引用本文： 张东力, 刘文, 吴向东, 何小强, 林枭, 黄伟. 新型纳米羟基磷灰石/聚氨酯复合材料治疗慢性骨髓炎的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(7): 880-886. doi: 10.7507/1002-1892.201802049 复制
慢性骨髓炎是创伤和矫形外科手术中常见的、潜在的灾难性并发症[1-4]，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌[5-6]。左氧氟沙星（levofloxacin，Lev）已被证明可应用于治疗慢性骨髓炎，并具有对葡萄球菌抗菌活性强、骨渗透性强、低毒性等优点[7-9]。载 Lev 介孔二氧化硅纳米微球（Lev@mesoporous silica microspheres，Lev@MSNs）/纳米羟基磷灰石（nano hydroxyapatite，n-HA）/聚氨酯（polyurethane，PU）（Lev@MSNs/n-HA/PU）是本课题组新合成的复合材料，我们的前期研究已揭示了该材料具有抗感染以及促进新生骨形成的能力[10]。本研究将进一步探讨其代替骨水泥治疗慢性骨髓炎的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
SPF 级成年雌性新西兰兔 50 只，体质量（2.2±0.1）kg，由重庆医科大学动物实验中心提供。
金黄色葡萄球菌的标准菌株（ATCC 25923）由重庆医科大学附属第一医院感染科提供，于 37℃ 营养肉汤管中培养细菌，24 h 后将细菌转移至无菌 PBS 液中，浓度稀释至 3×107 CFU/mL[10]。Lev（国家食品药品检验所）；Palacos R+G 骨水泥粉末（Heraeus 公司，德国）。扫描电镜（日立公司，日本）；EXAKT 300 CP 钻石切割系统（EXAKT 公司，德国）；SANS CMT5105 万能力学试验机［深圳美特斯工业系统（中国）有限公司］。
1.2 材料制备及表面结构观察
MSNs 及 n-HA 采用本课题组前期研究报道方法制备[11-13]，通过原位聚合法和同步发泡法生成 Lev@MSNs/n-HA/PU 支架[14]，并通过前期研究步骤[10]分别制备出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的载 1 mg 和 5 mg Lev 的复合物（1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU）。另外，将 5 mg Lev 与 Palacos R+G 骨水泥粉末混合，加入 0.95 mL 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）液体，快速混匀后填入模具中制备出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的 Lev@PMMA。所有材料均使用 15 kGy 60Co 辐照灭菌。
取 5 mg Lev@PMMA 和 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU，用金膜包裹材料，使用扫描电镜观察其表面结构。
1.3 实验分组及方法
取 50 只新西兰兔，采用 Norden[15]的方法用 3×107 CFU/mL 浓度的金黄色葡萄球菌菌液制备右侧胫骨慢性骨髓炎模型，4 周后行 X 线片检查，其中 2 只实验动物未观察到明显感染征象；其余动物造模后 4 周体温显著升高（P<0.05），符合慢性骨感染征象，且 X 线片上观察到骨髓炎征象，如骨质破坏、软组织肿胀、骨膜反应及骨硬化症等表现，处死其中 3 只行胫骨细菌培养，结果均为阳性，提示造模成功。将造模成功的 45 只动物随机分为 4 组，于右胫骨皮质开窗，空白对照组（A 组，n=9）仅行彻底清创术；B、C、D 组（n=12）彻底清创后分别植入材料 5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。术中严格遵守无菌原则。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况观察
术前及术后每日监测实验动物的体温、体质量等指标。
1.4.2 X 线片观察
术后 12 周取各组实验动物，行右胫骨 X 线片检查，观察骨愈合情况。
1.4.3 大体观察
X 线片观察后过量麻醉处死各组动物，逐层分离后肢皮肤和软组织，显露右胫骨，行大体形态观察胫骨骨质破坏及植入物周围新生骨的情况。
1.4.4 组织学观察
术后 12 周处死动物后每组随机取 3 个右侧胫骨样本，4% 多聚甲醛固定，冲洗标本，梯度乙醇逐级脱水，包埋液浸泡。采用 EXAKT 300 CP 钻石切割系统切片，片厚 30 μm，行亚甲基蓝/酸性品红染色，光镜下观察。
