引用本文： 黄世福, 蔡风, 程昭贤, 周荣平, 郝亮. 熊果酸对人骨肉瘤细胞 U2-OS 增殖及凋亡的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(11): 1371-1376. doi: 10.7507/1002-1892.201704089 复制
骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性骨肿瘤，发病率居原发性骨肿瘤首位[1]。目前骨肉瘤的主要治疗方法是手术和新辅助化疗，但 5 年生存率仍然维持在 60%～70%[2]。研究表明，中医药治疗肿瘤具有减少放、化疗副作用以及提高患者免疫功能的优势[3]。熊果酸又名乌索酸，属五环三萜类化合物，主要存在于茶树、果树、药用植物、香草植物及泡桐等，易于获得和提取[4]。熊果酸具有广泛的生物学活性，能抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂、镇静、增强免疫力等[5]，还对多种致癌、促癌物有抵抗作用[6]。有研究发现浓度为 10 μmol/L 和 20 μmol/L 的熊果酸能明显抑制结肠癌细胞株 HT-29 细胞的生长[7]，还对乳腺癌、白血病、前列腺癌、肝癌等肿瘤具有抗肿瘤作用[8-12]，但熊果酸对骨肉瘤细胞的作用目前还不明确。本研究旨在观察熊果酸对骨肉瘤细胞 U2-OS 增殖及凋亡的影响，探讨其作用机制，为熊果酸用于临床治疗骨肉瘤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
熊果酸、DMSO 均购于西格玛奥德里奇（中国）化工有限公司。将熊果酸溶解于 DMSO 中并于－20℃ 保存。实验前，取熊果酸溶液稀释于 DMEM 培养基，获得实验所需的不同终浓度熊果酸，控制培养基中载体溶剂 DMSO 浓度为 0.1%。
DMEM（GIBCO 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞周期检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒（上海贝博生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗人 cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 多克隆抗体（Proteintech 公司，美国）；山羊抗兔 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Trizol 试剂、化学发光检测试剂盒（北京天根生物科技有限公司）。酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。
1.2 细胞培养及分组
实验用人骨肉瘤细胞株 U2-OS 购自中国科学院上海生命科学研究院。将细胞置于 37℃、5%CO2 培养箱中，用含 100 U/mL 青-链霉素、10%FBS 的 DMEM 培养并传代。根据熊果酸处理浓度不同，将细胞分为 4 组，分别为 0、10、20、40 μmol/L 浓度组。取 U2-OS 细胞按 1×104个/孔接种至 96 孔板，根据分组采用含不同浓度熊果酸的培养基培养。
1.3 观测指标
1.3.1 CCK-8 法检测细胞活力
培养 0、24、48、72 h，各组取 3 孔细胞，按照 CCK-8 试剂盒说明书处理后，酶标仪检测 450 nm 处吸光度（A）值。
1.3.2 流式细胞术检测细胞周期
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，PBS 洗涤 1 次，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，重悬细胞使其为单细胞悬液，并调整细胞浓度为 1×106个/mL，70% 乙醇固定，4℃ 保存。染色前用 PBS 洗去固定液，加 100 μL RNase A 37℃ 水浴 30 min，再加入 400 μL PI 染色混匀，4℃ 避光 30 min，用流式细胞仪检测，记录激发波长 488 nm 处红色荧光。
1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃培养基，用冷 PBS 洗涤细胞 2 次，然后用 400 μL Binding Buffer 重悬浮细胞，使其为单细胞悬液，并调整细胞浓度为 1×106个/mL；在细胞悬液中加入 5 μL Annexin V-FITC，混匀后于 4℃ 避光条件下孵育 15 min；加入 10 μL PI 混匀，于 4℃ 避光条件下孵育 5 min；用流式细胞仪采集数据，并用 Cell Quest 专用软件分析，通过计数凋亡区细胞测算细胞凋亡率。
1.3.4 实时荧光定量 PCR 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表达
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，Trizol 试剂提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒将其反转录成 cDNA，反应条件：37℃、15 min，85℃、5 s，随后以此 cDNA 为模板进行 RT-PCR。PCR 反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40 个循环。以 GAPDH 作为参照，采用 2–ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量。cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。
表1
基因引物序列及长度
Table1.
