引用本文： 沈师, 陈明学, 高爽, 郭维民, 王振勇, 李浩江, 李旭, 张彬, 鲜海, 张学亮, 刘舒云, 郝立波, 卓乃强, 郭全义. 3D 打印制备聚己内酯/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架及其理化特性的研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(9): 1205-1210. doi: 10.7507/1002-1892.201803074 复制
半月板损伤是一种常见的运动损伤，随着参与体育锻炼的人越来越多，半月板损伤发病率呈逐年上升趋势。由于半月板特殊的解剖学结构[1]，临床治疗半月板损伤以部分或全部切除为主[2]。半月板切除能短暂恢复功能和缓解症状，但明显增加骨关节炎的患病风险[3-5]。组织工程的发展为半月板损伤的再生修复提供了新希望。组织工程的关键要素包括支架材料、种子细胞及生物因子[6-7]，因此选择合适的支架材料非常重要。大量研究表明，Ⅰ型胶原有利于软骨细胞黏附、增殖和分化，且有利于软骨细胞最终形成纤维软骨[8-9]。聚己内酯（polycaprolactone，PCL）具有较好的力学特性，但生物相容性较差，细胞亲和力较低。
与传统支架制造技术相比，3D 打印技术具有良好的重复性和对支架微观结构和形状的控制[10]。此外，低温沉积技术 3D 打印可以实现 PCL、Ⅰ型胶原溶液一体化打印，并且不会破坏Ⅰ型胶原蛋白。为此，本课题组提出采用低温沉积技术 3D 打印构建 PCL/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架（以下简称 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架），以期提供既具有良好力学支撑，又有利于半月板细胞黏附、增殖及维持表型的支架材料。我们前期预实验发现 15%PCL/4%Ⅰ型胶原溶液黏性最佳，本次实验在此基础上通过低温沉积技术 3D 打印制备 PCL/Ⅰ型型胶原半月板支架，观察支架形态、微观结构、理化性能以及细胞毒性，为其体内研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
成年新西兰大白兔 1 只，体质量 2.5 kg；3～4 周龄新西兰大白兔 3 只，体质量 0.5～0.6 kg，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心。PCL、牛跟腱Ⅰ型胶原、胶原酶、0.25% 胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）；六氟异丙醇、1，4-二氧六环［阿拉丁试剂（中国）有限公司］；FBS（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基（Corning 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（同仁公司，日本）；链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）。
冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；计算机辅助设计软件 UG（Siemens 公司，德国）；3D 生物打印机（青岛尤尼科技有限公司）；S-4800 型扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；BOSE 5100 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；傅氏转换红外线光谱分析仪（Ettlingen 公司，德国）；Nuona SL-200B 滴状分析系统（美国科诺工业有限公司）；CO2 培养箱（Heraeus 公司，德国）；Micro-CT（GE Healthcare 公司，英国）。
1.2 实验方法
1.2.1 PCL/Ⅰ型胶原溶液以及 PCL 溶液的制备
根据预实验结果，称取 1.5 g PCL，分别加入 10 mL 含不同浓度（0、4%）Ⅰ型胶原的 1，4-二氧六环与六氟异丙醇（比例为 9∶1）溶液中，制备 15%PCL 溶液和 15% PCL/4% Ⅰ型胶原溶液。
1.2.2 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架的制备
取 1 只成年新西兰大白兔，空气栓塞处死后，取出内侧半月板并行 CT 扫描，将获得的半月板数据导入计算机辅助设计软件中，设计放射状与环形交叉的楔形取向性的半月板支架模型。然后，将半月板支架模型数据以 STL 格式导入 3D 打印控制软件中；打印参数：平台成型温度–20℃，打印层厚 0.1 mm，打印速度 10 mm/s。