1.4.5 植入物-骨界面扫描电镜观察
B、C、D 组各随机选取 3 个右侧胫骨标本，小心清理移植体表面软组织，扫描电镜观察植入材料-骨组织界面新生骨生长情况。
1.4.6 生物力学试验
每组取 6 只实验动物的右侧胫骨，修剪半月板及软组织后固定骨标本，使用 SANS CMT5105 万能力学试验机进行压缩试验，活塞完全覆盖关节面并向下以 2 mm/min 施加垂直压缩力直至骨折发生，由仪器自动记录最大压缩力。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较以及组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料表面结构观察
扫描电镜观察示，5 mg Lev@PMMA 材料表面粗糙，呈不规则颗粒状；5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 材料可观察到典型的 n-HA 疏松多孔特征，材料孔隙大小范围为 200～500 μm，适合骨组织再生。见图 1。
2.2 一般情况观察
A 组动物体质量持续下降至术后 12 周；B 组术后体质量虽增加，但术后 12 周较术前及 A 组各时间点差异无统计学意义（P>0.05）；C 组术后各时间点体质量差异均无统计学意义（P>0.05），与 A 组比较各时间点差异亦无统计学意义（P>0.05）；D 组术后 3 周体质量明显增加，术后 12 周较术前显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），且与 A、C 组术后 12 周比较差异有统计学意义（P<0.05），与 B 组术后 12 周比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2a。
A 组治疗后体温继续上升，于术后 6 周达峰值，12 周时略下降；B 组体温维持术前水平至术后 12 周略下降，但与术前比较差异无统计学意义（P>0.05）；C 组手术前后各时间点体温比较差异均无统计学意义（P>0.05）；而 D 组体温持续下降，术后 12 周较术前体温显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），且与 A 组术后 12 周比较差异有统计学意义（P<0.05），与 B、C 组术后 12 周比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2b。
2.3 X 线片观察
术后 12 周，A 组可见广泛骨质破坏及明显的骨膜反应，炎症感染较术前更严重，波及胫骨中下段；B 组可见炎症得到较好控制，无骨质破坏或软组织肿胀，但 PMMA 材料占位效应明显；C 组发现轻微骨膜反应及软组织肿胀，提示感染未获得良好控制；D 组可观察到材料降解、体积减小，新骨生长覆盖缺损部位，骨愈合表现良好。见图 3。
2.4 大体观察
A 组发现大面积骨缺损及广泛的骨质破坏，胫骨近端已完全被炎症感染破坏；B 组无明显骨质破坏等感染表现，胫骨近端保持正常形态，但材料-骨间隙明显，材料结构完整，无新生骨长入；C 组也见材料-骨间隙存在，可见髓腔增大，无明显新生骨围绕材料生长；D 组发现骨缺损修复良好，材料已出现明显降解，骨组织与其紧密结合，大量新生骨包绕材料周围及覆盖材料表面。见图 4。
2.5 组织学观察
A 组未见明显新生骨形成且观察到死腔；B 组见植入物与骨组织存在间隙，间隙周围骨壁仅有少量新生骨，未沿植入物表面爬行，界面骨改建不活跃；C 组植入物与部分骨组织间可观察到间隙，新生骨小梁稀疏，少量新骨与旧骨间界面明显，新生骨向植入物表面爬行缓慢；D 组见植入物周围有大量成骨细胞，可见类骨质，界面骨吸收、骨形成活跃，新生骨围绕材料表面及穿过材料的孔隙生长，外周骨修复区已改建形成成熟板状骨，新生骨小梁排列整齐，结构增粗，较致密且连续。见图 5。
2.6 植入物-骨界面扫描电镜观察
B 组无新生骨向材料表面生长，可见材料凸出，其界面粗糙，且与骨组织间有明显界限；C 组可见材料-骨组织界面有纤维组织形成，未见新生骨形成，有明显的腔隙存在；而 D 组见材料界面平坦，其与骨组织的界限已变得模糊，之间形成明显的骨性连接，材料表面也观察到有新生骨长入。见图 6。
2.7 生物力学试验
术后 12 周 A、B、C、D 组最大压缩力分别为（281±98）、（450±120）、（355±71）、（503±101）N，B、D 组最大压缩力显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、D 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图1
材料表面结构扫描电镜观察
