机控制动物实验跑台对大鼠进行被动跑台训练；低强度组跑台强度为 13 m/min、20 min/d[14]，高强度组跑台强度为 17 m/min、60 min/d[15-16]。于被动跑台训练开始即刻及 1、4 周[17]，每组各取 8 只大鼠，给予 CO2 处死后完整取出双侧跟腱；其中，3 只大鼠跟腱行组织学观察，5 只大鼠跟腱行生物力学测试。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 观察各组大鼠存活以及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察 各时间点处死大鼠后，作双侧跟腱正中纵切口，肉眼观察跟腱光泽度以及腱旁组织增生情况。
1.4.3 组织学观察 将跟腱标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h，石蜡包埋，于腱-骨联合近端 2 mm 处沿跟腱纵轴切片，片厚 5 μm，HE 染色，镜下观察组织学变化。采用 Dirks 等[12]的半定量评分方法：在偏光镜下选择病理表现最严重区域，对以下参数进行评分：① 纤维排列（100 倍镜下观察 1 个区域）；② 细胞形态（200 倍镜下观察 4 个区域）；③ 细胞异常增多（100 倍镜下观察 1 个区域）；④ 新生血管量（400 倍镜下观察 10 个区域）。每个参数采用 4 级评分：0 分，正常；1 分，轻度异常；2 分，中度异常；3 分，重度异常。以上 4 个参数评分总和为 0～12 分，其中 0 分代表正常肌腱组织，12 分代表最严重的异常肌腱组织。每个样本均由 2 名独立实验员进行评分，取均值。
1.4.4 生物力学测试 取标本切断跟骨及比目鱼肌-腓肠肌中段，保留完整跟腱组织。去除跖肌腱及跟腱周围组织后，用游标卡尺测量跟腱宽度和厚度，并通过椭圆形公式计算其横截面积。将标本固定于电子万能试验机上，样本两端应用定制夹具固定，夹具表面具有横行突起以防止标本滑脱。以 20 mm/min 速度牵拉跟腱，至跟腱断裂停止。记录整个过程中负荷值变化、最终应力，并绘制应力-应变曲线。计算抗拉强度（最终应力/横截面积）以及弹性模量（由应力-应变曲线初始点对应的切线斜率计算得出[18]）。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
所有大鼠均存活至实验结束。注射后各组大鼠后肢均有跛行，1 周后步态异常明显减轻。在跑台训练过程中，各组大鼠均可自由活动，组间肢体活动频率和活动幅度未见明显差异。
2.2 大体观察
训练开始即刻及 1 周时，各组跟腱标本均表现为腱旁结缔组织增生、肌腱组织颜色暗淡缺乏光泽，组间无明显差异。4 周时，低强度组腱旁增生组织较对照组明显减少；高强度组腱旁结缔组织较低强度组多，并且有大量新生血管形成。见图 3。
图3
各组跟腱大体观察 从左至右分别为对照组、低强度组、高强度组 a. 被动跑台训练 1 周；b. 被动跑台训练 4 周
Figure3.
The gross observations of Achilles tendons in each group From left to right for the control group, the low-intensity group, and the high-intensity group, respectively a. Passive treadmill training for 1 week; b. Passive treadmill training for 4 weeks
2.3 组织学观察
2.3.1 镜下观察 训练开始即刻时，各组跟腱组织纤维排列出现波浪状紊乱，部分纤维断裂，细胞明显增多，部分细胞核变圆。1 周时，各组跟腱组织纤维排列紊乱程度较训练开始时好转，但有明显纤维间隙和断裂，异常细胞明显增多。4 周时，各组观察情况差异明显；对照组跟腱组织纤维仍有部分波浪状紊乱，但异常细胞较前减少；低强度组跟腱组织纤维排列整齐致密，大部分细胞核呈梭形；高强度组仍有较明显的纤维间隙和较多异常细胞。见图 4、5。
图4
被动跑台训练 1 周时各组跟腱HE染色观察 从左至右放大倍数分别为 40、100、200 倍 a. 对照组；b. 低强度组；c. 高强度组
Figure4.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 1 week From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
图5
被动跑台训练 4 周时各组跟腱HE染色观察 从左至右放大倍数分别为 40、100、200 倍 a. 对照组；b. 低强度组；c. 高强度组
Figure5.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 4 weeks From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
2.3.2 半定量评分 训练开始即刻，各组纤维排列、细胞形态、细胞异常增多、新生血管量评分以及总分比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示各组跟腱微损伤模型损伤程度相似，具有可比性。见表 1。
表1
各组训练开始即刻及 1、4 周时组织学染色评分比较（n=3，
）
Table1.
