引用本文： 刘沪喆, 沈皆亮, 周浩, 许圣茜, 胡侦明. 白藜芦醇通过 Wnt/β-catenin 信号通路调控髓核细胞细胞外基质表达. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(4): 476-483. doi: 10.7507/1002-1892.201709097 复制
椎间盘退变被认为是多数脊柱疾患的始发因素，在当今人口老龄化社会，椎间盘退行性疾病（intervertebral disc degenerative disease，IVDD）因其高发病率和高致残率，日益成为严重的公共健康问题[1]。一个正常的椎间盘组织包括上下软骨终板、周围纤维环以及包裹在中间的冻胶样髓核组织。健康椎间盘的生物学意义在于缓冲脊柱的机械应力，为脊柱节段活动提供衔接。而髓核组织中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是维持这一生物学功能的关键[2]。白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种细胞内沉默信息调节 2 同源物 1（SIRT1）的天然激动剂，本课题组前期研究表明 RES 可促进髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPC）ECM 的表达，维持其细胞表型[3]，但具体作用机制并不清楚。
经典 Wnt/β-catenin 信号通路是细胞内信号传导途径的重要组成部分，参与调控增殖、分化、再生等多种细胞功能[4]。已有大量研究表明 Wnt/β-catenin 信号通路可以调控软骨细胞 ECM 的表达，激活该通路会加速软骨退变[5]。NPC 与软骨细胞有着相似的细胞表型，因此近年来该信号通路在椎间盘生理病理中的作用越来越受到关注[6]。本研究拟以临床摘取的髓核组织为研究对象，通过组织学和细胞学实验，探讨经典 Wnt/β-catenin 信号通路是否参与了 RES 对 NPC ECM 表达的调控，为 RES 进一步应用于临床治疗 IVDD 提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源及分组
椎间盘标本来源于重庆医科大学附属第一医院骨科接受椎间盘摘除术的 10 例患者，其中 5 例术前诊断为脊柱爆裂骨折，年龄（33.2±7.6）岁，入院前无腰痛病史，设为对照组；余 5 例术前诊断为腰椎间盘突出症，年龄（64.4±8.1）岁，设为退变组。椎间盘退变程度参照术前 MRI 的 Pfirrmann 分级[7]，其中对照组 1 级 1 例，2 级 4 例；退变组 3 级 1 例，4 级 3 例，5 级 1 例。将术中所取椎间盘组织放入无菌培养袋中，迅速带回实验室，在超净台用眼科剪和镊，根据组织的大体形态仔细分离髓核组织，进行后续实验。本研究方案获重庆医科大学伦理委员会批准，所有患者术前均签署知情同意书。
1.2 主要试剂及仪器
免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RIPA 裂解液、Bradford 法蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE 配胶试剂盒、牛血清白蛋白、小鼠抗人 β-actin 多克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯膜（Millipore 公司，美国）；小鼠抗人 β-catenin 和 SIRT1 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；山羊抗小鼠 Dylight 488 荧光二抗（BD 公司，美国）；小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉凯基因生物技术有限公司合成；PepMute siRNA Transfection Reagent（SignaGen 公司，美国）；Trizol 裂解液（Invitrogen 公司，美国）；SYBR® Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO 公司，日本）；DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）。光学显微镜（Nikon 公司，日本）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；分光光度计（HACH 公司，美国）；荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.3 正常和退变髓核组织 β-catenin 和 ECM 比较
1.3.1 β-catenin 免疫组织化学染色观察
将两组所分离髓核组织用 4% 多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm 厚组织切片；二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，3% 双氧水 37℃ 孵育 10 min，灭活内源性过氧化物酶；PBS 缓冲液漂洗后，滴加 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 孵育 30 min，行抗原修复；PBS 缓冲液漂洗后，山羊血清 37℃ 封闭 10 min，滤纸吸干后，滴加合适浓度 β-catenin 一抗（1∶200），4℃ 孵育过夜；第 2 天复温后，PBS 缓冲液漂洗，滴加生物素标记山羊抗小鼠 IgG 二抗，37℃ 孵育 30 min；PBS 缓冲液漂洗后，DAB 染色，光镜下控制染色程度，以观察到棕黄色阳性反应出现再过染 5 s 左右为宜；自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水、透明，中性树脂封片后，光镜下观察髓核组织中 β-catenin 蛋白表达，并计算 β-catenin 阳性表达的细胞比例。
1.3.2 Western blot 检测
收集两组髓核组织，加入 RIPA 裂解液，冰上反应 30 min，4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 5 min 提取总蛋白。Bradford 法检测蛋白浓度后，以每个样本 50 μg 蛋白质量进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，再将蛋白电转至聚偏氟乙烯膜上，50 g/L 牛血清白蛋白室温封闭 1 h，滴加合适浓度的 β-catenin（1∶2 000）、Ⅱ型胶原（1∶500）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗，4℃ 孵育过夜；第 2 天复温后，TBST 漂洗，加入对应辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 显影，凝胶成像仪拍照。定量检测采用 Image J 软件进行灰度统计。
