引用本文： 邵陇龙, 甄平, 马永海, 巩栋, 王云龙. 不同浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌制备慢性骨髓炎模型对比研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(4): 412-419. doi: 10.7507/1002-1892.201711082 复制
慢性骨髓炎是急性化脓骨髓炎的延续，由于治疗时清创不彻底、引流不畅导致病情反复发作，因伴随不同程度长时间感染，抗生素耐药，死骨形成，导致骨不连或骨不愈合，成为骨科临床难题之一[1-3]。目前治疗慢性骨髓炎的主要方法有手术清创、病灶切除、封闭式负压引流及抗生素灌注等[4-6]，但疗效欠佳，常需要多次手术及长期运用抗生素，甚至部分患者需要截肢治疗，造成巨大身心及经济负担[7-8]。因此寻找一个有效治疗慢性骨髓炎的方案相当必要。
建立稳定、高效的慢性骨髓炎动物模型，是对慢性骨髓炎实验研究的重要保障[9]。临床常见的慢性骨髓炎致病菌以金黄色葡萄球菌为主，但随着抗生素的广泛运用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）所致慢性骨髓炎发生率逐步上升[10]，故本实验采用 MRSA 作为致病菌。在造模动物选择上，因兔能较好地模拟人慢性骨髓炎发生过程，且手术操作较容易[11]，故本实验选择兔制备慢性骨髓炎动物模型。目前文献报道使用的菌量不一致，细菌浓度过高容易导致动物死亡，过低达不到造模效果[12-14]。鉴于此，本实验通过对兔股骨注射不同浓度 MRSA，评价其感染指标，为确定兔股骨慢性骨髓炎模型的最佳致病菌浓度提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年普通级新西兰大白兔 48 只，雌雄不限，体质量 2.5～3.0 kg，由兰州军区总医院实验动物科提供。排除先天畸形、营养不良等疾病，自由饮水，标准饮食 ，于湿度 30%、室温 25℃ 的清洁级实验室单笼适应性饲养 2 周后进行实验。
MRSA（由兰州军区总医院检验科提供）；采用 DENSIMAT 比浊仪（BIOMERIEUX 公司，法国）将 MRSA 定量制备成浓度为 1×109 CFU/mL 的菌液，无菌生理盐水分别稀释为 1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL 浓度的菌液，备用（4 h 内用完，防止细菌增殖及凋亡造成浓度差异过大）。
水合氯醛（天津光复精细化工研究所）；鱼肝油酸钠注射液（上海信谊金朱药业股份有限公司）；兔 C 反应蛋白酶联反应测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。常规手术器械一套（江苏施强医疗器械有限公司）；1 mL 注射器（山东威高集团高分子有限公司）；医用电钻（天津宇通医疗器械有限公司）；骨蜡（上海三友医疗器械有限公司）；X 线机（GE 公司，美国）；CT（Philip 公司，荷兰）。
1.2 实验分组及方法
将 48 只新西兰大白兔随机分为 6 组，每组 8 只；A 组注射无菌生理盐水作为对照，B、C、D、E、F 组分别注射 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL MRSA。所有动物以 10% 水合氯醛（2.5 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉后，仰卧位固定于手术实验台上；暴露左侧股骨，于股骨髁上 2 cm 处为起点纵向切开皮肤，分离肌肉、筋膜，暴露股骨后用 2 mm 克氏针钻孔，打通骨髓腔，1 mL 注射器抽取骨髓后骨蜡封闭孔隙，再通过骨蜡缓慢注射 0.1 mL 鱼肝油酸钠闭塞血管使之硬化。1 min 后 A 组注入无菌生理盐水 0.1 mL，B～F 组根据分组向髓腔注射 0.1 mL 不同浓度 MRSA；再次用骨蜡封闭注射器形成孔隙，防止菌液外漏。最后逐层缝合软组织及皮肤，切口以聚维酮碘消毒无菌纱布覆盖，按照统一标准单笼饲养。
1.3 观测指标
1.3.1 动物大体观察
术后 4 周观察切口愈合情况，皮温，有无红肿、流脓、窦道形成。根据唐辉等[15]的标准行大体观察评分：0 分，无感染征象；1 分，皮温增高，切口表面有红斑；2 分，切口处红肿，股骨增粗，窦道形成；3 分，骨质破坏严重，侵犯关节，有脓肿。
1.3.2 细菌学检查