将 1.2.1 中制备的两种溶液分别加入 3D 生物打印机料筒中进行打印，半月板支架初步成型后，依次行以下处理：–20℃ 冰柜保存 4 h，冷冻干燥，乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺交联，再次冷冻干燥，75% 乙醇浸泡 24 h，去离子水浸泡 10 次、每次 5 min，60Co 灭菌。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架均常温下保存备用。
1.3 观测指标
1.3.1 支架形态及微观结构观测
取两种支架大体观察其形态，然后冷冻干燥、喷金后，扫描电镜观察支架微观结构（大孔直径>200 μm、微孔直径<100 μm）。
1.3.2 支架力学性能检测
采用 BOSE 5100 生物力学试验机进行力学测试。① 压缩力学测试：将两种支架样本制备为 10 mm×10 mm×5 mm 柱状体，PBS 缓冲液浸润后进行压缩力学测试。预压缩 5%，压缩速率为 5 mm/min，压缩 20 个循环后进行正式测试，最大压缩 20%，获得应力-应变曲线，计算压缩模量。② 拉伸力学测试：将两种支架制备为 16 mm×10 mm×2 mm 的长方体，PBS 缓冲液浸润后进行拉伸力学测试。预拉伸 5%，拉伸 20 个循环后进行正式测试，获得应力-应变曲线，计算拉伸模量。
1.3.3 红外光谱分析
取 1.2.1 中制备的 PCL 溶液、PCL/Ⅰ型胶原溶液，冷冻干燥后获得与两种支架成分相同的样品。将样品切成 10 mm×10 mm 的正方形片，以反射模式进行红外光谱分析，扫描范围为 650～4 000 cm–1，鉴定支架的官能团。
1.3.4 表面接触角检测
取 1.2.1 中制备的 PCL 溶液、PCL/Ⅰ型胶原溶液，冷冻干燥后获得与两种支架成分相同的样品。用 27G 钝针微注射器将去离子水滴至样品表面，滴状分析系统捕获去离子水下落图像。根据水滴形状计算表面接触角，实验重复 5 次。
1.3.5 支架体外细胞毒性评估
① 兔半月板细胞分离培养：取 3～4 周龄新西兰大白兔半月板组织，参照本课题组前期研究方法[11]分离培养半月板细胞，并传代。取第 3 代细胞进行实验。② 支架浸提液制备及 CCK-8 细胞毒性实验：根据 ISO 10993-12：2009 标准，将两种支架样品分别浸入 DMEM 培养基中，支架浸提比为 3 cm2/mL，于（37±1）℃ 条件下温育 72 h。然后取浸提液用 100 μm 膜过滤，于浸提液中加入 FBS 至浓度为 10%（V/V）、双抗至浓度为 1%（V/V），获得两种支架的浸提液培养基。将半月板细胞接种至 96 孔板，每孔含 3×103 个细胞。每组有 5 个平行样本，对应加入 100 μL 浸提液培养基，于 37℃、5% CO2 培养箱内培养 1、3、5 d 后，分别加入 10 μL CCK-8 试剂，继续孵育 2.5 h 后，用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度（A）值。以正常培养基培养细胞作为对照。
③ 支架-细胞复合物制备及扫描电镜观察：将 1.3.2 中两种支架的力学标准件剪裁成 5 mm×5 mm×2 mm 大小，60Co 灭菌消毒。于半月板细胞中加入 DMEM 培养基，制备成浓度为 1×106 个/mL 的细胞悬液后，分别接种至两种支架上，每个支架 100 μL。置于 37℃、5% CO2 培养箱孵育 3 h 后，加入 DMEM 培养液，继续培养 1 d 后取出支架-细胞复合物，置于 2.5% 戊二醛固定 3 d，梯度乙醇脱水后，临界点干燥，样品喷金后，扫描电镜观察细胞在支架表面黏附及生长情况。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 支架形态及微观结构观测
大体观察，两种支架形态呈环向与径向交叉的楔形形状。见图 1。扫描电镜观察，两种半月板支架表面均可见大孔及棱径上的微孔，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面较粗糙，而 PCL 半月板支架表面较光滑； PCL 半月板支架棱径上的微孔中无纤维连接，而 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架棱径的微孔中有一些纤维连接。见图 2。
2.2 支架力学性能检测
PCL 半月板支架、PCL/Ⅰ型胶原半月板支架压缩模量分别为（2 830.04±734.83）、（2 531.61±497.88）kPa，拉伸模量分别为（2 057.17±250.30）、（1 937.27±200.45）kPa，比较差异无统计学意义（t=0.752，P=0.474；t=0.836，P=0.427）。
2.3 红外光谱分析
PCL 半月板支架光谱图示，在约 1 722 cm–1处存在羰基特征峰，在约 1 165 cm –1处特征峰对应于 PCL 中的 C-O 键。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架光谱图示，约 1 165 cm –1处特征峰对应的 C-O 键较 PCL 半月板支架减少；而约 1 722 cm–1处特征峰增加。提示 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架中 PCL 和Ⅰ型胶原成功混合。见图 3。