Comparison of histological staining scores between groups at immediate, 1 week, and 4 weeks after training (n=3,
)
训练 1 周时，组织学评分总分比较：各组间差异无统计学意义（P>0.05）。组织学特征参数比较：低、高强度组除新生血管量评分与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）外；其余参数与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。低、高强度组间各参数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
训练 4 周时，组织学评分总分比较：高强度组明显高于对照组、低强度组，对照组显著高于低强度组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。组织学特征参数比较：低强度组纤维排列、细胞形态、细胞异常增多、新生血管量评分与对照组、高强度组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；而高强度组仅细胞异常增多评分与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
2.4 生物力学测试
训练开始即刻及 1 周时，各组跟腱横截面积、最终应力、抗拉强度及弹性模量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4 周时，低强度组最终应力及抗拉强度较对照组明显升高，最终应力及弹性模量较高强度组明显升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余各指标组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 6。
图6
各组生物力学测试 a. 跟腱横截面积；b. 最终应力；c. 抗拉强度；d. 弹性模量
Figure6.
Biomechanical testing of Achilles tendons in each group a. Cross sectional area; b. Ultimate force; c. Tensile strength; d. Elastic modulus
3 讨论
研究表明，不同运动强度对肌腱损伤修复过程的影响亦不同[19]。一方面，运动可以促进胶原蛋白合成，防止肌腱退变[20]；另一方面，过度运动会促进金属蛋白酶释放，导致胶原蛋白破坏[21]。因此，明确有助于肌腱微损伤修复的运动强度是进一步研究肌腱修复机制的前提。
各种实验动物的运动能力不同，其肌腱对运动的适应能力也不同。以实验室常用的大鼠为例，不同运动强度对其肌腱生理功能的影响仍存在争议。Soslowsky 等[22]利用被动下坡跑台诱导大鼠冈上肌腱形成肌腱病；Glazebrook 等[15]利用上坡高强度被动跑台使大鼠跟腱出现了类似于人类肌腱病的组织病理学表现。但是 Heinemeier 等[16]同样采用上坡高强度被动跑台方法却未能诱导出大鼠跟腱病理学改变，并且他们认为大鼠适应了这种运动强度，跟腱的生物力学特性得到了增强。另外，Dirks 等[23]对高运动能力大鼠进行高强度跑台训练，但也未成功诱导出大鼠跟腱病理变化。Godbout 等[24]认为早期自主运动不能促进胶原酶诱导的 Wistar 大鼠跟腱微损伤愈合，Dirks 等[12]则认为高强度跑台训练不会加剧高运动能力大鼠跟腱的损伤。
为了阐明不同强度跑台训练对大鼠跟腱微损伤修复的影响，本实验参照上述研究方法，选择高强度（17 m/min、60 min/d）[15-16]及低强度（13 m/min、20 min/d）[14]被动跑台训练作为影响因素，观察不同运动强度对已存在的跟腱微损伤修复的影响。关于观测时间的选择，Lui 等[13]研究表明，大鼠跟腱注射胶原酶溶液后 3 d 出现白细胞浸润炎性反应，7 d 后恢复至正常水平；Dirks 等[12]的研究选择注射胶原酶溶液后 9 d 左右炎性期结束时进行后续实验；同时，结合胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤模型具有自愈能力，本研究最终选择胶原酶溶液注射后 1 周进行干预。