1.4 RES 对 NPC ECM 表达的影响
1.4.1 NPC 分离培养
取退变组髓核组织，参考本课题组既往研究[8]，进行 NPC 培养。步骤如下：将分离后的髓核组织用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2 g/L Ⅱ型胶原酶在 37℃ 序贯消化 3～5 h，200 目细胞筛过滤后，以离心半径 6.5 cm、800 r/min 离心 5 min 取得细胞沉淀。加入完全培养基（含 20%FBS 的 DMEM/F12 培养基）重悬细胞，调整细胞密度为 2×104个/mL 后种植于 25 cm2 培养瓶中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞融合达 90% 左右时 2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代。取第 3 代细胞进行后续实验。
1.4.2 细胞分组及 Western blot 检测
将第 3 代 NPC 随机分为 3 组：A 组为空白对照组，用完全培养基正常培养 24 h；B 组为 IL-1β 组，在培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 处理 24 h；C 组为 RES+IL-1β 组，在培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 处理 24 h。收集 3 组细胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达。
1.5 siRNA 转染靶向沉默 SIRT1 和 β-catenin 相关观测
1.5.1 siRNA 转染方法
取第 3 代 NPC，以 1×105个/孔密度种植于 6 孔板中，随机分为 3 组：a 组为未转染组；b 组为阴性对照组，采用无关序列 siRNA 转染；c 组为转染组，采用目标基因（β-catenin-siRNA 或 SIRT1-siRNA）转染。各组细胞培养第 2 天待细胞融合率达 60%～70% 时，以 30 nmol/L 各 siRNA 混合 PepMute siRNA Transfection Reagent 进行转染。siRNA 序列：β-catenin 正义 5'-CAGUUGUGGUUAAUCUCUA-3'，反义 5'-GCAACAGAAGCAGAGAGGU-3'；SIRT1 正义 5'-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3'，反义 5'-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-3'；无关序列 siRNA 正义 5'-CUCUUCGTUCGATUCTUCT-3'，反义 5'-AUUAGGCUUTCUATCGUTA-3'。各组转染后于 37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 12 h 后，更换为完全培养基，继续培养 36 h 进行后续检测。
1.5.2 Western blot 检测
收集 3 组细胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组 β-catenin 和 SIRT1 蛋白表达，其中 SIRT1 一抗（1∶1 000）。
1.5.3 实时荧光定量 PCR 检测
收集 3 组细胞，采用 Trizol 法提取总 RNA，采用分光光度计测定 RNA 浓度和纯度后，行实时荧光定量 PCR 检测 β-catenin 和 SIRT1 的 mRNA 表达。逆转录为 cDNA 后，采用 SYBR® Green Real-time PCR Master Mix 检测，以 GAPDH 基因作为内参，标准化反应体系。各基因引物序列见表 1。反应条件：95℃ 预变性 3 min，95℃ 变性 20 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 20 s，35 个循环。采用 2–ΔΔCt法计算各靶基因相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
1.6 RES 调控 ECM 表达的信号通路检测
1.6.1 细胞免疫荧光染色检测 β-catenin 核转位情况
取状态良好的第 3 代 NPC 以 1×105个/孔密度种植于 6 孔板中，行常规细胞爬片，第 2 天待细胞融合度达 50% 左右即弃去培养基。将 NPC 随机分为 4 组，分别为：1 组（空白对照组），用完全培养基培养 24 h；2 组（IL-1β 组），在完全培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；3 组（RES 组），在完全培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；4 组（SIRT1-siRNA 组），SIRT1-siRNA 转染后分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h。PBS 缓冲液漂洗后加入 4% 多聚甲醛室温下固定 10 min，PBS 漂洗后加入 5% 牛血清白蛋白封闭液 37℃ 孵育 30 min，滤纸吸干封闭液，加入 β-catenin 抗体，4℃ 孵育过夜。第 2 天复温后，PBS 漂洗，加入山羊抗小鼠 Dylight 488 荧光二抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 漂洗后加入 DAPI 室温染核 1 min，滴加适量抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。
1.6.2 Western blot 检测