术后 4 周用无菌棉签沾取伤口分泌物，生理盐水浸泡棉签后在琼脂培养基涂板，确定感染细菌种类。
1.3.3 血清 C 反应蛋白含量检测
术前及术后 2、4 周采取兔耳缘静脉血 2 mL，以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 15 min 后，取上层血清，30 min 内用兔 C 反应蛋白酶联反应测定试剂盒测定 C 反应蛋白含量。
1.3.4 影像学观察
术后 4 周行 X 线片和 CT 检查观察股骨变化及缺损闭合情况，采用 Norden 评分[16]进行影像学评分，包括 4 个指标：① 死骨形成：有，3 分；可疑，1.5 分；无，0 分。② 骨质破坏：有，2 分；可疑，1 分；无，0 分。③ 骨质增生：有，1 分；可疑，0.5 分；无，0 分。④ 软组织包块影：有，1 分；可疑，0.5 分；无，0 分。
1.3.5 标本大体观察及组织学观察
术后 4 周采用兔耳缘静脉空气栓塞处死动物，取出股骨标本，采用 Ambrose 标准[17]进行标本大体观察评分：3 分，显著脓肿；2 分，中等量脓肿；1 分，少量脓肿；0 分，无脓肿。将标本以甲醛固定 48 h，10%EDTA 脱钙液脱钙，每周换液 1 次，共 4 周；脱钙后行石蜡包埋，5 μm 厚组织切片，常规 HE 染色，光镜下观察骨内炎症情况。采用 Ambrose 标准进行组织学评分：① 炎症情况：3 分，严重炎症、纤维化、脓肿；2 分，中等炎症、纤维化；1 分，少量炎症、纤维化；0 分，无炎症仅纤维化。② 新骨形成比例：3 分，<25%；2 分，25%～50%；1 分，50%～75%；0 分，75%～100%。将两种评分取均值评价骨髓炎的严重程度。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 动物大体观察
术后 4 周内 A 组无动物死亡，切口愈合良好，皮温可，无红肿、脓肿、渗出及窦道形成。B 组术后 3 d 和 5 d 因感染过重分别死亡 2 只和 3 只动物；余 3 只感染侵犯至关节，脓肿形成，大量骨质破坏，死骨形成。C 组术后 7 d 因感染过重死亡 2 只动物；余 6 只中，2 只切口感染侵犯至关节，程度轻于 B 组；4 只切口红肿，股骨增粗，窦道形成。D、E、F 组无动物死亡。D 组 7 只兔切口红肿，股骨增粗，窦道形成；1 只兔切口红肿，但未形成窦道。E 组 6 只兔切口红肿，股骨略微增粗，尚未形成窦道；2 只兔切口皮温增高，红肿形成，尚未形成窦道。F 组 4 只切口红肿，皮温增高，尚未形成窦道；4 只切口皮温高，无红肿，皮肤处有红斑。见图 1。
A、B、C、D、E、F 组大体观察评分分别为 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.88±0.35）、（1.75±0.46）、（1.50±0.53）分，A 组评分显著低于其余各组，B 组显著高于其余各组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；C 组评分高于 D、E、F 组，D 组高于 E、F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 细菌学检查
A 组无切口红肿渗出，E 组 2 只、F 组 8 只切口未破溃形成窦道，因此未进行细菌学培养测定。B 组 3 只、C 组 6 只、D 组 8 只、E 组 6 只细菌培养结果阳性，确定为 MRSA。
2.3 血清 C 反应蛋白含量检测
术前各组间比较 C 反应蛋白含量差异均无统计学意义（P>0.05）。术后 2 周，B～F 组 C 反应蛋白含量均显著高于 A 组，B、C 组高于 D、E、F 组，D、E 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间及 D、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。术后 4 周，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。A 组术后 2、4 周 C 反应蛋白含量与术前比较差异无统计学意义（P>0.05），B～F 组术后 2、4 周显著高于术前（P<0.05）；A、F 组术后 2、4 周间比较差异无统计学意义（P>0.05），B～E 组术后 4 周显著高于术后 2 周（P<0.05）。见表 1。
表1
各组各时间点血清 C 反应蛋白含量比较（mg/mL，
）
Table1.