Primer sequence and length of targeted genes
1.3.5 Western blot 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，提取细胞总蛋白，10%SDS-PAGE 胶提取适量蛋白质分离，转移至聚偏二氟乙烯膜，封闭液封闭 1 h；将膜浸入含 1∶1 000 兔抗人 cyclin D1、Caspase-3 或 GAPDH 抗体的一抗稀释液中，4℃ 孵育过夜；将膜取出用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min，按 1∶1 000 稀释浓度加入羊抗兔 IgG（二抗），室温孵育 1 h；然后用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min；弃漂洗液，加入化学发光试剂显影成像，Image Lab 软件分析蛋白条带灰度值。以与 GAPDH 条带灰度值的比值作为目的蛋白 cyclin D1 及 Caspase-3 前体（pro-Caspase-3）、活化的 Caspase-3（activated Caspase-3）相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 Tukey 法或 Dunnett-t 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 CCK-8 法检测细胞活力
培养 0、24 h 时，各组 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）；48、72 h 时，随浓度增加，A 值逐渐减小，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
图1
CCK-8 法检测各组 U2-OS 细胞增殖情况
Figure1.
The proliferation of U2-OS cells were detected by CCK-8 assay
2.2 流式细胞术检测细胞周期及凋亡
随浓度增加，U2-OS 细胞的 G1 期增加、S 期及 G2/M 期减少，细胞凋亡率逐渐增加；各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2、3 及表 2。
表2
各组细胞周期及细胞凋亡率比较（n=3，%，
）
Table2.
Comparison of cell cycle and apoptosis rate between groups (n=3, %,
)
图2
流式细胞术检测各组细胞周期
a. 0 μmol/L 组；b. 10 μmol/L 组；c. 20 μmol/L 组；d. 40 μmol/L 组
Figure2. The cell cycle of each group was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
图3
流式细胞术检测各组细胞凋亡
a. 0 μmol/L 组；b. 10 μmol/L 组；c. 20 μmol/L 组；d. 40 μmol/L 组
Figure3. The cell apoptosis was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
2.3 实时荧光定量 PCR 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表达
与 0 μmol/L 组相比，10、20、40 μmol/L 组 cyclin D1 mRNA 相对表达量明显下调，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。各组间 Caspase-3 mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图4
实时荧光定量 RT-PCR 检测各组 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 相对表达量
a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure4. The relative expressions of cyclin D1 and Caspase-3 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. cyclin D1; b. Caspase-3
2.4 Western blot 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
随浓度增加，各组 cyclin D1、pro-Caspase-3 蛋白相对表达量下调，activated Caspase-3 蛋白相对表达量增加，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、表 3。
表3
各组 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白相对表达量比较（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative expressions of cyclin D1 and Cas-pase-3 proteins between groups (n=3,
)
图5
Western blot 检测各组 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