本研究结果显示，训练 1 周后，各组跟腱组织在外观、病理学表现、生物力学方面未出现显著变化。但 4 周时各组间差异明显，其中低强度组跟腱组织在外观、病理学表现及生物力学方面均较对照组有明显改善，提示低强度（13m/min、20 min/d）被动跑台训练可以有效促进肌腱微损伤的修复，该结果与 Zhang 等[14]的研究结果一致，其研究发现该运动强度也能促进老龄大鼠损伤髌腱的修复。而高强度组大鼠跟腱组织不仅在生物力学方面与对照组无统计学差异，大体观察及组织学观察还发现，该强度跑台训练后在一定程度上延迟甚至阻碍了跟腱微损伤的修复，具体表现为腱旁组织增生、组织病理学评分更差。该结果与 Dirks 等[12]发现高强度跑台未加剧胶原酶诱导的跟腱病理变化不一致，可能与其使用的实验动物为经筛选后的高运动能力大鼠有关。
另外，我们发现跑台训练对微损伤肌腱的影响表现为新生血管增多、细胞增多，且该影响随时间延长而逐渐增大，并持续至实验结束。提示运动疗法可能是通过某些途径加速了跟腱组织的代谢能力，促进了局部细胞增殖、分化或者募集，以达到修复损伤跟腱组织的目的。2007 年 Bi 等[25]发现了存在于肌腱中的祖细胞——肌腱干细胞，并认为其在肌腱修复过程中起重要作用。之后学者们对机械应力条件下肌腱干细胞特性的变化进行了相关研究。Zhang 等[17]发现在适度牵拉条件下，可以有效促进肌腱干细胞向成肌腱方向分化，通过对小鼠跑台训练发现肌腱的成肌腱成分较成骨、成软骨、成肌腱等异常分化方向明显减少。提示运动不仅会影响肌腱组织，同时可能也影响肌腱干细胞，从而促进了损伤肌腱的修复。Rui 等[26]发现胶原酶诱导的微损伤肌腱中，肌腱干细胞分化倾向发生了变化。因此通过进一步研究运动是否会影响细胞外基质，导致肌腱干细胞募集、增殖、分化的改变，是否纠正了受损肌腱干细胞的分化以及其修复机制，有望明确运动对肌腱微损伤修复的影响。
综上述，不同强度跑台训练对于胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤修复的影响也不同，低强度运动可以在一定程度上促进微损伤肌腱的修复，但具体作用机制还需进一步深入研究。另外，本研究也存在一定局限性，考虑到大鼠跟腱微损伤模型具有自愈性，本研究仅进行了 4 周跑台训练，观察时间较短；另外，研究仅设置了 2 个跑台强度，因此需要针对不同实验动物选择更多运动强度进行干预观察。
肌腱微损伤是肌腱微观结构的破坏，表现为肌腱纤维变形、分离、断裂，常由反复过度牵拉引起[1-2]。由于细胞外基质等因素改变，肌腱微损伤后得不到有效修复，最终出现局部肿痛、功能障碍等肌腱病表现[3]。目前临床上采用的促进肌腱修复方法主要包括非甾体类抗炎药物治疗、离心性牵伸训练、生物工程治疗以及超声、冲击波理疗等[4-8]，但是由于肌腱损伤修复机制尚不清楚，各种治疗手段均有其局限性。
运动作为一种促进肌腱修复的方法，其有效性已在大量研究中得到了证实[8-11]。与其他治疗方法相比，运动疗法具有简单易行、创伤小、成本低等优点。但目前有关运动强度对肌腱修复影响的研究较少。为此，本研究通过组织学和生物力学观察不同强度运动对大鼠跟腱微损伤修复的影响，为阐明运动促进肌腱损伤修复的机制提供实验依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，体质量 200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供；实验前所有大鼠均进行为期 1 周的适应性跑台训练。Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司，美国），采用 PBS 配制成浓度为 10 mg/mL 的溶液。计算机控制动物实验跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司）；微机控制电子万能试验机（深圳瑞格尔仪器有限公司）；光学显微镜（Olympus 公司，日本）；游标卡尺（精确度 0.02 mm；哈尔滨量具刃具有限公司）。
1.2 大鼠跟腱微损伤模型制备
参照 Dirks 等[12]的方法制备大鼠跟腱微损伤模型。72 只大鼠经吸入麻醉后，用 5 号针头经皮在距离腱-骨连接部 2 mm 处的双侧跟腱内，注射浓度为 10 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶溶液 30 μL。注射后饲养 1 周，待急性炎性反应期结束后[12-13]进行分组干预。
为验证模型制备方法有效性，本研究进行了预实验。分别于大鼠右侧跟腱注射浓度为 10 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶溶液 30 μL（实验侧），左侧注射等量 PBS 溶液（对照侧）。注射后 1 周，大体观察见与对照侧相比，实验侧跟腱腱旁组织增生明显，跟腱缺乏光泽；HE 染色示实验侧跟腱纤维排列紊乱、断裂，异常形态细胞增生明显。实验侧符合肌腱微损伤特征，提示模型制备成功。见图 1、2。
图1
预实验跟腱大体观察 左侧：对照侧；右侧：实验侧
Figure1.
