引用本文： 陈家磊, 刘明, 段鑫, 黄富国, 项舟. BMP-7/聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球对兔 BMSCs 增殖和成软骨分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(4): 428-433. doi: 10.7507/1002-1892.201711093 复制
关节疾病主要表现在软骨的病变，由于关节软骨的营养主要靠关节液渗透供给，所以软骨损伤很难自身痊愈[1]。组织工程技术利用干细胞经体外培养，在含有生长因子的营养环境下被种植到具有生物相容性的三维支架上，再将细胞-支架复合体移植到体内，在生长因子的促进下，干细胞扩增并向软骨细胞分化，最终形成新的软骨结构，从而修复软骨缺损[2]。但单纯生长因子在体内半衰期短，容易被蛋白酶降解，对于较大骨缺损，生长因子不能持续发挥作用，即在有效时间内无法作用于更多靶细胞，从而影响其体内功效[3]。解决方案之一是缓释微球载负生长因子，持续释放生长因子促使种子细胞分化。但是，目前研究微球缓释的生长因子大多作用于成骨细胞或成软骨细胞，而对于缓释微球对上述细胞的前体细胞，如 BMSCs 的影响缺乏相应研究。因此，本实验通过体外实验探讨载负 BMP-7 的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］缓释微球对兔 BMSCs 增殖和向软骨细胞方向分化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3～5 日龄新西兰乳兔 4 只，雌雄不限，体质量 150～200 g，由四川大学华西医院动物实验中心提供。
PLGA（85∶15；上海博泰生物科技有限公司）；软骨分化培养基［含 0.001% 地塞米松、0.03% 抗坏血酸、1%ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）、0.01% 丙酮酸钠、0.01% 脯氨酸、1%TGF-β3 的 H-DMEM 培养基；Cyagen 公司，美国］；番红 O 试剂盒、甲苯胺蓝试剂盒、Ⅱ型胶原免疫组织化学试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；生物技术级牛血清白蛋白（Biotoped 公司，美国）；鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体（Merck 公司，德国）；二氯甲烷、丙酮（天津富宇精细化工有限公司）。5702 型离心机（Eppendorf 公司，德国）；倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）；冷冻干燥机（Labconco 公司，美国）；酶标仪（Tecan 公司，奥地利）；超声波破碎仪（Dr. Hielscher 公司，德国）。
1.2 BMP-7/PLGA 缓释微球的制备
参照文献［4］介绍的复乳化-液中干燥法制备 BMP-7/PLGA 缓释微球。具体方法：将 10 μg BMP-7 加入 20 mL 生理盐水中，4℃ 下溶解，抽取 0.1 mL 上述液体加入生理盐水至 1 mL，加入 100 mg 牛血清白蛋白作为内水相；室温条件下将 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷∶丙酮混合溶液（体积比为 3∶1）中作为油相；1% 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）水溶液作为外水相。将 100 μL 内水相逐滴滴入油相中，超声乳化 25 s（强度 30%）形成初乳；将初乳逐滴滴入 25 mL 外水相中，4℃ 磁力搅拌挥发 4 h 形成复乳；将复乳倒入离心管中，以离心半径 25 cm、3 500 r/min 离心 5 min，去离子水洗涤后再次离心，反复操作 4 遍，直至清除多余 PVA。将样品–20℃ 冷冻保存 48 h，冷冻干燥 24 h，收集缓释微球粉末待用。
1.3 BMP-7/PLGA 缓释微球体外释放液的制备
分析天平称取 10 份 10 mg BMP-7/PLGA 缓释微球粉末，分别置于 10 个 5 mL 玻璃瓶中，无菌膜包裹后立即经 60Co γ 射线辐照灭菌（剂量 20 kGy，时间 9.5 h）后，加入至 20 mL 软骨分化培养基中，置于 37℃ 恒温摇床中以 50 r/min 振荡，分别于第 1、3、7、14、21 天收集上清液作为体外释放液（记为体外释放液 a、b、c、d、e），–20℃ 保存备用。
1.4 BMSCs 分离培养及实验分组
取 3～5 日龄新西兰乳兔双侧股骨及胫骨，按照文献［5］方法进行 BMSCs 的分离、传代、培养。取第 3 代 BMSCs 以 1×104个/孔密度接种于 96 孔板，每孔 200 μL，在含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中培养 24 h 后分为微球组和对照组。微球组在每 2～3 天换液过程中更换为 200 μL 不同时间点的 BMP-7/PLGA 缓释微球体外释放液，对照组使用等体积软骨分化培养基。其中，微球组培养 1 d 时使用体外释放液 a，3、5 d 时使用体外释放液 b，7、9、11 d 时使用体外释放液 c，14、16、19 d 时使用体外释放液 d，21 d 时使用体外释放液 e。