Comparison of serum C-reactive protein content at each time point of each group (mg/mL,
)
2.4 影像学观察
X 线片示：A 组软组织无肿胀，骨质无破坏，无死骨形成。B～F 组均见不同程度骨质破坏，死骨形成，其中 B 组软组织肿胀明显，侵犯至关节；C 组中 2 只侵犯至关节，但侵犯程度不及 B 组；D、E 组均可见死骨形成，股骨破坏肿胀，肿胀程度不及 B 组；F 组可见骨质破坏，骨质增生，破坏程度不及 D、E 组。见图 2。
CT 三维重建示：A 组可见股骨三维重建结构良好，无明显骨质破坏，股骨干平滑完整。B 组可见股骨结构破坏，关节处骨质破坏严重，大量死骨形成，骨质增生，股骨干显著增粗。C 组中有 2 只侵犯至膝关节，侵犯程度不及 B 组；其余可见股骨干增粗，股骨髁上骨质破坏严重，骨质增生，死骨形成。D、E 组可见股骨髁上骨质破坏，破坏程度不及 C 组，少量死骨形成。F 组可见股骨髁上骨质少许破坏，破坏程度不及 E 组。见图 3。
横断面 CT 示：A 组可见股骨干平滑完整，无死骨、骨质破坏及软组织肿胀。B 组可见股骨干靠近膝关节处严重破坏，大量死骨形成，骨质增生，软组织肿胀严重。C 组 2 只侵犯至膝关节，严重程度不及 B 组；其余可见股骨干增粗，局部死骨形成，骨质增生，软组织肿胀。D、E 组均可见股骨髁上股骨增粗，骨质破坏，死骨形成，软组织肿胀程度不及 C 组。F 组可见少量骨质破坏，部分实验动物可疑骨质增生，软组织未见明显肿胀。见图 4。
A、B、C、D、E、F 组 Norden 评分分别为 0、（6.50±0.86）、（5.92±0.86）、（5.12±0.69）、（4.75±0.80）、（3.69±0.26）分。B～F 组评分显著高于 A 组，B、C 组显著高于 D、E、F 组，D、E 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间及 D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 组织学观察
A、B、C、D、E、F 组标本大体观察评分分别为 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.75±0.46）、（1.62±0.52）、（1.37±0.52）分，B～F 组显著高于 A 组，B、C 组显著高于 D、E、F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
HE 染色示：A 组未见明显异常，骨小梁结构清晰可见，排列整齐完整，未见明显炎性细胞浸润；B 组可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，骨小梁破坏，骨细胞坏死，部分区域脓肿伴机化；C 组可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，骨小梁破坏程度不及 B 组，嗜伊红组织脓肿形成；D、E 组可见中等量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，骨小梁破坏程度不及 C 组，部分区域脓肿形成；F 组可见少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，骨小梁结构未见明显破坏。见图 5。A、B、C、D、E、F 组组织学评分分别为（0.13±0.35）、（2.67±0.58）、（1.67±0.82）、（1.38±0.52）、（1.13±0.35）、（0.75±0.71）分，B～F 组显著高于 A 组，B 组显著高于 C～F 组，C、D 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、D、E 组间以及 E、F 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
图1
术后 4 周各组兔大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure1. General observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图2
术后 4 周各组 X 线片观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure2. X-ray film observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图3
术后 4 周各组 CT 三维重建观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure3. CT three-dimensional observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图4