a. 5 mg Lev@PMMA（×50）；b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU（×25）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the surface structure of the materialsa. 5 mg Lev@PMMA (×50); b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU (×25)
图2
各组动物手术前后体质量和体温比较
a. 体质量；b. 体温
Figure2. Comparison of the body weight and body temperature in each group before and after operationa. Body weight; b. Body temperature
图3
术前及术后 12 周各组 X 线片观察
a. 术前；b. 术后 A 组；c. 术后 B 组；d. 术后 C 组；e. 术后 D 组
Figure3. X-ray films observation of each group before and at 12 weeks after operationa. Preoperative; b. Group A at postoperation; c. Group B at postoperation; d. Group C at postoperation; e. Group D at postoperation
图4
术后 12 周各组标本大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure4. Gross observation of the specimen of each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图5
术后 12 周各组亚甲基蓝/酸性品红染色观察（×200）
黑箭头示植入物，黄箭头示新生骨 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure5. Methylene blue/acid fuchsin staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200)The black arrow indicated biomaterials, yellow arrow indicated new bone a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图6
术后 12 周植入物-骨界面扫描电镜观察
红箭头示植入物，黑箭头示植入物-骨组织界面，绿箭头示纤维组织，蓝箭头示新生骨a. B 组（×100）；b. C 组（×25）；c. D 组（×25）；d. D 组（×700）
Figure6. Scanning electron microscope observation of the bone-implant interface at 12 weeks after operationThe red arrow indicated biomaterials, black arrow indicated the interface between biomaterial and bone, green arrow indicated fibrous tissue, blue arrow indicated new bone a. Group B (×100); b. Group C (×25); c. Group D (×25); d. Group D (×700)
3 讨论
研究报道开放性骨折 3 个月内出现严重感染的发生率高达 27%[16]，而开放性骨折发生后其深部感染率为 2%～50%[17]。胫骨是人体发生开放性骨折和骨感染最常见的部位[18]。广泛切除感染骨组织可有效降低慢性骨髓炎复发的风险，但彻底清创常导致节段性骨缺损[19]。Lev 为广谱抗生素，已被多数专家推荐用于治疗骨感染[20]，且其相对分子质量小，易被 MSNs 装载[21]。有研究报道 n-HA/PU 对成骨细胞 MG63 具有良好的骨诱导性能[22]。本课题组前期研究将 n-HA/PU 与 Lev@MSNs 复合，发现其植入体内后可使炎性细胞减少，新骨量及新生胶原纤维增加。本研究拟进一步揭示该新型复合材料治疗慢性骨感染的骨修复能力，并评估其后期生物力学性能。
研究者发现骨水泥中抗生素可释放量较低，且植入体内后药物释放不稳定[23-25]。据报道，骨水泥珠在植入人体内 5 年后，PMMA 将成为体内的异物，由释放抗生素的载体转变为培养耐药菌的温床[26]。而本研究的新型复合材料可在植入后 12 周内逐渐降解，在长期治疗中无需二次手术取出，且其降解速度合适，降解过程中不断有新生骨生长替代。