1.5 观测指标
1.5.1 细胞增殖能力测定
采用 MTT 法检测两组细胞增殖能力。分别于培养 1、3、7、14、21 d 后加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，37℃、5%CO2、95% 湿度培养箱连续孵育 4 h；终止培养后弃除孔内上清液，加入 DMSO 150 μL，振荡 10 min 使结晶物充分溶解；酶标仪上测定各孔 490 nm 波长处吸光度（A）值。
1.5.2 成软骨细胞分化能力测定
① 组织学及免疫组织化学染色观察：培养 21 d 后取出两组细胞，常规行番红 O 染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，倒置相差显微镜下观察。② 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量检测：分别取两组细胞在 1、3、7、14、21 d 换液时的培养液 100 μL，加入至含 1.5 mL 1.5% 阿利新蓝染液的试管内，室温放置 10 min，酶标仪在 490 nm 波长下进行比色，测其 A 值。以硫酸软骨素制作标准对照曲线，计算出两组各时间点培养液内 GAG 含量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞增殖能力测定
培养 1、3、7 d，两组细胞均迅速增殖；7 d 后对照组增殖速度变缓，微球组仍呈持续快速增殖。培养 1、3、7 d 两组 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）；14、21 d 微球组A 值显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
2.2 成软骨细胞分化能力测定
2.2.1 组织学及免疫组织化学染色
培养 21 d，番红 O 染色示，微球组几乎所有细胞核被染成红色，而对照组仅有部分细胞核为红色。甲苯胺蓝染色示，微球组几乎所有细胞核出现异染性紫红色，部分细胞核甚至出现蓝色；而对照组仅有部分细胞核异染，极少数细胞核为蓝色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，微球组绝大多数细胞核呈黄色或棕黄色，Ⅱ型胶原表达为强阳性，部分细胞周围也可见弱阳性表达；而对照组仅有部分细胞为弱阳性表达，细胞周围也无阳性表达。见图 2。
2.2.2 GAG 含量检测
培养各时间点两组细胞 GAG 含量均呈持续增高趋势，7 d 后对照组增高趋势减缓，微球组仍呈持续高分泌状态。培养 1、3、7 d 两组 GAG 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；14、21 d 微球组 GAG 含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图1
MTT 法检测两组细胞增殖情况
Figure1.
The cell proliferation of 2 groups detected by MTT assay
图2
培养 21 d 两组细胞组织学和免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×100）
a. 微球组番红 O 染色；b. 对照组番红 O 染色；c. 微球组甲苯胺蓝染色；d. 对照组甲苯胺蓝染色；e. 微球组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色；f. 对照组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
Figure2. Histological and immunohistological staining of chondro inducted BMSCs in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Safranine O staining in microsphere group; b. Safranine O staining in control group; c. Toluidine blue staining in microsphere group; d. Toluidine blue staining in control group; e. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in microsphere group; f. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in control group
图3
培养各时间点两组细胞 GAG 含量比较
Figure3.