术后 4 周各组横断面 CT 观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure4. Cross section CT observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图5
术后 4 周各组 HE 染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure5. HE staining observation of rabbits at 4 weeks after operation in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 讨论
慢性骨髓炎是骨科常见且严重的并发症。随着组织工程的发展，各种植入型器械在骨科应用越来越多，慢性骨髓炎是导致植入器械失败的重要原因之一；最终伤口迁延不愈，致病菌长期存在，抗生素耐药，死骨形成，窦道存在，病程时长，反复发作。随着抗生素的广泛使用，MRSA 已成为骨髓炎常见的致病菌。临床一旦确诊为 MRSA 所形成的慢性骨髓炎，需要更长住院时间及更多抗生素使用，给患者带来巨大的心理和生理负担[18]。
合适的动物模型在骨髓炎治疗研究中起着至关重要的作用。骨髓炎造模动物不同，实验所施加的干预措施也不同。常用的实验动物有犬、猪、兔、大鼠、小鼠等，由于兔经济实惠、占用饲养面积小、股骨大利于操作，故本实验采用兔股骨作为实验对象与部位。国内外报道的骨髓炎模型制备的菌液浓度不一致[19-20]，制备的细菌种类也不同[21-23]，且临床因 MRSA 形成的骨髓炎发生率逐渐上升，因此本实验选用 MRSA 为造模实验菌属。菌液浓度是制备骨髓炎模型的关键因素，菌液浓度高会造成较高的死亡率。本实验中，当注射菌液浓度为 1×109 CFU/mL 时，动物存活率仅 37.5%（3/8），且存活的模型感染程度均较重。但浓度太低，造模结果也不尽如人意。根据文献报道[18]，研究者使用金黄色葡萄球菌造模浓度至少在 1×105 CFU/mL 以上才可能有较高的感染率。MRSA 与金黄色葡萄球菌类似，故我们选用浓度为 1×105～1×109 CFU/mL 的 MRSA 进行筛选。本研究结果发现，适宜的造模浓度为 1×106～1×107 CFU/mL，大于文献报道的 1×105 CFU/mL，可能与既往文献未使用硬化剂及骨蜡封闭，造成菌液外溢，外部软组织为细菌提供了良好的生存环境有关。
在制备过程中，硬化剂的选择也较为关键。本实验的预实验中发现，未注射硬化剂可造成兔死亡只数增加，可能是因菌液进入血液循环导致死亡。本研究选用 5% 鱼肝油酸钠[24-25]，它可以使骨局部微循环栓塞，阻断微循环，使得菌液进入血液的量减少，防止脓毒血症的发生，也为细菌生长提供了良好环境。这种方法简单易操作，是骨髓炎造模中较合适的方法。
综上述，在兔股骨慢性骨髓炎模型制备过程中，硬化剂的选用及合适浓度的 MRSA 是造模关键。本实验结果提示，制备 MRSA 所形成的兔股骨慢性骨髓炎适宜的菌液浓度为 1×106～1×107 CFU/mL，该方法重复性高，制备模型较统一。
慢性骨髓炎是急性化脓骨髓炎的延续，由于治疗时清创不彻底、引流不畅导致病情反复发作，因伴随不同程度长时间感染，抗生素耐药，死骨形成，导致骨不连或骨不愈合，成为骨科临床难题之一[1-3]。目前治疗慢性骨髓炎的主要方法有手术清创、病灶切除、封闭式负压引流及抗生素灌注等[4-6]，但疗效欠佳，常需要多次手术及长期运用抗生素，甚至部分患者需要截肢治疗，造成巨大身心及经济负担[7-8]。因此寻找一个有效治疗慢性骨髓炎的方案相当必要。
建立稳定、高效的慢性骨髓炎动物模型，是对慢性骨髓炎实验研究的重要保障[9]。临床常见的慢性骨髓炎致病菌以金黄色葡萄球菌为主，但随着抗生素的广泛运用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）所致慢性骨髓炎发生率逐步上升[10]，故本实验采用 MRSA 作为致病菌。在造模动物选择上，因兔能较好地模拟人慢性骨髓炎发生过程，且手术操作较容易[11]，故本实验选择兔制备慢性骨髓炎动物模型。目前文献报道使用的菌量不一致，细菌浓度过高容易导致动物死亡，过低达不到造模效果[12-14]。鉴于此，本实验通过对兔股骨注射不同浓度 MRSA，评价其感染指标，为确定兔股骨慢性骨髓炎模型的最佳致病菌浓度提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年普通级新西兰大白兔 48 只，雌雄不限，体质量 2.5～3.0 kg，由兰州军区总医院实验动物科提供。排除先天畸形、营养不良等疾病，自由饮水，标准饮食 ，于湿度 30%、室温 25℃ 的清洁级实验室单笼适应性饲养 2 周后进行实验。