本研究中，A 组治疗后体质量持续下降而体温继续上升，而 D 组植入材料 12 周后体质量明显增加，体温明显下降，较治疗前有显著差异，说明其感染控制良好。X 线片及大体观察也显示 D 组胫骨炎症破坏终止，可为新生骨生长提供有利环境，从而加快骨修复进程，与前期研究一致[10]，可能与 Lev@MSNs/n-HA/PU 抗生素缓释效应延长药物有效浓度时间有关。而扫描电镜观察显示，与 D 组相比，C 组材料-骨界面形成纤维连接及有明显间隙，结合前期研究分析原因，可能由于其植入物附近胫骨中 Lev 浓度较低，抑菌性不足，未有效控制骨感染而影响新生骨生长。
扫描电镜及组织学观察示，B 组中未见明显新生骨形成，是由于 PMMA 不具有微孔结构和骨传导作用，新生骨无法长入材料形成生物固定。而 D 组在感染控制的基础上表现出良好的骨传导性能，见其骨修复区改建为成熟板状骨，新生骨小梁排列整齐，新生骨组织向植入物表面延伸生长较快。Mastrogiacomo 等[27]研究将一种羟基磷灰石支架承载 BMSCs 后植入免疫缺陷小鼠体内，其联通孔直径大多数超过 200 μm，较联通孔直径大多数<100 μm 的支架诱导新生骨生长作用更强。本研究中，D 组新型材料孔隙大小范围为 200～500 μm，见其孔隙内有明显的新生骨形成，也表明其孔隙结构适合新生骨生长。
根据 Li 等[28]报道，评价骨皮质承载能力的最佳方法是纵向压缩试验，本研究选用此方法评估材料的生物力学性能。结果显示，PMMA 的生物惰性阻碍了其界面的骨吸收及骨形成，因而不能获得最理想的生物力学性能。5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 组材料与骨组织结合紧密并形成坚强的骨性连接，植入后新生骨沿其构架逐步爬行，可有效修复感染性骨缺损，与 PMMA 相比具有更好的生物相容性，故表现出良好的抗压缩性能。
综上述，该新型 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 复合材料可有效抑制兔胫骨慢性骨髓炎炎症，植入 12 周后表现出良好的骨传导性和骨修复能力，以及较好的生物力学性能，有望成为治疗慢性骨感染的新型骨替代物。但其长期的生物安全性还需通过监测血药浓度及肝肾病理切片等方法进一步论证，而植入体内后长期的疗效和风险在本研究中并未评估。因此新型材料 Lev@MSNs/n-HA/PU 距临床应用尚需要进一步研究证据。
慢性骨髓炎是创伤和矫形外科手术中常见的、潜在的灾难性并发症[1-4]，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌[5-6]。左氧氟沙星（levofloxacin，Lev）已被证明可应用于治疗慢性骨髓炎，并具有对葡萄球菌抗菌活性强、骨渗透性强、低毒性等优点[7-9]。载 Lev 介孔二氧化硅纳米微球（Lev@mesoporous silica microspheres，Lev@MSNs）/纳米羟基磷灰石（nano hydroxyapatite，n-HA）/聚氨酯（polyurethane，PU）（Lev@MSNs/n-HA/PU）是本课题组新合成的复合材料，我们的前期研究已揭示了该材料具有抗感染以及促进新生骨形成的能力[10]。本研究将进一步探讨其代替骨水泥治疗慢性骨髓炎的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
SPF 级成年雌性新西兰兔 50 只，体质量（2.2±0.1）kg，由重庆医科大学动物实验中心提供。
金黄色葡萄球菌的标准菌株（ATCC 25923）由重庆医科大学附属第一医院感染科提供，于 37℃ 营养肉汤管中培养细菌，24 h 后将细菌转移至无菌 PBS 液中，浓度稀释至 3×107 CFU/mL[10]。Lev（国家食品药品检验所）；Palacos R+G 骨水泥粉末（Heraeus 公司，德国）。扫描电镜（日立公司，日本）；EXAKT 300 CP 钻石切割系统（EXAKT 公司，德国）；SANS CMT5105 万能力学试验机［深圳美特斯工业系统（中国）有限公司］。
1.2 材料制备及表面结构观察
MSNs 及 n-HA 采用本课题组前期研究报道方法制备[11-13]，通过原位聚合法和同步发泡法生成 Lev@MSNs/n-HA/PU 支架[14]，并通过前期研究步骤[10]分别制备出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的载 1 mg 和 5 mg Lev 的复合物（1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU）。另外，将 5 mg Lev 与 Palacos R+G 骨水泥粉末混合，加入 0.95 mL 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）液体，快速混匀后填入模具中制备出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的 Lev@PMMA。所有材料均使用 15 kGy 60Co 辐照灭菌。