将第 3 代 NPC 随机分为 5 组，分别为：Ⅰ组（空白对照组），用完全培养基培养 24 h；Ⅱ组（IL-1β 组），在完全培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅲ组（IL-1β+β-catenin-siRNA 组），β-catenin-siRNA 转染后再加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅳ组（IL-1β+RES 组），在完全培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅴ组（IL-1β+RES+SIRT1-siRNA 组），SIRT1-siRNA 转染后分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h。同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达。
1.7 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，用 Levene 法行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和退变髓核组织 β-catenin 和 ECM 比较
2.1.1 免疫组织化学染色观察
对照组和退变组髓核组织中均能检测到 β-catenin 蛋白，且表达部位为细胞内。但退变组髓核组织中 β-catenin 阳性表达的细胞比例为 33.7%±7.1%，明显高于对照组的 11.3%±4.5%，差异有统计学意义（t=4.616，P=0.010）。见图 1。
2.1.2 Western blot 检测
与对照组比较，退变组 β-catenin 蛋白相对表达量显著升高，Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.2 RES 对 NPC ECM 表达的影响
Western blot 检测示，B 组 β-catenin 蛋白相对表达量显著高于 A、C 组，Ⅱ型胶原和 Aggrecan 相对表达量显著低于 A、C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间比较各蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
2.3 siRNA 转染靶向沉默 β-catenin 和 SIRT1 表达相关观测
Western blot 检测及实时荧光定量 PCR 检测均显示，c 组 β-catenin、SIRT1 蛋白及基因相对表达量均显著低于 a、b 组，差异有统计学意义（P<0.05）；a、b 组间 β-catenin 和 SIRT1 蛋白及基因相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4、5。
2.4 RES 调控 ECM 表达的信号通路检测
2.4.1 细胞免疫荧光染色检测 β-catenin 核转位情况
荧光显微镜观察示，1 组 β-catenin 蛋白散在表达于细胞质内，细胞质呈现绿色荧光；2 组 NPC 在 IL-1β 刺激下，β-catenin 主要呈现细胞核内表达，细胞核表达绿色荧光，与 DAPI 染色的细胞核相互重合，提示核转录；3 组在 RES 作用下，IL-1β 所诱导的 β-catenin 明显减弱，又散在表达于细胞质内；4 组 NPC 转染 SIRT1-siRNA 后，RES 对 β-catenin 的核转录抑制作用被削弱，细胞核显示绿色荧光。见图 6。
2.4.2 Western blot 检测
与Ⅰ组 NPC 相比，Ⅱ组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显降低（P<0.05）；而Ⅲ组 NPC 转染 β-catenin-siRNA 后，IL-1β 对 ECM 的降解作用被明显抑制，与Ⅱ组相比Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显升高（P<0.05）；进一步比较发现，当Ⅴ组 NPC 转染 SIRT1-siRNA 后，抑制了 RES 对 ECM 降解的保护作用，与Ⅳ组相比Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显降低（P<0.05）。见图 7。
图1
免疫组织化学染色检测两组髓核组织 β-catenin 蛋白表达（×200）
箭头示 β-catenin 表达阳性细胞 a. 对照组；b. 退变组
Figure1. Protein expression of β-catenin in nucleus pulposus tissue by immunohistochemical staining (×200)Arrow indicated β-catenin positive cells a. Control group; b. Degeneration group
图2
Western blot 检测两组髓核组织中 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：对照组 2：退变组；b. 各蛋白相对表达量
Figure2. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in nucleus pulposus tissue by Western blota. Electrophoregram 1: Control group 2: Degeneration group; b. The relative expression of each protein
图3
Western blot 检测 3 组 NPC 中 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组；b. 各蛋白相对表达量
Figure3. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in NPC by Western blota. Electrophoregram 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. The relative expression of each protein
图4
Western blot 检测 siRNA 干扰实验 3 组 NPC β-catenin、SIRT1 蛋白表达
a. 电泳图 1：a 组 2：b 组 3：c 组；b. 各蛋白相对表达量
Figure4. Protein expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by Western blota. Electrophoregram 1: Group a 2: Group b 3: Group c; b. The relative expression of each protein
图5
实时荧光定量 PCR 检测 siRNA 干扰实验 3 组 NPC β- catenin、SIRT1 基因相对表达量
Figure5.