Comparison of GAG content between 2 groups at diffe rent time points
3 讨论
研究发现单纯生长因子在体内半衰期短，容易被蛋白酶降解，对于较大的骨缺损，生长因子在有效时间内无法作用于更多靶细胞，从而限制了临床应用[6-7]。因此需要研究在现有支架基础上引入生长因子缓释系统。目前主要思路有 2 点：① 生长因子基因转染种子细胞使其不断分泌有活性的生长因子，进而促使种子细胞分化[6]；② 缓释微球载负生长因子，持续释放生长因子促使种子细胞分化[8-9]。对于第 2 种方式，学者们展开了深入研究。微球是指直径 10～40 μm 的微小颗粒，这一概念由 van Wezel 于 1967 年提出[10]。我们的前期实验利用复乳化-液中干燥法制备 BMP-7/PLGA 缓释微球，结果显示成球良好，球体表面光滑致密，粒径为（14.45±5.97）μm，符合微球的定义。所以在体外采用复乳化-液中干燥法制备缓释微球是可行的。
微球在软骨组织工程中的应用具备众多优势。第一，细胞扩增是组织工程中必不可少的组成部分[11]。本研究 MTT 检测发现微球组的兔 BMSCs 持续快速增殖，在培养 7 d 内不仅保持较高增长率，同时在培养 14、21 d 后 A 值显著高于对照组，提示微球组中培养细胞所使用的体外释放液比对照组中所使用的软骨分化培养基能更好地促进细胞增殖。本实验不足之一是未研究该微球体外释放液的成分，故而促进细胞增殖的原理尚不清楚。但根据预实验中我们采用检测牛血清白蛋白含量以间接评估 BMP-7/PLGA 缓释微球载药量及包封率，并计算累积释药百分数、绘制释放曲线显示，缓释微球系统细胞增殖的促进作用可能与缓释微球不断释放的 BMP-7 有关，这需要将来进一步设计实验来证实。第二，微球可制备成支架，为细胞提供快速扩增所需的接近自然生长环境的三维空间，同时还能保持细胞的形态和功能[12-13]。Abdel-Fattah 等[14]使用热力烧结法使 PLGA 和壳聚糖成为完整的微球支架，其中 PLGA 微球支架呈多孔状，其孔径大小、孔隙率甚至机械性质都类似于松质骨。第三，微球可以作为分散相植入连续相中，如固态聚合物或水凝胶中，可通过载负生物活性因子、改变孔隙率、机械强度或载细胞作用等，改善该合成物的理化性质和生物特性。有研究报道在聚氨酯支架中植入载负 BMP-2 的 PLGA 微球后，支架 BMP-2 的突释率较无微球支架降低，BMP-2 释放持续而稳定[15]。第四，作为载体的微球也可对生长因子的释放实现准确控制，这一点对骨与软骨的修复至关重要[16]。方法是通过对微球理化特性的修饰而改变微球的降解率，这样就可以控制不同生长因子的缓释曲线，从而实现不同生长因子的顺序控释。Richardson 等[17]使用不同修饰的 PLGA 微球分别载负 VEGF 和 PDGF，实现了两种生长因子的顺序控释。另一方面，也有研究通过使用不同微球达到上述目的。Basmanav 等[18]分别利用聚（4-乙烯基嘧啶）微球和藻酸盐微球载负 BMP-2 和 BMP-7，以实现这两种生物活性因子的顺序控释。
目前研究微球控释的生长因子大多作用于成骨细胞或成软骨细胞。如 Niu 等[19]制备载负 BMP-2 的壳聚糖微球，并研究其缓释效应及成骨活性，结果证实微球支架释放良好并可使成骨细胞 ALP 活性明显升高。Lee 等[20]用乳化交联法制备 TGF-β/壳聚糖微球后使其与软骨细胞共培养，结果表明软骨细胞分泌黏多糖含量明显增高。但是，目前软骨再生的流行策略之一是植入无细胞的工程化支架，将软骨下骨中的 BMSCs 作为种子细胞，通过生长因子诱导分化为软骨细胞[21]。目前对于控释微球对 BMSCs 向成骨、成软骨、成脂方向分化的影响缺乏相应研究。本研究对两组兔 BMSCs 成软骨细胞分化能力进行测定，培养 21 d 后番红 O 染色显示，微球组几乎所有细胞核被染成红色，而对照组仅有部分细胞核为红色。甲苯胺蓝染色示，微球组几乎所有细胞核出现异染性紫红色，部分细胞核甚至出现蓝色；而对照组仅有部分细胞核异染，极少数细胞核为蓝色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，微球组绝大多数细胞核呈黄色或棕黄色，Ⅱ型胶原表达为强阳性，部分细胞周围也可见弱阳性表达；而对照组仅有部分细胞为弱阳性表达，细胞周围也无阳性表达。说明与对照组相比，微球组中 BMSCs 分泌Ⅱ型胶原和糖胺多糖等软骨细胞特异蛋白的能力更持续，BMSCs 向软骨细胞分化的趋势更明显，BMP-7/PLGA 缓释微球的促软骨细胞分化作用更好。另一方面，与其促细胞增殖作用类似，通过本实验 BMP-7/PLGA 缓释微球的促软骨细胞分化作用是否由缓释微球中不断释放的 BMP-7 所致，结论尚不明确，仍需进一步设计实验来证实。
综上述，复乳化-液中干燥法制备的 BMP-7/PLGA 缓释微球在体外可更好地促进兔 BMSCs 增殖，同时也更好地促使兔 BMSCs 持续分泌Ⅱ型胶原和糖胺多糖等软骨细胞特异蛋白，具有促进兔 BMSCs 向软骨细胞分化的能力，可作为生长因子的载体用于进一步研究中。