1：0 μmol/L 组 2：10 μmol/L 组 3：20 μmol/L 组4：40 μmol/L 组 a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure5. The protein expressions of cyclin D1 and Caspase-3 were detected by Western blot1: 0 μmol/L group 2: 10 μmol/L group 3: 20 μmol/L group 4: 40 μmol/L group a. cyclin D1; b. Caspase-3
3 讨论
近年来，熊果酸因具有抗肿瘤作用而日益受到关注。一项最新的一期药代动力学研究已经获得了熊果酸药物作用剂量，并证实了重复使用熊果酸不会导致体内堆积[13]。然而，熊果酸具体的抗肿瘤作用机制仍不清楚，需要深入研究。
许多研究已经表明，熊果酸能够抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡 [14-16]。我们实验也发现，熊果酸能够抑制骨肉瘤细胞 U2-OS 的增殖，使细胞周期阻滞在 G1 期，诱导细胞凋亡增加，而且熊果酸浓度越高，对骨肉瘤细胞增殖抑制作用越强，细胞凋亡率越高。值得注意的是，因为我们使用的熊果酸是中药提纯后的单体药物，需要经过一定的反应时间才能发挥刺激细胞作用，进而引起细胞内发生改变。所以在培养前 24 h 内，未观测到熊果酸对骨肉瘤细胞增殖的影响；但 48 h 后熊果酸处理组细胞增殖能力明显下降，说明熊果酸能抑制骨肉瘤细胞的增殖。然而，我们只在体外实验中发现了熊果酸对骨肉瘤细胞的增殖抑制和促进凋亡的作用，还缺少在体实验证据，有待于进一步研究。
细胞无限增殖是肿瘤形成的十大特征之一，导致肿瘤细胞无限增殖的主要原因有两个，一个是肿瘤细胞周期调节失控，另一个是肿瘤细胞正常的凋亡过程被抑制。本实验中我们发现熊果酸能抑制 U2-OS 细胞增殖。为了解释这个现象，我们检测不同浓度处理组细胞周期蛋白 cyclin D1 和凋亡相关蛋白 Caspase-3 的表达，因为 cyclin D1 是调控细胞周期 G1期的关键蛋白，当 cyclin D1 表达下降时细胞将不容易通过 G1 期检查点，从而导致细胞周期阻滞在 G1 期[16]；而 Caspase-3 能切断与 DNA 修复、基因完整性监护有关的多聚 ADP 核糖聚合酶，从而触发细胞凋亡[17]。熊果酸处理后的 U2-OS 细胞其 cyclin D1 表达量明显下降，且浓度越高 cyclin D1 下降越明显。这与流式检测细胞周期结果一致，熊果酸使细胞中 cyclin D1 表达量下调，从而使细胞周期阻滞在 G1 期。而另一方面，熊果酸处理后虽然不能改变细胞 Caspase-3 mRNA 的表达，但是能使 activated Caspase-3 蛋白表达升高。而真正发挥剪切功能的正是 activated Caspase-3，从而导致细胞发生凋亡，这也与流式检测细胞凋亡发现的结果一致。本实验发现熊果酸是通过下调 cyclin D1 的表达以及激活 Caspase-3 使得骨肉瘤细胞增殖抑制、凋亡增加，从而发挥抑制骨肉瘤的作用。然而，熊果酸调控 cyclin D1 和 Caspase-3 具体机制还有待深入研究。
综上述，本实验验证了熊果酸能够使骨肉瘤细胞 U2-OS 的增殖受到抑制，同时证明了熊果酸是通过下调 cyclin D1 的表达使 U2-OS 细胞周期阻滞在 G1 期、促进 Caspase-3 的活化，进而使细胞凋亡增加。
骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性骨肿瘤，发病率居原发性骨肿瘤首位[1]。目前骨肉瘤的主要治疗方法是手术和新辅助化疗，但 5 年生存率仍然维持在 60%～70%[2]。研究表明，中医药治疗肿瘤具有减少放、化疗副作用以及提高患者免疫功能的优势[3]。熊果酸又名乌索酸，属五环三萜类化合物，主要存在于茶树、果树、药用植物、香草植物及泡桐等，易于获得和提取[4]。熊果酸具有广泛的生物学活性，能抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂、镇静、增强免疫力等[5]，还对多种致癌、促癌物有抵抗作用[6]。有研究发现浓度为 10 μmol/L 和 20 μmol/L 的熊果酸能明显抑制结肠癌细胞株 HT-29 细胞的生长[7]，还对乳腺癌、白血病、前列腺癌、肝癌等肿瘤具有抗肿瘤作用[8-12]，但熊果酸对骨肉瘤细胞的作用目前还不明确。本研究旨在观察熊果酸对骨肉瘤细胞 U2-OS 增殖及凋亡的影响，探讨其作用机制，为熊果酸用于临床治疗骨肉瘤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
熊果酸、DMSO 均购于西格玛奥德里奇（中国）化工有限公司。将熊果酸溶解于 DMSO 中并于－20℃ 保存。实验前，取熊果酸溶液稀释于 DMEM 培养基，获得实验所需的不同终浓度熊果酸，控制培养基中载体溶剂 DMSO 浓度为 0.1%。
DMEM（GIBCO 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞周期检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒（上海贝博生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗人 cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 多克隆抗体（Proteintech 公司，美国）；山羊抗兔 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Trizol 试剂、化学发光检测试剂盒（北京天根生物科技有限公司）。酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。