取 5 mg Lev@PMMA 和 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU，用金膜包裹材料，使用扫描电镜观察其表面结构。
1.3 实验分组及方法
取 50 只新西兰兔，采用 Norden[15]的方法用 3×107 CFU/mL 浓度的金黄色葡萄球菌菌液制备右侧胫骨慢性骨髓炎模型，4 周后行 X 线片检查，其中 2 只实验动物未观察到明显感染征象；其余动物造模后 4 周体温显著升高（P<0.05），符合慢性骨感染征象，且 X 线片上观察到骨髓炎征象，如骨质破坏、软组织肿胀、骨膜反应及骨硬化症等表现，处死其中 3 只行胫骨细菌培养，结果均为阳性，提示造模成功。将造模成功的 45 只动物随机分为 4 组，于右胫骨皮质开窗，空白对照组（A 组，n=9）仅行彻底清创术；B、C、D 组（n=12）彻底清创后分别植入材料 5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。术中严格遵守无菌原则。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况观察
术前及术后每日监测实验动物的体温、体质量等指标。
1.4.2 X 线片观察
术后 12 周取各组实验动物，行右胫骨 X 线片检查，观察骨愈合情况。
1.4.3 大体观察
X 线片观察后过量麻醉处死各组动物，逐层分离后肢皮肤和软组织，显露右胫骨，行大体形态观察胫骨骨质破坏及植入物周围新生骨的情况。
1.4.4 组织学观察
术后 12 周处死动物后每组随机取 3 个右侧胫骨样本，4% 多聚甲醛固定，冲洗标本，梯度乙醇逐级脱水，包埋液浸泡。采用 EXAKT 300 CP 钻石切割系统切片，片厚 30 μm，行亚甲基蓝/酸性品红染色，光镜下观察。
1.4.5 植入物-骨界面扫描电镜观察
B、C、D 组各随机选取 3 个右侧胫骨标本，小心清理移植体表面软组织，扫描电镜观察植入材料-骨组织界面新生骨生长情况。
1.4.6 生物力学试验
每组取 6 只实验动物的右侧胫骨，修剪半月板及软组织后固定骨标本，使用 SANS CMT5105 万能力学试验机进行压缩试验，活塞完全覆盖关节面并向下以 2 mm/min 施加垂直压缩力直至骨折发生，由仪器自动记录最大压缩力。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较以及组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料表面结构观察
扫描电镜观察示，5 mg Lev@PMMA 材料表面粗糙，呈不规则颗粒状；5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 材料可观察到典型的 n-HA 疏松多孔特征，材料孔隙大小范围为 200～500 μm，适合骨组织再生。见图 1。
2.2 一般情况观察
A 组动物体质量持续下降至术后 12 周；B 组术后体质量虽增加，但术后 12 周较术前及 A 组各时间点差异无统计学意义（P>0.05）；C 组术后各时间点体质量差异均无统计学意义（P>0.05），与 A 组比较各时间点差异亦无统计学意义（P>0.05）；D 组术后 3 周体质量明显增加，术后 12 周较术前显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），且与 A、C 组术后 12 周比较差异有统计学意义（P<0.05），与 B 组术后 12 周比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2a。
A 组治疗后体温继续上升，于术后 6 周达峰值，12 周时略下降；B 组体温维持术前水平至术后 12 周略下降，但与术前比较差异无统计学意义（P>0.05）；C 组手术前后各时间点体温比较差异均无统计学意义（P>0.05）；而 D 组体温持续下降，术后 12 周较术前体温显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），且与 A 组术后 12 周比较差异有统计学意义（P<0.05），与 B、C 组术后 12 周比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2b。