Gross observation of Achilles tendons in pre-experiment Leftside: control side; Right side: experimental side
图2
预实验跟腱 HE 染色观察 a. 对照侧（×100）；b. 对照侧（×200）；c. 实验侧（×100）；d. 实验侧（×200）
Figure2.
HE staining of Achilles tendons in pre-experiment a. Control side (×100); b. Control side (×200); c. Experimental side (×100); d. Experimental side (×200)
1.3 实验分组及方法
模型制备后，将 72 只大鼠随机分为 3 组，分别为对照组、低强度组、高强度组，每组 24 只。对照组大鼠正常饲养，可自由活动。低、高强度组采用计算机控制动物实验跑台对大鼠进行被动跑台训练；低强度组跑台强度为 13 m/min、20 min/d[14]，高强度组跑台强度为 17 m/min、60 min/d[15-16]。于被动跑台训练开始即刻及 1、4 周[17]，每组各取 8 只大鼠，给予 CO2 处死后完整取出双侧跟腱；其中，3 只大鼠跟腱行组织学观察，5 只大鼠跟腱行生物力学测试。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 观察各组大鼠存活以及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察 各时间点处死大鼠后，作双侧跟腱正中纵切口，肉眼观察跟腱光泽度以及腱旁组织增生情况。
1.4.3 组织学观察 将跟腱标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h，石蜡包埋，于腱-骨联合近端 2 mm 处沿跟腱纵轴切片，片厚 5 μm，HE 染色，镜下观察组织学变化。采用 Dirks 等[12]的半定量评分方法：在偏光镜下选择病理表现最严重区域，对以下参数进行评分：① 纤维排列（100 倍镜下观察 1 个区域）；② 细胞形态（200 倍镜下观察 4 个区域）；③ 细胞异常增多（100 倍镜下观察 1 个区域）；④ 新生血管量（400 倍镜下观察 10 个区域）。每个参数采用 4 级评分：0 分，正常；1 分，轻度异常；2 分，中度异常；3 分，重度异常。以上 4 个参数评分总和为 0～12 分，其中 0 分代表正常肌腱组织，12 分代表最严重的异常肌腱组织。每个样本均由 2 名独立实验员进行评分，取均值。
1.4.4 生物力学测试 取标本切断跟骨及比目鱼肌-腓肠肌中段，保留完整跟腱组织。去除跖肌腱及跟腱周围组织后，用游标卡尺测量跟腱宽度和厚度，并通过椭圆形公式计算其横截面积。将标本固定于电子万能试验机上，样本两端应用定制夹具固定，夹具表面具有横行突起以防止标本滑脱。以 20 mm/min 速度牵拉跟腱，至跟腱断裂停止。记录整个过程中负荷值变化、最终应力，并绘制应力-应变曲线。计算抗拉强度（最终应力/横截面积）以及弹性模量（由应力-应变曲线初始点对应的切线斜率计算得出[18]）。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
所有大鼠均存活至实验结束。注射后各组大鼠后肢均有跛行，1 周后步态异常明显减轻。在跑台训练过程中，各组大鼠均可自由活动，组间肢体活动频率和活动幅度未见明显差异。
2.2 大体观察
训练开始即刻及 1 周时，各组跟腱标本均表现为腱旁结缔组织增生、肌腱组织颜色暗淡缺乏光泽，组间无明显差异。4 周时，低强度组腱旁增生组织较对照组明显减少；高强度组腱旁结缔组织较低强度组多，并且有大量新生血管形成。见图 3。
图3
各组跟腱大体观察 从左至右分别为对照组、低强度组、高强度组 a. 被动跑台训练 1 周；b. 被动跑台训练 4 周
Figure3.