1.2 细胞培养及分组
实验用人骨肉瘤细胞株 U2-OS 购自中国科学院上海生命科学研究院。将细胞置于 37℃、5%CO2 培养箱中，用含 100 U/mL 青-链霉素、10%FBS 的 DMEM 培养并传代。根据熊果酸处理浓度不同，将细胞分为 4 组，分别为 0、10、20、40 μmol/L 浓度组。取 U2-OS 细胞按 1×104个/孔接种至 96 孔板，根据分组采用含不同浓度熊果酸的培养基培养。
1.3 观测指标
1.3.1 CCK-8 法检测细胞活力
培养 0、24、48、72 h，各组取 3 孔细胞，按照 CCK-8 试剂盒说明书处理后，酶标仪检测 450 nm 处吸光度（A）值。
1.3.2 流式细胞术检测细胞周期
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，PBS 洗涤 1 次，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，重悬细胞使其为单细胞悬液，并调整细胞浓度为 1×106个/mL，70% 乙醇固定，4℃ 保存。染色前用 PBS 洗去固定液，加 100 μL RNase A 37℃ 水浴 30 min，再加入 400 μL PI 染色混匀，4℃ 避光 30 min，用流式细胞仪检测，记录激发波长 488 nm 处红色荧光。
1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃培养基，用冷 PBS 洗涤细胞 2 次，然后用 400 μL Binding Buffer 重悬浮细胞，使其为单细胞悬液，并调整细胞浓度为 1×106个/mL；在细胞悬液中加入 5 μL Annexin V-FITC，混匀后于 4℃ 避光条件下孵育 15 min；加入 10 μL PI 混匀，于 4℃ 避光条件下孵育 5 min；用流式细胞仪采集数据，并用 Cell Quest 专用软件分析，通过计数凋亡区细胞测算细胞凋亡率。
1.3.4 实时荧光定量 PCR 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表达
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，Trizol 试剂提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒将其反转录成 cDNA，反应条件：37℃、15 min，85℃、5 s，随后以此 cDNA 为模板进行 RT-PCR。PCR 反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40 个循环。以 GAPDH 作为参照，采用 2–ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量。cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。
表1
基因引物序列及长度
Table1.
Primer sequence and length of targeted genes
1.3.5 Western blot 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
培养 48 h，各组取 3 孔细胞，提取细胞总蛋白，10%SDS-PAGE 胶提取适量蛋白质分离，转移至聚偏二氟乙烯膜，封闭液封闭 1 h；将膜浸入含 1∶1 000 兔抗人 cyclin D1、Caspase-3 或 GAPDH 抗体的一抗稀释液中，4℃ 孵育过夜；将膜取出用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min，按 1∶1 000 稀释浓度加入羊抗兔 IgG（二抗），室温孵育 1 h；然后用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min；弃漂洗液，加入化学发光试剂显影成像，Image Lab 软件分析蛋白条带灰度值。以与 GAPDH 条带灰度值的比值作为目的蛋白 cyclin D1 及 Caspase-3 前体（pro-Caspase-3）、活化的 Caspase-3（activated Caspase-3）相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 Tukey 法或 Dunnett-t 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 CCK-8 法检测细胞活力
培养 0、24 h 时，各组 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）；48、72 h 时，随浓度增加，A 值逐渐减小，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
图1
CCK-8 法检测各组 U2-OS 细胞增殖情况
Figure1.
The proliferation of U2-OS cells were detected by CCK-8 assay
2.2 流式细胞术检测细胞周期及凋亡
随浓度增加，U2-OS 细胞的 G1 期增加、S 期及 G2/M 期减少，细胞凋亡率逐渐增加；各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2、3 及表 2。
表2
各组细胞周期及细胞凋亡率比较（n=3，%，
）
Table2.