2.3 X 线片观察
术后 12 周，A 组可见广泛骨质破坏及明显的骨膜反应，炎症感染较术前更严重，波及胫骨中下段；B 组可见炎症得到较好控制，无骨质破坏或软组织肿胀，但 PMMA 材料占位效应明显；C 组发现轻微骨膜反应及软组织肿胀，提示感染未获得良好控制；D 组可观察到材料降解、体积减小，新骨生长覆盖缺损部位，骨愈合表现良好。见图 3。
2.4 大体观察
A 组发现大面积骨缺损及广泛的骨质破坏，胫骨近端已完全被炎症感染破坏；B 组无明显骨质破坏等感染表现，胫骨近端保持正常形态，但材料-骨间隙明显，材料结构完整，无新生骨长入；C 组也见材料-骨间隙存在，可见髓腔增大，无明显新生骨围绕材料生长；D 组发现骨缺损修复良好，材料已出现明显降解，骨组织与其紧密结合，大量新生骨包绕材料周围及覆盖材料表面。见图 4。
2.5 组织学观察
A 组未见明显新生骨形成且观察到死腔；B 组见植入物与骨组织存在间隙，间隙周围骨壁仅有少量新生骨，未沿植入物表面爬行，界面骨改建不活跃；C 组植入物与部分骨组织间可观察到间隙，新生骨小梁稀疏，少量新骨与旧骨间界面明显，新生骨向植入物表面爬行缓慢；D 组见植入物周围有大量成骨细胞，可见类骨质，界面骨吸收、骨形成活跃，新生骨围绕材料表面及穿过材料的孔隙生长，外周骨修复区已改建形成成熟板状骨，新生骨小梁排列整齐，结构增粗，较致密且连续。见图 5。
2.6 植入物-骨界面扫描电镜观察
B 组无新生骨向材料表面生长，可见材料凸出，其界面粗糙，且与骨组织间有明显界限；C 组可见材料-骨组织界面有纤维组织形成，未见新生骨形成，有明显的腔隙存在；而 D 组见材料界面平坦，其与骨组织的界限已变得模糊，之间形成明显的骨性连接，材料表面也观察到有新生骨长入。见图 6。
2.7 生物力学试验
术后 12 周 A、B、C、D 组最大压缩力分别为（281±98）、（450±120）、（355±71）、（503±101）N，B、D 组最大压缩力显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、D 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图1
材料表面结构扫描电镜观察
a. 5 mg Lev@PMMA（×50）；b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU（×25）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the surface structure of the materialsa. 5 mg Lev@PMMA (×50); b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU (×25)
图2
各组动物手术前后体质量和体温比较
a. 体质量；b. 体温
Figure2. Comparison of the body weight and body temperature in each group before and after operationa. Body weight; b. Body temperature
图3
术前及术后 12 周各组 X 线片观察
a. 术前；b. 术后 A 组；c. 术后 B 组；d. 术后 C 组；e. 术后 D 组
Figure3. X-ray films observation of each group before and at 12 weeks after operationa. Preoperative; b. Group A at postoperation; c. Group B at postoperation; d. Group C at postoperation; e. Group D at postoperation
图4
术后 12 周各组标本大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure4. Gross observation of the specimen of each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图5
术后 12 周各组亚甲基蓝/酸性品红染色观察（×200）
黑箭头示植入物，黄箭头示新生骨 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure5. Methylene blue/acid fuchsin staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200)The black arrow indicated biomaterials, yellow arrow indicated new bone a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图6