The gross observations of Achilles tendons in each group From left to right for the control group, the low-intensity group, and the high-intensity group, respectively a. Passive treadmill training for 1 week; b. Passive treadmill training for 4 weeks
2.3 组织学观察
2.3.1 镜下观察 训练开始即刻时，各组跟腱组织纤维排列出现波浪状紊乱，部分纤维断裂，细胞明显增多，部分细胞核变圆。1 周时，各组跟腱组织纤维排列紊乱程度较训练开始时好转，但有明显纤维间隙和断裂，异常细胞明显增多。4 周时，各组观察情况差异明显；对照组跟腱组织纤维仍有部分波浪状紊乱，但异常细胞较前减少；低强度组跟腱组织纤维排列整齐致密，大部分细胞核呈梭形；高强度组仍有较明显的纤维间隙和较多异常细胞。见图 4、5。
图4
被动跑台训练 1 周时各组跟腱HE染色观察 从左至右放大倍数分别为 40、100、200 倍 a. 对照组；b. 低强度组；c. 高强度组
Figure4.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 1 week From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
图5
被动跑台训练 4 周时各组跟腱HE染色观察 从左至右放大倍数分别为 40、100、200 倍 a. 对照组；b. 低强度组；c. 高强度组
Figure5.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 4 weeks From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
2.3.2 半定量评分 训练开始即刻，各组纤维排列、细胞形态、细胞异常增多、新生血管量评分以及总分比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示各组跟腱微损伤模型损伤程度相似，具有可比性。见表 1。
表1
各组训练开始即刻及 1、4 周时组织学染色评分比较（n=3，
）
Table1.
Comparison of histological staining scores between groups at immediate, 1 week, and 4 weeks after training (n=3,
)
训练 1 周时，组织学评分总分比较：各组间差异无统计学意义（P>0.05）。组织学特征参数比较：低、高强度组除新生血管量评分与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）外；其余参数与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。低、高强度组间各参数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
训练 4 周时，组织学评分总分比较：高强度组明显高于对照组、低强度组，对照组显著高于低强度组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。组织学特征参数比较：低强度组纤维排列、细胞形态、细胞异常增多、新生血管量评分与对照组、高强度组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；而高强度组仅细胞异常增多评分与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
2.4 生物力学测试
训练开始即刻及 1 周时，各组跟腱横截面积、最终应力、抗拉强度及弹性模量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4 周时，低强度组最终应力及抗拉强度较对照组明显升高，最终应力及弹性模量较高强度组明显升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余各指标组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 6。
图6
各组生物力学测试 a. 跟腱横截面积；b. 最终应力；c. 抗拉强度；d. 弹性模量
Figure6.