MRSA（由兰州军区总医院检验科提供）；采用 DENSIMAT 比浊仪（BIOMERIEUX 公司，法国）将 MRSA 定量制备成浓度为 1×109 CFU/mL 的菌液，无菌生理盐水分别稀释为 1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL 浓度的菌液，备用（4 h 内用完，防止细菌增殖及凋亡造成浓度差异过大）。
水合氯醛（天津光复精细化工研究所）；鱼肝油酸钠注射液（上海信谊金朱药业股份有限公司）；兔 C 反应蛋白酶联反应测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。常规手术器械一套（江苏施强医疗器械有限公司）；1 mL 注射器（山东威高集团高分子有限公司）；医用电钻（天津宇通医疗器械有限公司）；骨蜡（上海三友医疗器械有限公司）；X 线机（GE 公司，美国）；CT（Philip 公司，荷兰）。
1.2 实验分组及方法
将 48 只新西兰大白兔随机分为 6 组，每组 8 只；A 组注射无菌生理盐水作为对照，B、C、D、E、F 组分别注射 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL MRSA。所有动物以 10% 水合氯醛（2.5 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉后，仰卧位固定于手术实验台上；暴露左侧股骨，于股骨髁上 2 cm 处为起点纵向切开皮肤，分离肌肉、筋膜，暴露股骨后用 2 mm 克氏针钻孔，打通骨髓腔，1 mL 注射器抽取骨髓后骨蜡封闭孔隙，再通过骨蜡缓慢注射 0.1 mL 鱼肝油酸钠闭塞血管使之硬化。1 min 后 A 组注入无菌生理盐水 0.1 mL，B～F 组根据分组向髓腔注射 0.1 mL 不同浓度 MRSA；再次用骨蜡封闭注射器形成孔隙，防止菌液外漏。最后逐层缝合软组织及皮肤，切口以聚维酮碘消毒无菌纱布覆盖，按照统一标准单笼饲养。
1.3 观测指标
1.3.1 动物大体观察
术后 4 周观察切口愈合情况，皮温，有无红肿、流脓、窦道形成。根据唐辉等[15]的标准行大体观察评分：0 分，无感染征象；1 分，皮温增高，切口表面有红斑；2 分，切口处红肿，股骨增粗，窦道形成；3 分，骨质破坏严重，侵犯关节，有脓肿。
1.3.2 细菌学检查
术后 4 周用无菌棉签沾取伤口分泌物，生理盐水浸泡棉签后在琼脂培养基涂板，确定感染细菌种类。
1.3.3 血清 C 反应蛋白含量检测
术前及术后 2、4 周采取兔耳缘静脉血 2 mL，以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 15 min 后，取上层血清，30 min 内用兔 C 反应蛋白酶联反应测定试剂盒测定 C 反应蛋白含量。
1.3.4 影像学观察
术后 4 周行 X 线片和 CT 检查观察股骨变化及缺损闭合情况，采用 Norden 评分[16]进行影像学评分，包括 4 个指标：① 死骨形成：有，3 分；可疑，1.5 分；无，0 分。② 骨质破坏：有，2 分；可疑，1 分；无，0 分。③ 骨质增生：有，1 分；可疑，0.5 分；无，0 分。④ 软组织包块影：有，1 分；可疑，0.5 分；无，0 分。
1.3.5 标本大体观察及组织学观察
术后 4 周采用兔耳缘静脉空气栓塞处死动物，取出股骨标本，采用 Ambrose 标准[17]进行标本大体观察评分：3 分，显著脓肿；2 分，中等量脓肿；1 分，少量脓肿；0 分，无脓肿。将标本以甲醛固定 48 h，10%EDTA 脱钙液脱钙，每周换液 1 次，共 4 周；脱钙后行石蜡包埋，5 μm 厚组织切片，常规 HE 染色，光镜下观察骨内炎症情况。采用 Ambrose 标准进行组织学评分：① 炎症情况：3 分，严重炎症、纤维化、脓肿；2 分，中等炎症、纤维化；1 分，少量炎症、纤维化；0 分，无炎症仅纤维化。② 新骨形成比例：3 分，<25%；2 分，25%～50%；1 分，50%～75%；0 分，75%～100%。将两种评分取均值评价骨髓炎的严重程度。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 动物大体观察
术后 4 周内 A 组无动物死亡，切口愈合良好，皮温可，无红肿、脓肿、渗出及窦道形成。B 组术后 3 d 和 5 d 因感染过重分别死亡 2 只和 3 只动物；余 3 只感染侵犯至关节，脓肿形成，大量骨质破坏，死骨形成。C 组术后 7 d 因感染过重死亡 2 只动物；余 6 只中，2 只切口感染侵犯至关节，程度轻于 B 组；4 只切口红肿，股骨增粗，窦道形成。D、E、F 组无动物死亡。D 组 7 只兔切口红肿，股骨增粗，窦道形成；1 只兔切口红肿，但未形成窦道。E 组 6 只兔切口红肿，股骨略微增粗，尚未形成窦道；2 只兔切口皮温增高，红肿形成，尚未形成窦道。F 组 4 只切口红肿，皮温增高，尚未形成窦道；4 只切口皮温高，无红肿，皮肤处有红斑。见图 1。