术后 12 周植入物-骨界面扫描电镜观察
红箭头示植入物，黑箭头示植入物-骨组织界面，绿箭头示纤维组织，蓝箭头示新生骨a. B 组（×100）；b. C 组（×25）；c. D 组（×25）；d. D 组（×700）
Figure6. Scanning electron microscope observation of the bone-implant interface at 12 weeks after operationThe red arrow indicated biomaterials, black arrow indicated the interface between biomaterial and bone, green arrow indicated fibrous tissue, blue arrow indicated new bone a. Group B (×100); b. Group C (×25); c. Group D (×25); d. Group D (×700)
3 讨论
研究报道开放性骨折 3 个月内出现严重感染的发生率高达 27%[16]，而开放性骨折发生后其深部感染率为 2%～50%[17]。胫骨是人体发生开放性骨折和骨感染最常见的部位[18]。广泛切除感染骨组织可有效降低慢性骨髓炎复发的风险，但彻底清创常导致节段性骨缺损[19]。Lev 为广谱抗生素，已被多数专家推荐用于治疗骨感染[20]，且其相对分子质量小，易被 MSNs 装载[21]。有研究报道 n-HA/PU 对成骨细胞 MG63 具有良好的骨诱导性能[22]。本课题组前期研究将 n-HA/PU 与 Lev@MSNs 复合，发现其植入体内后可使炎性细胞减少，新骨量及新生胶原纤维增加。本研究拟进一步揭示该新型复合材料治疗慢性骨感染的骨修复能力，并评估其后期生物力学性能。
研究者发现骨水泥中抗生素可释放量较低，且植入体内后药物释放不稳定[23-25]。据报道，骨水泥珠在植入人体内 5 年后，PMMA 将成为体内的异物，由释放抗生素的载体转变为培养耐药菌的温床[26]。而本研究的新型复合材料可在植入后 12 周内逐渐降解，在长期治疗中无需二次手术取出，且其降解速度合适，降解过程中不断有新生骨生长替代。
本研究中，A 组治疗后体质量持续下降而体温继续上升，而 D 组植入材料 12 周后体质量明显增加，体温明显下降，较治疗前有显著差异，说明其感染控制良好。X 线片及大体观察也显示 D 组胫骨炎症破坏终止，可为新生骨生长提供有利环境，从而加快骨修复进程，与前期研究一致[10]，可能与 Lev@MSNs/n-HA/PU 抗生素缓释效应延长药物有效浓度时间有关。而扫描电镜观察显示，与 D 组相比，C 组材料-骨界面形成纤维连接及有明显间隙，结合前期研究分析原因，可能由于其植入物附近胫骨中 Lev 浓度较低，抑菌性不足，未有效控制骨感染而影响新生骨生长。
扫描电镜及组织学观察示，B 组中未见明显新生骨形成，是由于 PMMA 不具有微孔结构和骨传导作用，新生骨无法长入材料形成生物固定。而 D 组在感染控制的基础上表现出良好的骨传导性能，见其骨修复区改建为成熟板状骨，新生骨小梁排列整齐，新生骨组织向植入物表面延伸生长较快。Mastrogiacomo 等[27]研究将一种羟基磷灰石支架承载 BMSCs 后植入免疫缺陷小鼠体内，其联通孔直径大多数超过 200 μm，较联通孔直径大多数<100 μm 的支架诱导新生骨生长作用更强。本研究中，D 组新型材料孔隙大小范围为 200～500 μm，见其孔隙内有明显的新生骨形成，也表明其孔隙结构适合新生骨生长。
根据 Li 等[28]报道，评价骨皮质承载能力的最佳方法是纵向压缩试验，本研究选用此方法评估材料的生物力学性能。结果显示，PMMA 的生物惰性阻碍了其界面的骨吸收及骨形成，因而不能获得最理想的生物力学性能。5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 组材料与骨组织结合紧密并形成坚强的骨性连接，植入后新生骨沿其构架逐步爬行，可有效修复感染性骨缺损，与 PMMA 相比具有更好的生物相容性，故表现出良好的抗压缩性能。
综上述，该新型 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 复合材料可有效抑制兔胫骨慢性骨髓炎炎症，植入 12 周后表现出良好的骨传导性和骨修复能力，以及较好的生物力学性能，有望成为治疗慢性骨感染的新型骨替代物。但其长期的生物安全性还需通过监测血药浓度及肝肾病理切片等方法进一步论证，而植入体内后长期的疗效和风险在本研究中并未评估。因此新型材料 Lev@MSNs/n-HA/PU 距临床应用尚需要进一步研究证据。