Biomechanical testing of Achilles tendons in each group a. Cross sectional area; b. Ultimate force; c. Tensile strength; d. Elastic modulus
3 讨论
研究表明，不同运动强度对肌腱损伤修复过程的影响亦不同[19]。一方面，运动可以促进胶原蛋白合成，防止肌腱退变[20]；另一方面，过度运动会促进金属蛋白酶释放，导致胶原蛋白破坏[21]。因此，明确有助于肌腱微损伤修复的运动强度是进一步研究肌腱修复机制的前提。
各种实验动物的运动能力不同，其肌腱对运动的适应能力也不同。以实验室常用的大鼠为例，不同运动强度对其肌腱生理功能的影响仍存在争议。Soslowsky 等[22]利用被动下坡跑台诱导大鼠冈上肌腱形成肌腱病；Glazebrook 等[15]利用上坡高强度被动跑台使大鼠跟腱出现了类似于人类肌腱病的组织病理学表现。但是 Heinemeier 等[16]同样采用上坡高强度被动跑台方法却未能诱导出大鼠跟腱病理学改变，并且他们认为大鼠适应了这种运动强度，跟腱的生物力学特性得到了增强。另外，Dirks 等[23]对高运动能力大鼠进行高强度跑台训练，但也未成功诱导出大鼠跟腱病理变化。Godbout 等[24]认为早期自主运动不能促进胶原酶诱导的 Wistar 大鼠跟腱微损伤愈合，Dirks 等[12]则认为高强度跑台训练不会加剧高运动能力大鼠跟腱的损伤。
为了阐明不同强度跑台训练对大鼠跟腱微损伤修复的影响，本实验参照上述研究方法，选择高强度（17 m/min、60 min/d）[15-16]及低强度（13 m/min、20 min/d）[14]被动跑台训练作为影响因素，观察不同运动强度对已存在的跟腱微损伤修复的影响。关于观测时间的选择，Lui 等[13]研究表明，大鼠跟腱注射胶原酶溶液后 3 d 出现白细胞浸润炎性反应，7 d 后恢复至正常水平；Dirks 等[12]的研究选择注射胶原酶溶液后 9 d 左右炎性期结束时进行后续实验；同时，结合胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤模型具有自愈能力，本研究最终选择胶原酶溶液注射后 1 周进行干预。
本研究结果显示，训练 1 周后，各组跟腱组织在外观、病理学表现、生物力学方面未出现显著变化。但 4 周时各组间差异明显，其中低强度组跟腱组织在外观、病理学表现及生物力学方面均较对照组有明显改善，提示低强度（13m/min、20 min/d）被动跑台训练可以有效促进肌腱微损伤的修复，该结果与 Zhang 等[14]的研究结果一致，其研究发现该运动强度也能促进老龄大鼠损伤髌腱的修复。而高强度组大鼠跟腱组织不仅在生物力学方面与对照组无统计学差异，大体观察及组织学观察还发现，该强度跑台训练后在一定程度上延迟甚至阻碍了跟腱微损伤的修复，具体表现为腱旁组织增生、组织病理学评分更差。该结果与 Dirks 等[12]发现高强度跑台未加剧胶原酶诱导的跟腱病理变化不一致，可能与其使用的实验动物为经筛选后的高运动能力大鼠有关。
另外，我们发现跑台训练对微损伤肌腱的影响表现为新生血管增多、细胞增多，且该影响随时间延长而逐渐增大，并持续至实验结束。提示运动疗法可能是通过某些途径加速了跟腱组织的代谢能力，促进了局部细胞增殖、分化或者募集，以达到修复损伤跟腱组织的目的。2007 年 Bi 等[25]发现了存在于肌腱中的祖细胞——肌腱干细胞，并认为其在肌腱修复过程中起重要作用。之后学者们对机械应力条件下肌腱干细胞特性的变化进行了相关研究。Zhang 等[17]发现在适度牵拉条件下，可以有效促进肌腱干细胞向成肌腱方向分化，通过对小鼠跑台训练发现肌腱的成肌腱成分较成骨、成软骨、成肌腱等异常分化方向明显减少。提示运动不仅会影响肌腱组织，同时可能也影响肌腱干细胞，从而促进了损伤肌腱的修复。Rui 等[26]发现胶原酶诱导的微损伤肌腱中，肌腱干细胞分化倾向发生了变化。因此通过进一步研究运动是否会影响细胞外基质，导致肌腱干细胞募集、增殖、分化的改变，是否纠正了受损肌腱干细胞的分化以及其修复机制，有望明确运动对肌腱微损伤修复的影响。
综上述，不同强度跑台训练对于胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤修复的影响也不同，低强度运动可以在一定程度上促进微损伤肌腱的修复，但具体作用机制还需进一步深入研究。另外，本研究也存在一定局限性，考虑到大鼠跟腱微损伤模型具有自愈性，本研究仅进行了 4 周跑台训练，观察时间较短；另外，研究仅设置了 2 个跑台强度，因此需要针对不同实验动物选择更多运动强度进行干预观察。