2.4 表面接触角检测
PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角为（83.19±7.49）°，较 PCL 半月板支架的（111.13±5.70）° 显著减小，差异有统计学意义（t=6.638，P=0.000）；而且，水滴可以被 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架吸收。
2.5 支架体外细胞毒性评估
CCK-8 检测显示，随时间推移，两种支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势；各时间点与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示两种支架均无细胞毒性。见图 4。
支架-细胞复合物扫描电镜观察半月板细胞均可在两种支架表面黏附、生长，其中 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面黏附的细胞多于 PCL 半月板支架。见图 5。
图1
半月板支架大体观察
a、b. PCL 半月板支架；c、d. PCL/Ⅰ型胶原半月板支架
Figure1. Gross observation of the meniscus scaffoldsa, b. PCL meniscus scaffolds; c, d. PCL/COLⅠmeniscus scaffolds
图2
半月板支架扫描电镜观察
从左至右分别为放大 100、2 000、5 000 倍 a. PCL 半月板支架；b. PCL/Ⅰ型胶原半月板支架
Figure2. Scanning electron microscope observation of the meniscus scaffoldsFrom left to right for the magnifications of 100, 2 000, and 5 000 times, respectively a. PCL meniscus scaffold; b. PCL/COLⅠ meniscus scaffold
图3
半月板支架红外光谱图
Figure3.
FTIR of the meniscus scaffolds
图4
CCK-8 检测半月支架细胞毒性
Figure4.
The cytotoxicity of the meniscus scaffolds by CCK-8
图5
支架-细胞复合物扫描电镜观察
a、b. 放大 150、300 倍下 PCL 半月板支架-细胞复合物；c、d. 放大 150、300 倍下 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架-细胞复合物
Figure5. Scanning electron microscope observation of scaffold-cell complexa, b. PCL meniscus scaffold-cell complex at the magnifications of 150 and 300 times; c, d. PCL/COL Ⅰ meniscus scaffold-cell complex at the magnifications of 150 and 300 times
3 讨论
研究发现，半月板大多数胶原纤维束呈环周形排列，少量胶原纤维呈放射状排列[12]。本研究以成年新西兰大白兔半月板为支架模型，采用低温沉积 3D 打印技术成功制备了具有环向与径向交叉的楔形形态的半月板支架，与天然半月板的微观结构一致。多孔径孔隙支架有利于细胞增殖、分化[13-14]，而且粗糙度高的材料比表面积大，可以增大细胞与材料的接触面积，从而利于细胞黏附、生长[15-16]。本研究扫描电镜结果显示，两种半月板支架均具有大孔及微孔，有利于营养的供给和代谢废物的排出，而且 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面比 PCL 半月板支架更粗糙，提示前者更有利于细胞黏附、生长。生物力学测试提示，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架拉伸模量及压缩模量与 PCL 半月板支架相比，差异均无统计学意义，但前者两指标实际测量值小于后者，分析可能与单位体积内 PCL 含量降低有关。红外光谱分析结果显示，PCL/Ⅰ型胶原支架材料特征峰与 PCL 支架材料相比发生了变化，证明Ⅰ型胶原蛋白和 PCL 成功混合。因为Ⅰ型胶原蛋白有益于软骨细胞的黏附、增殖和分化，且有利于软骨细胞最终形成纤维软骨[8, 17]，所以我们认为 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架比单纯 PCL 半月板支架更适合半月板损伤的再生修复。