The mRNA relative expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by real-time fluorescence quantitative PCR
图6
细胞免疫荧光染色检测各组 β-catenin 核转位情况
从左至右依次为 β-catenin、DAPI、二者重叠 a. 1 组；b. 2 组；c. 3 组；d. 4 组
Figure6. Nuclear translocation of β-catenin detected by cell immunofluorescence stainingFrom left to right for β-catenin, DAPI, and merge a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
图7
Western blot 检测 RES 通过 SIRT1 调控各组Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：Ⅰ组 2：Ⅱ组 3：Ⅲ组 4：Ⅳ组5：Ⅴ组；b. 各蛋白相对表达量
Figure7. Protein expressions of collagen type Ⅱ and Aggrecan regulated by RES through SIRT1 by Western blota. Electrophoregram 1: GroupⅠ 2: Group Ⅱ 3: Group Ⅲ 4: Group Ⅳ 5: Group Ⅴ; b. The relative expression of each protein
3 讨论
髓核组织 ECM 代谢紊乱是椎间盘退变的重要特征，通过提高 ECM 合成从而恢复椎间盘的生物学特性，是治疗 IVDD 的有效策略[8]。RES 是一种天然多酚类物质，富含于葡萄、虎杖、花生等植物中[9]，本课题组已发表的多项研究均提示 RES 可以抑制 NPC 凋亡，提高 ECM 表达[10-13]，但潜在机制目前还不清楚，限制了其进一步临床推广。本实验中首先选用正常和退变的髓核组织进行原位比较发现，β-catenin 在退变组中的表达明显增高，而 ECM 主要成分Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的表达却明显下降。因此经典 Wnt/β-catenin 信号通路是否参与了 RES 对 NPC ECM 的调控，成为了本研究的兴趣点。
在骨科领域，经典 Wnt/β-catenin 信号通路对成骨分化的作用研究最为广泛，是抗骨质疏松治疗中一个重要的调控靶点[14]。近年来越来越多证据表明，该信号通路同样在软骨的合成代谢中发挥着重要作用。Miyamoto 等[15]报道可以通过抑制 Wnt/β-catenin 通路来延缓软骨退变。而 Buchtova 等[16]研究表明，激活 Wnt/β-catenin 通路可以抑制软骨细胞分化。因为软骨和 NPC 有着相似的表型[17]，且本课题组前期研究表明炎性因子 IL-1β 对 NPC 具有明显的促分解代谢作用[18]；在椎间盘退变进程中，IL-1β 被认为是最重要的 ECM 促分解炎性因子[19]，本实验中 IL-1β 被用于诱导 ECM 降解。因此，本实验进一步探讨了 RES 单独或联合 IL-1β 作用下，对 NPC 中 β-catenin 的影响。结果表明 IL-1β 可以提高 β-catenin 表达，同时降低Ⅱ型胶原和 Aggrecan 合成；而 RES 加入后则逆转了这种趋势，RES 组的 β-catenin 表达降低，而 ECM 表达增高。这一结果初步证明了在 NPC 中，RES 可以影响 Wnt/β-catenin 通路，并对 ECM 表达具有调控作用。
虽然 RES 一直被认为是 SIRT1 的天然激动剂，但其在细胞内的作用靶点十分广泛[20]。为了进一步明确 Wnt/β-catenin 通路在 RES 调控 ECM 的表达是以 SIRT1 为靶点的，我们采用了 siRNA 靶向抑制 β-catenin 和 SIRT1 的表达。当 SIRT1 被 siRNA 沉默后，RES 对 ECM 的保护作用被减弱，同时 β-catenin 发生了更明显的核转移，提示 RES 是以 SIRT1 为靶点来调控下游 Wnt/β-catenin 通路的，从而调控了 ECM 表达。而当 β-catenin 表达抑制后，产生了与 RES 相似的 ECM 保护作用，IL-1β 所介导的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 表达下降现象减弱。
综上述，本研究首次证实了 RES 以 SIRT1 为靶点，通过经典 Wnt/β-catenin 信号通路可以减少炎性因子 IL-1β 所介导的 ECM 降解，维持 ECM 的合成稳定，从而维持椎间盘的正常生理功能，为 IVDD 的治疗提供了理论依据。
椎间盘退变被认为是多数脊柱疾患的始发因素，在当今人口老龄化社会，椎间盘退行性疾病（intervertebral disc degenerative disease，IVDD）因其高发病率和高致残率，日益成为严重的公共健康问题[1]。一个正常的椎间盘组织包括上下软骨终板、周围纤维环以及包裹在中间的冻胶样髓核组织。健康椎间盘的生物学意义在于缓冲脊柱的机械应力，为脊柱节段活动提供衔接。而髓核组织中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是维持这一生物学功能的关键[2]。白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种细胞内沉默信息调节 2 同源物 1（SIRT1）的天然激动剂，本课题组前期研究表明 RES 可促进髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPC）ECM 的表达，维持其细胞表型[3]，但具体作用机制并不清楚。