A、B、C、D、E、F 组大体观察评分分别为 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.88±0.35）、（1.75±0.46）、（1.50±0.53）分，A 组评分显著低于其余各组，B 组显著高于其余各组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；C 组评分高于 D、E、F 组，D 组高于 E、F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 细菌学检查
A 组无切口红肿渗出，E 组 2 只、F 组 8 只切口未破溃形成窦道，因此未进行细菌学培养测定。B 组 3 只、C 组 6 只、D 组 8 只、E 组 6 只细菌培养结果阳性，确定为 MRSA。
2.3 血清 C 反应蛋白含量检测
术前各组间比较 C 反应蛋白含量差异均无统计学意义（P>0.05）。术后 2 周，B～F 组 C 反应蛋白含量均显著高于 A 组，B、C 组高于 D、E、F 组，D、E 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间及 D、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。术后 4 周，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。A 组术后 2、4 周 C 反应蛋白含量与术前比较差异无统计学意义（P>0.05），B～F 组术后 2、4 周显著高于术前（P<0.05）；A、F 组术后 2、4 周间比较差异无统计学意义（P>0.05），B～E 组术后 4 周显著高于术后 2 周（P<0.05）。见表 1。
表1
各组各时间点血清 C 反应蛋白含量比较（mg/mL，
）
Table1.
Comparison of serum C-reactive protein content at each time point of each group (mg/mL,
)
2.4 影像学观察
X 线片示：A 组软组织无肿胀，骨质无破坏，无死骨形成。B～F 组均见不同程度骨质破坏，死骨形成，其中 B 组软组织肿胀明显，侵犯至关节；C 组中 2 只侵犯至关节，但侵犯程度不及 B 组；D、E 组均可见死骨形成，股骨破坏肿胀，肿胀程度不及 B 组；F 组可见骨质破坏，骨质增生，破坏程度不及 D、E 组。见图 2。
CT 三维重建示：A 组可见股骨三维重建结构良好，无明显骨质破坏，股骨干平滑完整。B 组可见股骨结构破坏，关节处骨质破坏严重，大量死骨形成，骨质增生，股骨干显著增粗。C 组中有 2 只侵犯至膝关节，侵犯程度不及 B 组；其余可见股骨干增粗，股骨髁上骨质破坏严重，骨质增生，死骨形成。D、E 组可见股骨髁上骨质破坏，破坏程度不及 C 组，少量死骨形成。F 组可见股骨髁上骨质少许破坏，破坏程度不及 E 组。见图 3。
横断面 CT 示：A 组可见股骨干平滑完整，无死骨、骨质破坏及软组织肿胀。B 组可见股骨干靠近膝关节处严重破坏，大量死骨形成，骨质增生，软组织肿胀严重。C 组 2 只侵犯至膝关节，严重程度不及 B 组；其余可见股骨干增粗，局部死骨形成，骨质增生，软组织肿胀。D、E 组均可见股骨髁上股骨增粗，骨质破坏，死骨形成，软组织肿胀程度不及 C 组。F 组可见少量骨质破坏，部分实验动物可疑骨质增生，软组织未见明显肿胀。见图 4。
A、B、C、D、E、F 组 Norden 评分分别为 0、（6.50±0.86）、（5.92±0.86）、（5.12±0.69）、（4.75±0.80）、（3.69±0.26）分。B～F 组评分显著高于 A 组，B、C 组显著高于 D、E、F 组，D、E 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间及 D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 组织学观察
A、B、C、D、E、F 组标本大体观察评分分别为 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.75±0.46）、（1.62±0.52）、（1.37±0.52）分，B～F 组显著高于 A 组，B、C 组显著高于 D、E、F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