Comparison of cell cycle and apoptosis rate between groups (n=3, %,
)
图2
流式细胞术检测各组细胞周期
a. 0 μmol/L 组；b. 10 μmol/L 组；c. 20 μmol/L 组；d. 40 μmol/L 组
Figure2. The cell cycle of each group was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
图3
流式细胞术检测各组细胞凋亡
a. 0 μmol/L 组；b. 10 μmol/L 组；c. 20 μmol/L 组；d. 40 μmol/L 组
Figure3. The cell apoptosis was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
2.3 实时荧光定量 PCR 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表达
与 0 μmol/L 组相比，10、20、40 μmol/L 组 cyclin D1 mRNA 相对表达量明显下调，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。各组间 Caspase-3 mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图4
实时荧光定量 RT-PCR 检测各组 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 相对表达量
a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure4. The relative expressions of cyclin D1 and Caspase-3 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. cyclin D1; b. Caspase-3
2.4 Western blot 检测 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
随浓度增加，各组 cyclin D1、pro-Caspase-3 蛋白相对表达量下调，activated Caspase-3 蛋白相对表达量增加，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、表 3。
表3
各组 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白相对表达量比较（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative expressions of cyclin D1 and Cas-pase-3 proteins between groups (n=3,
)
图5
Western blot 检测各组 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表达
1：0 μmol/L 组 2：10 μmol/L 组 3：20 μmol/L 组4：40 μmol/L 组 a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure5. The protein expressions of cyclin D1 and Caspase-3 were detected by Western blot1: 0 μmol/L group 2: 10 μmol/L group 3: 20 μmol/L group 4: 40 μmol/L group a. cyclin D1; b. Caspase-3
3 讨论
近年来，熊果酸因具有抗肿瘤作用而日益受到关注。一项最新的一期药代动力学研究已经获得了熊果酸药物作用剂量，并证实了重复使用熊果酸不会导致体内堆积[13]。然而，熊果酸具体的抗肿瘤作用机制仍不清楚，需要深入研究。
许多研究已经表明，熊果酸能够抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡 [14-16]。我们实验也发现，熊果酸能够抑制骨肉瘤细胞 U2-OS 的增殖，使细胞周期阻滞在 G1 期，诱导细胞凋亡增加，而且熊果酸浓度越高，对骨肉瘤细胞增殖抑制作用越强，细胞凋亡率越高。值得注意的是，因为我们使用的熊果酸是中药提纯后的单体药物，需要经过一定的反应时间才能发挥刺激细胞作用，进而引起细胞内发生改变。所以在培养前 24 h 内，未观测到熊果酸对骨肉瘤细胞增殖的影响；但 48 h 后熊果酸处理组细胞增殖能力明显下降，说明熊果酸能抑制骨肉瘤细胞的增殖。然而，我们只在体外实验中发现了熊果酸对骨肉瘤细胞的增殖抑制和促进凋亡的作用，还缺少在体实验证据，有待于进一步研究。
细胞无限增殖是肿瘤形成的十大特征之一，导致肿瘤细胞无限增殖的主要原因有两个，一个是肿瘤细胞周期调节失控，另一个是肿瘤细胞正常的凋亡过程被抑制。本实验中我们发现熊果酸能抑制 U2-OS 细胞增殖。为了解释这个现象，我们检测不同浓度处理组细胞周期蛋白 cyclin D1 和凋亡相关蛋白 Caspase-3 的表达，因为 cyclin D1 是调控细胞周期 G1期的关键蛋白，当 cyclin D1 表达下降时细胞将不容易通过 G1 期检查点，从而导致细胞周期阻滞在 G1 期[16]；而 Caspase-3 能切断与 DNA 修复、基因完整性监护有关的多聚 ADP 核糖聚合酶，从而触发细胞凋亡[17]。熊果酸处理后的 U2-OS 细胞其 cyclin D1 表达量明显下降，且浓度越高 cyclin D1 下降越明显。这与流式检测细胞周期结果一致，熊果酸使细胞中 cyclin D1 表达量下调，从而使细胞周期阻滞在 G1 期。而另一方面，熊果酸处理后虽然不能改变细胞 Caspase-3 mRNA 的表达，但是能使 activated Caspase-3 蛋白表达升高。而真正发挥剪切功能的正是 activated Caspase-3，从而导致细胞发生凋亡，这也与流式检测细胞凋亡发现的结果一致。本实验发现熊果酸是通过下调 cyclin D1 的表达以及激活 Caspase-3 使得骨肉瘤细胞增殖抑制、凋亡增加，从而发挥抑制骨肉瘤的作用。然而，熊果酸调控 cyclin D1 和 Caspase-3 具体机制还有待深入研究。
综上述，本实验验证了熊果酸能够使骨肉瘤细胞 U2-OS 的增殖受到抑制，同时证明了熊果酸是通过下调 cyclin D1 的表达使 U2-OS 细胞周期阻滞在 G1 期、促进 Caspase-3 的活化，进而使细胞凋亡增加。