Ghosal 等[18]研究发现 PCL 和胶原蛋白结合后，其表面接触角减小。本研究表面接触角检测结果示，当水滴滴向支架时，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角显著小于单纯 PCL 半月板支架表面接触角，提示Ⅰ型胶原的加入明显增加了半月板支架的亲水性，这与Ⅰ型胶原蛋白中存在亲水基团密切相关。Kirchhof 等[19]提出通常情况下，亲水性材料表面更益于细胞的黏附、生长。亲水性分析结果也从一方面提示了 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架的生物相容性优于 PCL 半月板支架。体外 CCK-8 细胞毒性实验进一步表明，低温沉积技术 3D 打印制备的 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架均无细胞毒性。体外支架-细胞复合物扫描电镜观察结果也验证了 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架材料较单纯 PCL 半月板支架材料有利于细胞黏附、生长。
由于半月板整体及微观结构和细胞外基质成分呈区域性变化，所以半月板是各向异性及不均一的组织，导致其生物力学也呈各向异性。本实验利用低温沉积 3D 打印技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架呈环向与径向交叉的楔形形态，基本实现了半月板整体及微观结构的仿生，一定程度实现了半月板生物力学的各向异性。但是构建结构和成分双仿生的组织工程半月板，达到完全生物力学各向异性还需要进一步研究。此外，本研究结果提示该支架具有优良的理化学性能及细胞黏性能，无细胞毒性，下一步我们将继续完善该支架材料的生物相容性评估及动物体内修复半月板的评价。
半月板损伤是一种常见的运动损伤，随着参与体育锻炼的人越来越多，半月板损伤发病率呈逐年上升趋势。由于半月板特殊的解剖学结构[1]，临床治疗半月板损伤以部分或全部切除为主[2]。半月板切除能短暂恢复功能和缓解症状，但明显增加骨关节炎的患病风险[3-5]。组织工程的发展为半月板损伤的再生修复提供了新希望。组织工程的关键要素包括支架材料、种子细胞及生物因子[6-7]，因此选择合适的支架材料非常重要。大量研究表明，Ⅰ型胶原有利于软骨细胞黏附、增殖和分化，且有利于软骨细胞最终形成纤维软骨[8-9]。聚己内酯（polycaprolactone，PCL）具有较好的力学特性，但生物相容性较差，细胞亲和力较低。
与传统支架制造技术相比，3D 打印技术具有良好的重复性和对支架微观结构和形状的控制[10]。此外，低温沉积技术 3D 打印可以实现 PCL、Ⅰ型胶原溶液一体化打印，并且不会破坏Ⅰ型胶原蛋白。为此，本课题组提出采用低温沉积技术 3D 打印构建 PCL/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架（以下简称 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架），以期提供既具有良好力学支撑，又有利于半月板细胞黏附、增殖及维持表型的支架材料。我们前期预实验发现 15%PCL/4%Ⅰ型胶原溶液黏性最佳，本次实验在此基础上通过低温沉积技术 3D 打印制备 PCL/Ⅰ型型胶原半月板支架，观察支架形态、微观结构、理化性能以及细胞毒性，为其体内研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
成年新西兰大白兔 1 只，体质量 2.5 kg；3～4 周龄新西兰大白兔 3 只，体质量 0.5～0.6 kg，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心。PCL、牛跟腱Ⅰ型胶原、胶原酶、0.25% 胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）；六氟异丙醇、1，4-二氧六环［阿拉丁试剂（中国）有限公司］；FBS（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基（Corning 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（同仁公司，日本）；链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）。
冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；计算机辅助设计软件 UG（Siemens 公司，德国）；3D 生物打印机（青岛尤尼科技有限公司）；S-4800 型扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；BOSE 5100 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；傅氏转换红外线光谱分析仪（Ettlingen 公司，德国）；Nuona SL-200B 滴状分析系统（美国科诺工业有限公司）；CO2 培养箱（Heraeus 公司，德国）；Micro-CT（GE Healthcare 公司，英国）。