关节疾病主要表现在软骨的病变，由于关节软骨的营养主要靠关节液渗透供给，所以软骨损伤很难自身痊愈[1]。组织工程技术利用干细胞经体外培养，在含有生长因子的营养环境下被种植到具有生物相容性的三维支架上，再将细胞-支架复合体移植到体内，在生长因子的促进下，干细胞扩增并向软骨细胞分化，最终形成新的软骨结构，从而修复软骨缺损[2]。但单纯生长因子在体内半衰期短，容易被蛋白酶降解，对于较大骨缺损，生长因子不能持续发挥作用，即在有效时间内无法作用于更多靶细胞，从而影响其体内功效[3]。解决方案之一是缓释微球载负生长因子，持续释放生长因子促使种子细胞分化。但是，目前研究微球缓释的生长因子大多作用于成骨细胞或成软骨细胞，而对于缓释微球对上述细胞的前体细胞，如 BMSCs 的影响缺乏相应研究。因此，本实验通过体外实验探讨载负 BMP-7 的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］缓释微球对兔 BMSCs 增殖和向软骨细胞方向分化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3～5 日龄新西兰乳兔 4 只，雌雄不限，体质量 150～200 g，由四川大学华西医院动物实验中心提供。
PLGA（85∶15；上海博泰生物科技有限公司）；软骨分化培养基［含 0.001% 地塞米松、0.03% 抗坏血酸、1%ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）、0.01% 丙酮酸钠、0.01% 脯氨酸、1%TGF-β3 的 H-DMEM 培养基；Cyagen 公司，美国］；番红 O 试剂盒、甲苯胺蓝试剂盒、Ⅱ型胶原免疫组织化学试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；生物技术级牛血清白蛋白（Biotoped 公司，美国）；鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体（Merck 公司，德国）；二氯甲烷、丙酮（天津富宇精细化工有限公司）。5702 型离心机（Eppendorf 公司，德国）；倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）；冷冻干燥机（Labconco 公司，美国）；酶标仪（Tecan 公司，奥地利）；超声波破碎仪（Dr. Hielscher 公司，德国）。
1.2 BMP-7/PLGA 缓释微球的制备
参照文献［4］介绍的复乳化-液中干燥法制备 BMP-7/PLGA 缓释微球。具体方法：将 10 μg BMP-7 加入 20 mL 生理盐水中，4℃ 下溶解，抽取 0.1 mL 上述液体加入生理盐水至 1 mL，加入 100 mg 牛血清白蛋白作为内水相；室温条件下将 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷∶丙酮混合溶液（体积比为 3∶1）中作为油相；1% 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）水溶液作为外水相。将 100 μL 内水相逐滴滴入油相中，超声乳化 25 s（强度 30%）形成初乳；将初乳逐滴滴入 25 mL 外水相中，4℃ 磁力搅拌挥发 4 h 形成复乳；将复乳倒入离心管中，以离心半径 25 cm、3 500 r/min 离心 5 min，去离子水洗涤后再次离心，反复操作 4 遍，直至清除多余 PVA。将样品–20℃ 冷冻保存 48 h，冷冻干燥 24 h，收集缓释微球粉末待用。
1.3 BMP-7/PLGA 缓释微球体外释放液的制备
分析天平称取 10 份 10 mg BMP-7/PLGA 缓释微球粉末，分别置于 10 个 5 mL 玻璃瓶中，无菌膜包裹后立即经 60Co γ 射线辐照灭菌（剂量 20 kGy，时间 9.5 h）后，加入至 20 mL 软骨分化培养基中，置于 37℃ 恒温摇床中以 50 r/min 振荡，分别于第 1、3、7、14、21 天收集上清液作为体外释放液（记为体外释放液 a、b、c、d、e），–20℃ 保存备用。
1.4 BMSCs 分离培养及实验分组
取 3～5 日龄新西兰乳兔双侧股骨及胫骨，按照文献［5］方法进行 BMSCs 的分离、传代、培养。取第 3 代 BMSCs 以 1×104个/孔密度接种于 96 孔板，每孔 200 μL，在含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中培养 24 h 后分为微球组和对照组。微球组在每 2～3 天换液过程中更换为 200 μL 不同时间点的 BMP-7/PLGA 缓释微球体外释放液，对照组使用等体积软骨分化培养基。其中，微球组培养 1 d 时使用体外释放液 a，3、5 d 时使用体外释放液 b，7、9、11 d 时使用体外释放液 c，14、16、19 d 时使用体外释放液 d，21 d 时使用体外释放液 e。