经典 Wnt/β-catenin 信号通路是细胞内信号传导途径的重要组成部分，参与调控增殖、分化、再生等多种细胞功能[4]。已有大量研究表明 Wnt/β-catenin 信号通路可以调控软骨细胞 ECM 的表达，激活该通路会加速软骨退变[5]。NPC 与软骨细胞有着相似的细胞表型，因此近年来该信号通路在椎间盘生理病理中的作用越来越受到关注[6]。本研究拟以临床摘取的髓核组织为研究对象，通过组织学和细胞学实验，探讨经典 Wnt/β-catenin 信号通路是否参与了 RES 对 NPC ECM 表达的调控，为 RES 进一步应用于临床治疗 IVDD 提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源及分组
椎间盘标本来源于重庆医科大学附属第一医院骨科接受椎间盘摘除术的 10 例患者，其中 5 例术前诊断为脊柱爆裂骨折，年龄（33.2±7.6）岁，入院前无腰痛病史，设为对照组；余 5 例术前诊断为腰椎间盘突出症，年龄（64.4±8.1）岁，设为退变组。椎间盘退变程度参照术前 MRI 的 Pfirrmann 分级[7]，其中对照组 1 级 1 例，2 级 4 例；退变组 3 级 1 例，4 级 3 例，5 级 1 例。将术中所取椎间盘组织放入无菌培养袋中，迅速带回实验室，在超净台用眼科剪和镊，根据组织的大体形态仔细分离髓核组织，进行后续实验。本研究方案获重庆医科大学伦理委员会批准，所有患者术前均签署知情同意书。
1.2 主要试剂及仪器
免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RIPA 裂解液、Bradford 法蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE 配胶试剂盒、牛血清白蛋白、小鼠抗人 β-actin 多克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯膜（Millipore 公司，美国）；小鼠抗人 β-catenin 和 SIRT1 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；山羊抗小鼠 Dylight 488 荧光二抗（BD 公司，美国）；小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉凯基因生物技术有限公司合成；PepMute siRNA Transfection Reagent（SignaGen 公司，美国）；Trizol 裂解液（Invitrogen 公司，美国）；SYBR® Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO 公司，日本）；DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）。光学显微镜（Nikon 公司，日本）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；分光光度计（HACH 公司，美国）；荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.3 正常和退变髓核组织 β-catenin 和 ECM 比较
1.3.1 β-catenin 免疫组织化学染色观察
将两组所分离髓核组织用 4% 多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm 厚组织切片；二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，3% 双氧水 37℃ 孵育 10 min，灭活内源性过氧化物酶；PBS 缓冲液漂洗后，滴加 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 孵育 30 min，行抗原修复；PBS 缓冲液漂洗后，山羊血清 37℃ 封闭 10 min，滤纸吸干后，滴加合适浓度 β-catenin 一抗（1∶200），4℃ 孵育过夜；第 2 天复温后，PBS 缓冲液漂洗，滴加生物素标记山羊抗小鼠 IgG 二抗，37℃ 孵育 30 min；PBS 缓冲液漂洗后，DAB 染色，光镜下控制染色程度，以观察到棕黄色阳性反应出现再过染 5 s 左右为宜；自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水、透明，中性树脂封片后，光镜下观察髓核组织中 β-catenin 蛋白表达，并计算 β-catenin 阳性表达的细胞比例。
1.3.2 Western blot 检测
收集两组髓核组织，加入 RIPA 裂解液，冰上反应 30 min，4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 5 min 提取总蛋白。Bradford 法检测蛋白浓度后，以每个样本 50 μg 蛋白质量进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，再将蛋白电转至聚偏氟乙烯膜上，50 g/L 牛血清白蛋白室温封闭 1 h，滴加合适浓度的 β-catenin（1∶2 000）、Ⅱ型胶原（1∶500）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗，4℃ 孵育过夜；第 2 天复温后，TBST 漂洗，加入对应辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 显影，凝胶成像仪拍照。定量检测采用 Image J 软件进行灰度统计。
1.4 RES 对 NPC ECM 表达的影响
1.4.1 NPC 分离培养
取退变组髓核组织，参考本课题组既往研究[8]，进行 NPC 培养。步骤如下：将分离后的髓核组织用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2 g/L Ⅱ型胶原酶在 37℃ 序贯消化 3～5 h，200 目细胞筛过滤后，以离心半径 6.5 cm、800 r/min 离心 5 min 取得细胞沉淀。加入完全培养基（含 20%FBS 的 DMEM/F12 培养基）重悬细胞，调整细胞密度为 2×104个/mL 后种植于 25 cm2 培养瓶中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞融合达 90% 左右时 2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代。取第 3 代细胞进行后续实验。