HE 染色示：A 组未见明显异常，骨小梁结构清晰可见，排列整齐完整，未见明显炎性细胞浸润；B 组可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，骨小梁破坏，骨细胞坏死，部分区域脓肿伴机化；C 组可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，骨小梁破坏程度不及 B 组，嗜伊红组织脓肿形成；D、E 组可见中等量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，骨小梁破坏程度不及 C 组，部分区域脓肿形成；F 组可见少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，骨小梁结构未见明显破坏。见图 5。A、B、C、D、E、F 组组织学评分分别为（0.13±0.35）、（2.67±0.58）、（1.67±0.82）、（1.38±0.52）、（1.13±0.35）、（0.75±0.71）分，B～F 组显著高于 A 组，B 组显著高于 C～F 组，C、D 组显著高于 F 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、D、E 组间以及 E、F 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
图1
术后 4 周各组兔大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure1. General observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图2
术后 4 周各组 X 线片观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure2. X-ray film observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图3
术后 4 周各组 CT 三维重建观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure3. CT three-dimensional observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图4
术后 4 周各组横断面 CT 观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure4. Cross section CT observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
图5
术后 4 周各组 HE 染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组
Figure5. HE staining observation of rabbits at 4 weeks after operation in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 讨论
慢性骨髓炎是骨科常见且严重的并发症。随着组织工程的发展，各种植入型器械在骨科应用越来越多，慢性骨髓炎是导致植入器械失败的重要原因之一；最终伤口迁延不愈，致病菌长期存在，抗生素耐药，死骨形成，窦道存在，病程时长，反复发作。随着抗生素的广泛使用，MRSA 已成为骨髓炎常见的致病菌。临床一旦确诊为 MRSA 所形成的慢性骨髓炎，需要更长住院时间及更多抗生素使用，给患者带来巨大的心理和生理负担[18]。
合适的动物模型在骨髓炎治疗研究中起着至关重要的作用。骨髓炎造模动物不同，实验所施加的干预措施也不同。常用的实验动物有犬、猪、兔、大鼠、小鼠等，由于兔经济实惠、占用饲养面积小、股骨大利于操作，故本实验采用兔股骨作为实验对象与部位。国内外报道的骨髓炎模型制备的菌液浓度不一致[19-20]，制备的细菌种类也不同[21-23]，且临床因 MRSA 形成的骨髓炎发生率逐渐上升，因此本实验选用 MRSA 为造模实验菌属。菌液浓度是制备骨髓炎模型的关键因素，菌液浓度高会造成较高的死亡率。本实验中，当注射菌液浓度为 1×109 CFU/mL 时，动物存活率仅 37.5%（3/8），且存活的模型感染程度均较重。但浓度太低，造模结果也不尽如人意。根据文献报道[18]，研究者使用金黄色葡萄球菌造模浓度至少在 1×105 CFU/mL 以上才可能有较高的感染率。MRSA 与金黄色葡萄球菌类似，故我们选用浓度为 1×105～1×109 CFU/mL 的 MRSA 进行筛选。本研究结果发现，适宜的造模浓度为 1×106～1×107 CFU/mL，大于文献报道的 1×105 CFU/mL，可能与既往文献未使用硬化剂及骨蜡封闭，造成菌液外溢，外部软组织为细菌提供了良好的生存环境有关。
在制备过程中，硬化剂的选择也较为关键。本实验的预实验中发现，未注射硬化剂可造成兔死亡只数增加，可能是因菌液进入血液循环导致死亡。本研究选用 5% 鱼肝油酸钠[24-25]，它可以使骨局部微循环栓塞，阻断微循环，使得菌液进入血液的量减少，防止脓毒血症的发生，也为细菌生长提供了良好环境。这种方法简单易操作，是骨髓炎造模中较合适的方法。
综上述，在兔股骨慢性骨髓炎模型制备过程中，硬化剂的选用及合适浓度的 MRSA 是造模关键。本实验结果提示，制备 MRSA 所形成的兔股骨慢性骨髓炎适宜的菌液浓度为 1×106～1×107 CFU/mL，该方法重复性高，制备模型较统一。