1.5 观测指标
1.5.1 细胞增殖能力测定
采用 MTT 法检测两组细胞增殖能力。分别于培养 1、3、7、14、21 d 后加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，37℃、5%CO2、95% 湿度培养箱连续孵育 4 h；终止培养后弃除孔内上清液，加入 DMSO 150 μL，振荡 10 min 使结晶物充分溶解；酶标仪上测定各孔 490 nm 波长处吸光度（A）值。
1.5.2 成软骨细胞分化能力测定
① 组织学及免疫组织化学染色观察：培养 21 d 后取出两组细胞，常规行番红 O 染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，倒置相差显微镜下观察。② 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量检测：分别取两组细胞在 1、3、7、14、21 d 换液时的培养液 100 μL，加入至含 1.5 mL 1.5% 阿利新蓝染液的试管内，室温放置 10 min，酶标仪在 490 nm 波长下进行比色，测其 A 值。以硫酸软骨素制作标准对照曲线，计算出两组各时间点培养液内 GAG 含量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞增殖能力测定
培养 1、3、7 d，两组细胞均迅速增殖；7 d 后对照组增殖速度变缓，微球组仍呈持续快速增殖。培养 1、3、7 d 两组 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）；14、21 d 微球组A 值显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
2.2 成软骨细胞分化能力测定
2.2.1 组织学及免疫组织化学染色
培养 21 d，番红 O 染色示，微球组几乎所有细胞核被染成红色，而对照组仅有部分细胞核为红色。甲苯胺蓝染色示，微球组几乎所有细胞核出现异染性紫红色，部分细胞核甚至出现蓝色；而对照组仅有部分细胞核异染，极少数细胞核为蓝色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，微球组绝大多数细胞核呈黄色或棕黄色，Ⅱ型胶原表达为强阳性，部分细胞周围也可见弱阳性表达；而对照组仅有部分细胞为弱阳性表达，细胞周围也无阳性表达。见图 2。
2.2.2 GAG 含量检测
培养各时间点两组细胞 GAG 含量均呈持续增高趋势，7 d 后对照组增高趋势减缓，微球组仍呈持续高分泌状态。培养 1、3、7 d 两组 GAG 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；14、21 d 微球组 GAG 含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图1
MTT 法检测两组细胞增殖情况
Figure1.
The cell proliferation of 2 groups detected by MTT assay
图2
培养 21 d 两组细胞组织学和免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×100）
a. 微球组番红 O 染色；b. 对照组番红 O 染色；c. 微球组甲苯胺蓝染色；d. 对照组甲苯胺蓝染色；e. 微球组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色；f. 对照组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
Figure2. Histological and immunohistological staining of chondro inducted BMSCs in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Safranine O staining in microsphere group; b. Safranine O staining in control group; c. Toluidine blue staining in microsphere group; d. Toluidine blue staining in control group; e. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in microsphere group; f. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in control group
图3
培养各时间点两组细胞 GAG 含量比较
Figure3.