1.4.2 细胞分组及 Western blot 检测
将第 3 代 NPC 随机分为 3 组：A 组为空白对照组，用完全培养基正常培养 24 h；B 组为 IL-1β 组，在培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 处理 24 h；C 组为 RES+IL-1β 组，在培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 处理 24 h。收集 3 组细胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达。
1.5 siRNA 转染靶向沉默 SIRT1 和 β-catenin 相关观测
1.5.1 siRNA 转染方法
取第 3 代 NPC，以 1×105个/孔密度种植于 6 孔板中，随机分为 3 组：a 组为未转染组；b 组为阴性对照组，采用无关序列 siRNA 转染；c 组为转染组，采用目标基因（β-catenin-siRNA 或 SIRT1-siRNA）转染。各组细胞培养第 2 天待细胞融合率达 60%～70% 时，以 30 nmol/L 各 siRNA 混合 PepMute siRNA Transfection Reagent 进行转染。siRNA 序列：β-catenin 正义 5'-CAGUUGUGGUUAAUCUCUA-3'，反义 5'-GCAACAGAAGCAGAGAGGU-3'；SIRT1 正义 5'-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3'，反义 5'-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-3'；无关序列 siRNA 正义 5'-CUCUUCGTUCGATUCTUCT-3'，反义 5'-AUUAGGCUUTCUATCGUTA-3'。各组转染后于 37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 12 h 后，更换为完全培养基，继续培养 36 h 进行后续检测。
1.5.2 Western blot 检测
收集 3 组细胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组 β-catenin 和 SIRT1 蛋白表达，其中 SIRT1 一抗（1∶1 000）。
1.5.3 实时荧光定量 PCR 检测
收集 3 组细胞，采用 Trizol 法提取总 RNA，采用分光光度计测定 RNA 浓度和纯度后，行实时荧光定量 PCR 检测 β-catenin 和 SIRT1 的 mRNA 表达。逆转录为 cDNA 后，采用 SYBR® Green Real-time PCR Master Mix 检测，以 GAPDH 基因作为内参，标准化反应体系。各基因引物序列见表 1。反应条件：95℃ 预变性 3 min，95℃ 变性 20 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 20 s，35 个循环。采用 2–ΔΔCt法计算各靶基因相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
1.6 RES 调控 ECM 表达的信号通路检测
1.6.1 细胞免疫荧光染色检测 β-catenin 核转位情况
取状态良好的第 3 代 NPC 以 1×105个/孔密度种植于 6 孔板中，行常规细胞爬片，第 2 天待细胞融合度达 50% 左右即弃去培养基。将 NPC 随机分为 4 组，分别为：1 组（空白对照组），用完全培养基培养 24 h；2 组（IL-1β 组），在完全培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；3 组（RES 组），在完全培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；4 组（SIRT1-siRNA 组），SIRT1-siRNA 转染后分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h。PBS 缓冲液漂洗后加入 4% 多聚甲醛室温下固定 10 min，PBS 漂洗后加入 5% 牛血清白蛋白封闭液 37℃ 孵育 30 min，滤纸吸干封闭液，加入 β-catenin 抗体，4℃ 孵育过夜。第 2 天复温后，PBS 漂洗，加入山羊抗小鼠 Dylight 488 荧光二抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 漂洗后加入 DAPI 室温染核 1 min，滴加适量抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。
1.6.2 Western blot 检测
将第 3 代 NPC 随机分为 5 组，分别为：Ⅰ组（空白对照组），用完全培养基培养 24 h；Ⅱ组（IL-1β 组），在完全培养基中加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅲ组（IL-1β+β-catenin-siRNA 组），β-catenin-siRNA 转染后再加入 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅳ组（IL-1β+RES 组），在完全培养基中分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h；Ⅴ组（IL-1β+RES+SIRT1-siRNA 组），SIRT1-siRNA 转染后分别加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培养 24 h。同 1.3.2 方法采用 Western blot 检测各组Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达。