Comparison of GAG content between 2 groups at diffe rent time points
3 讨论
研究发现单纯生长因子在体内半衰期短，容易被蛋白酶降解，对于较大的骨缺损，生长因子在有效时间内无法作用于更多靶细胞，从而限制了临床应用[6-7]。因此需要研究在现有支架基础上引入生长因子缓释系统。目前主要思路有 2 点：① 生长因子基因转染种子细胞使其不断分泌有活性的生长因子，进而促使种子细胞分化[6]；② 缓释微球载负生长因子，持续释放生长因子促使种子细胞分化[8-9]。对于第 2 种方式，学者们展开了深入研究。微球是指直径 10～40 μm 的微小颗粒，这一概念由 van Wezel 于 1967 年提出[10]。我们的前期实验利用复乳化-液中干燥法制备 BMP-7/PLGA 缓释微球，结果显示成球良好，球体表面光滑致密，粒径为（14.45±5.97）μm，符合微球的定义。所以在体外采用复乳化-液中干燥法制备缓释微球是可行的。
微球在软骨组织工程中的应用具备众多优势。第一，细胞扩增是组织工程中必不可少的组成部分[11]。本研究 MTT 检测发现微球组的兔 BMSCs 持续快速增殖，在培养 7 d 内不仅保持较高增长率，同时在培养 14、21 d 后 A 值显著高于对照组，提示微球组中培养细胞所使用的体外释放液比对照组中所使用的软骨分化培养基能更好地促进细胞增殖。本实验不足之一是未研究该微球体外释放液的成分，故而促进细胞增殖的原理尚不清楚。但根据预实验中我们采用检测牛血清白蛋白含量以间接评估 BMP-7/PLGA 缓释微球载药量及包封率，并计算累积释药百分数、绘制释放曲线显示，缓释微球系统细胞增殖的促进作用可能与缓释微球不断释放的 BMP-7 有关，这需要将来进一步设计实验来证实。第二，微球可制备成支架，为细胞提供快速扩增所需的接近自然生长环境的三维空间，同时还能保持细胞的形态和功能[12-13]。Abdel-Fattah 等[14]使用热力烧结法使 PLGA 和壳聚糖成为完整的微球支架，其中 PLGA 微球支架呈多孔状，其孔径大小、孔隙率甚至机械性质都类似于松质骨。第三，微球可以作为分散相植入连续相中，如固态聚合物或水凝胶中，可通过载负生物活性因子、改变孔隙率、机械强度或载细胞作用等，改善该合成物的理化性质和生物特性。有研究报道在聚氨酯支架中植入载负 BMP-2 的 PLGA 微球后，支架 BMP-2 的突释率较无微球支架降低，BMP-2 释放持续而稳定[15]。第四，作为载体的微球也可对生长因子的释放实现准确控制，这一点对骨与软骨的修复至关重要[16]。方法是通过对微球理化特性的修饰而改变微球的降解率，这样就可以控制不同生长因子的缓释曲线，从而实现不同生长因子的顺序控释。Richardson 等[17]使用不同修饰的 PLGA 微球分别载负 VEGF 和 PDGF，实现了两种生长因子的顺序控释。另一方面，也有研究通过使用不同微球达到上述目的。Basmanav 等[18]分别利用聚（4-乙烯基嘧啶）微球和藻酸盐微球载负 BMP-2 和 BMP-7，以实现这两种生物活性因子的顺序控释。
目前研究微球控释的生长因子大多作用于成骨细胞或成软骨细胞。如 Niu 等[19]制备载负 BMP-2 的壳聚糖微球，并研究其缓释效应及成骨活性，结果证实微球支架释放良好并可使成骨细胞 ALP 活性明显升高。Lee 等[20]用乳化交联法制备 TGF-β/壳聚糖微球后使其与软骨细胞共培养，结果表明软骨细胞分泌黏多糖含量明显增高。但是，目前软骨再生的流行策略之一是植入无细胞的工程化支架，将软骨下骨中的 BMSCs 作为种子细胞，通过生长因子诱导分化为软骨细胞[21]。目前对于控释微球对 BMSCs 向成骨、成软骨、成脂方向分化的影响缺乏相应研究。本研究对两组兔 BMSCs 成软骨细胞分化能力进行测定，培养 21 d 后番红 O 染色显示，微球组几乎所有细胞核被染成红色，而对照组仅有部分细胞核为红色。甲苯胺蓝染色示，微球组几乎所有细胞核出现异染性紫红色，部分细胞核甚至出现蓝色；而对照组仅有部分细胞核异染，极少数细胞核为蓝色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，微球组绝大多数细胞核呈黄色或棕黄色，Ⅱ型胶原表达为强阳性，部分细胞周围也可见弱阳性表达；而对照组仅有部分细胞为弱阳性表达，细胞周围也无阳性表达。说明与对照组相比，微球组中 BMSCs 分泌Ⅱ型胶原和糖胺多糖等软骨细胞特异蛋白的能力更持续，BMSCs 向软骨细胞分化的趋势更明显，BMP-7/PLGA 缓释微球的促软骨细胞分化作用更好。另一方面，与其促细胞增殖作用类似，通过本实验 BMP-7/PLGA 缓释微球的促软骨细胞分化作用是否由缓释微球中不断释放的 BMP-7 所致，结论尚不明确，仍需进一步设计实验来证实。
综上述，复乳化-液中干燥法制备的 BMP-7/PLGA 缓释微球在体外可更好地促进兔 BMSCs 增殖，同时也更好地促使兔 BMSCs 持续分泌Ⅱ型胶原和糖胺多糖等软骨细胞特异蛋白，具有促进兔 BMSCs 向软骨细胞分化的能力，可作为生长因子的载体用于进一步研究中。