1.7 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，用 Levene 法行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和退变髓核组织 β-catenin 和 ECM 比较
2.1.1 免疫组织化学染色观察
对照组和退变组髓核组织中均能检测到 β-catenin 蛋白，且表达部位为细胞内。但退变组髓核组织中 β-catenin 阳性表达的细胞比例为 33.7%±7.1%，明显高于对照组的 11.3%±4.5%，差异有统计学意义（t=4.616，P=0.010）。见图 1。
2.1.2 Western blot 检测
与对照组比较，退变组 β-catenin 蛋白相对表达量显著升高，Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.2 RES 对 NPC ECM 表达的影响
Western blot 检测示，B 组 β-catenin 蛋白相对表达量显著高于 A、C 组，Ⅱ型胶原和 Aggrecan 相对表达量显著低于 A、C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间比较各蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
2.3 siRNA 转染靶向沉默 β-catenin 和 SIRT1 表达相关观测
Western blot 检测及实时荧光定量 PCR 检测均显示，c 组 β-catenin、SIRT1 蛋白及基因相对表达量均显著低于 a、b 组，差异有统计学意义（P<0.05）；a、b 组间 β-catenin 和 SIRT1 蛋白及基因相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4、5。
2.4 RES 调控 ECM 表达的信号通路检测
2.4.1 细胞免疫荧光染色检测 β-catenin 核转位情况
荧光显微镜观察示，1 组 β-catenin 蛋白散在表达于细胞质内，细胞质呈现绿色荧光；2 组 NPC 在 IL-1β 刺激下，β-catenin 主要呈现细胞核内表达，细胞核表达绿色荧光，与 DAPI 染色的细胞核相互重合，提示核转录；3 组在 RES 作用下，IL-1β 所诱导的 β-catenin 明显减弱，又散在表达于细胞质内；4 组 NPC 转染 SIRT1-siRNA 后，RES 对 β-catenin 的核转录抑制作用被削弱，细胞核显示绿色荧光。见图 6。
2.4.2 Western blot 检测
与Ⅰ组 NPC 相比，Ⅱ组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显降低（P<0.05）；而Ⅲ组 NPC 转染 β-catenin-siRNA 后，IL-1β 对 ECM 的降解作用被明显抑制，与Ⅱ组相比Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显升高（P<0.05）；进一步比较发现，当Ⅴ组 NPC 转染 SIRT1-siRNA 后，抑制了 RES 对 ECM 降解的保护作用，与Ⅳ组相比Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达明显降低（P<0.05）。见图 7。
图1
免疫组织化学染色检测两组髓核组织 β-catenin 蛋白表达（×200）
箭头示 β-catenin 表达阳性细胞 a. 对照组；b. 退变组
Figure1. Protein expression of β-catenin in nucleus pulposus tissue by immunohistochemical staining (×200)Arrow indicated β-catenin positive cells a. Control group; b. Degeneration group
图2
Western blot 检测两组髓核组织中 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：对照组 2：退变组；b. 各蛋白相对表达量
Figure2. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in nucleus pulposus tissue by Western blota. Electrophoregram 1: Control group 2: Degeneration group; b. The relative expression of each protein
图3
Western blot 检测 3 组 NPC 中 β-catenin、Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组；b. 各蛋白相对表达量
Figure3. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in NPC by Western blota. Electrophoregram 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. The relative expression of each protein
图4
Western blot 检测 siRNA 干扰实验 3 组 NPC β-catenin、SIRT1 蛋白表达
a. 电泳图 1：a 组 2：b 组 3：c 组；b. 各蛋白相对表达量
Figure4. Protein expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by Western blota. Electrophoregram 1: Group a 2: Group b 3: Group c; b. The relative expression of each protein
图5
实时荧光定量 PCR 检测 siRNA 干扰实验 3 组 NPC β- catenin、SIRT1 基因相对表达量
Figure5.
The mRNA relative expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by real-time fluorescence quantitative PCR
图6
细胞免疫荧光染色检测各组 β-catenin 核转位情况
从左至右依次为 β-catenin、DAPI、二者重叠 a. 1 组；b. 2 组；c. 3 组；d. 4 组
Figure6. Nuclear translocation of β-catenin detected by cell immunofluorescence stainingFrom left to right for β-catenin, DAPI, and merge a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
图7
Western blot 检测 RES 通过 SIRT1 调控各组Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白表达
a. 电泳图 1：Ⅰ组 2：Ⅱ组 3：Ⅲ组 4：Ⅳ组5：Ⅴ组；b. 各蛋白相对表达量
Figure7. Protein expressions of collagen type Ⅱ and Aggrecan regulated by RES through SIRT1 by Western blota. Electrophoregram 1: GroupⅠ 2: Group Ⅱ 3: Group Ⅲ 4: Group Ⅳ 5: Group Ⅴ; b. The relative expression of each protein
3 讨论
髓核组织 ECM 代谢紊乱是椎间盘退变的重要特征，通过提高 ECM 合成从而恢复椎间盘的生物学特性，是治疗 IVDD 的有效策略[8]。RES 是一种天然多酚类物质，富含于葡萄、虎杖、花生等植物中[9]，本课题组已发表的多项研究均提示 RES 可以抑制 NPC 凋亡，提高 ECM 表达[10-13]，但潜在机制目前还不清楚，限制了其进一步临床推广。本实验中首先选用正常和退变的髓核组织进行原位比较发现，β-catenin 在退变组中的表达明显增高，而 ECM 主要成分Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的表达却明显下降。因此经典 Wnt/β-catenin 信号通路是否参与了 RES 对 NPC ECM 的调控，成为了本研究的兴趣点。
在骨科领域，经典 Wnt/β-catenin 信号通路对成骨分化的作用研究最为广泛，是抗骨质疏松治疗中一个重要的调控靶点[14]。近年来越来越多证据表明，该信号通路同样在软骨的合成代谢中发挥着重要作用。Miyamoto 等[15]报道可以通过抑制 Wnt/β-catenin 通路来延缓软骨退变。而 Buchtova 等[16]研究表明，激活 Wnt/β-catenin 通路可以抑制软骨细胞分化。因为软骨和 NPC 有着相似的表型[17]，且本课题组前期研究表明炎性因子 IL-1β 对 NPC 具有明显的促分解代谢作用[18]；在椎间盘退变进程中，IL-1β 被认为是最重要的 ECM 促分解炎性因子[19]，本实验中 IL-1β 被用于诱导 ECM 降解。因此，本实验进一步探讨了 RES 单独或联合 IL-1β 作用下，对 NPC 中 β-catenin 的影响。结果表明 IL-1β 可以提高 β-catenin 表达，同时降低Ⅱ型胶原和 Aggrecan 合成；而 RES 加入后则逆转了这种趋势，RES 组的 β-catenin 表达降低，而 ECM 表达增高。这一结果初步证明了在 NPC 中，RES 可以影响 Wnt/β-catenin 通路，并对 ECM 表达具有调控作用。
虽然 RES 一直被认为是 SIRT1 的天然激动剂，但其在细胞内的作用靶点十分广泛[20]。为了进一步明确 Wnt/β-catenin 通路在 RES 调控 ECM 的表达是以 SIRT1 为靶点的，我们采用了 siRNA 靶向抑制 β-catenin 和 SIRT1 的表达。当 SIRT1 被 siRNA 沉默后，RES 对 ECM 的保护作用被减弱，同时 β-catenin 发生了更明显的核转移，提示 RES 是以 SIRT1 为靶点来调控下游 Wnt/β-catenin 通路的，从而调控了 ECM 表达。而当 β-catenin 表达抑制后，产生了与 RES 相似的 ECM 保护作用，IL-1β 所介导的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 表达下降现象减弱。
综上述，本研究首次证实了 RES 以 SIRT1 为靶点，通过经典 Wnt/β-catenin 信号通路可以减少炎性因子 IL-1β 所介导的 ECM 降解，维持 ECM 的合成稳定，从而维持椎间盘的正常生理功能，为 IVDD 的治疗提供了理论依据。