1.2 实验方法
1.2.1 PCL/Ⅰ型胶原溶液以及 PCL 溶液的制备
根据预实验结果，称取 1.5 g PCL，分别加入 10 mL 含不同浓度（0、4%）Ⅰ型胶原的 1，4-二氧六环与六氟异丙醇（比例为 9∶1）溶液中，制备 15%PCL 溶液和 15% PCL/4% Ⅰ型胶原溶液。
1.2.2 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架的制备
取 1 只成年新西兰大白兔，空气栓塞处死后，取出内侧半月板并行 CT 扫描，将获得的半月板数据导入计算机辅助设计软件中，设计放射状与环形交叉的楔形取向性的半月板支架模型。然后，将半月板支架模型数据以 STL 格式导入 3D 打印控制软件中；打印参数：平台成型温度–20℃，打印层厚 0.1 mm，打印速度 10 mm/s。
将 1.2.1 中制备的两种溶液分别加入 3D 生物打印机料筒中进行打印，半月板支架初步成型后，依次行以下处理：–20℃ 冰柜保存 4 h，冷冻干燥，乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺交联，再次冷冻干燥，75% 乙醇浸泡 24 h，去离子水浸泡 10 次、每次 5 min，60Co 灭菌。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架均常温下保存备用。
1.3 观测指标
1.3.1 支架形态及微观结构观测
取两种支架大体观察其形态，然后冷冻干燥、喷金后，扫描电镜观察支架微观结构（大孔直径>200 μm、微孔直径<100 μm）。
1.3.2 支架力学性能检测
采用 BOSE 5100 生物力学试验机进行力学测试。① 压缩力学测试：将两种支架样本制备为 10 mm×10 mm×5 mm 柱状体，PBS 缓冲液浸润后进行压缩力学测试。预压缩 5%，压缩速率为 5 mm/min，压缩 20 个循环后进行正式测试，最大压缩 20%，获得应力-应变曲线，计算压缩模量。② 拉伸力学测试：将两种支架制备为 16 mm×10 mm×2 mm 的长方体，PBS 缓冲液浸润后进行拉伸力学测试。预拉伸 5%，拉伸 20 个循环后进行正式测试，获得应力-应变曲线，计算拉伸模量。
1.3.3 红外光谱分析
取 1.2.1 中制备的 PCL 溶液、PCL/Ⅰ型胶原溶液，冷冻干燥后获得与两种支架成分相同的样品。将样品切成 10 mm×10 mm 的正方形片，以反射模式进行红外光谱分析，扫描范围为 650～4 000 cm–1，鉴定支架的官能团。
1.3.4 表面接触角检测
取 1.2.1 中制备的 PCL 溶液、PCL/Ⅰ型胶原溶液，冷冻干燥后获得与两种支架成分相同的样品。用 27G 钝针微注射器将去离子水滴至样品表面，滴状分析系统捕获去离子水下落图像。根据水滴形状计算表面接触角，实验重复 5 次。
1.3.5 支架体外细胞毒性评估
① 兔半月板细胞分离培养：取 3～4 周龄新西兰大白兔半月板组织，参照本课题组前期研究方法[11]分离培养半月板细胞，并传代。取第 3 代细胞进行实验。② 支架浸提液制备及 CCK-8 细胞毒性实验：根据 ISO 10993-12：2009 标准，将两种支架样品分别浸入 DMEM 培养基中，支架浸提比为 3 cm2/mL，于（37±1）℃ 条件下温育 72 h。然后取浸提液用 100 μm 膜过滤，于浸提液中加入 FBS 至浓度为 10%（V/V）、双抗至浓度为 1%（V/V），获得两种支架的浸提液培养基。将半月板细胞接种至 96 孔板，每孔含 3×103 个细胞。每组有 5 个平行样本，对应加入 100 μL 浸提液培养基，于 37℃、5% CO2 培养箱内培养 1、3、5 d 后，分别加入 10 μL CCK-8 试剂，继续孵育 2.5 h 后，用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度（A）值。以正常培养基培养细胞作为对照。
③ 支架-细胞复合物制备及扫描电镜观察：将 1.3.2 中两种支架的力学标准件剪裁成 5 mm×5 mm×2 mm 大小，60Co 灭菌消毒。于半月板细胞中加入 DMEM 培养基，制备成浓度为 1×106 个/mL 的细胞悬液后，分别接种至两种支架上，每个支架 100 μL。置于 37℃、5% CO2 培养箱孵育 3 h 后，加入 DMEM 培养液，继续培养 1 d 后取出支架-细胞复合物，置于 2.5% 戊二醛固定 3 d，梯度乙醇脱水后，临界点干燥，样品喷金后，扫描电镜观察细胞在支架表面黏附及生长情况。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 支架形态及微观结构观测
大体观察，两种支架形态呈环向与径向交叉的楔形形状。见图 1。扫描电镜观察，两种半月板支架表面均可见大孔及棱径上的微孔，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面较粗糙，而 PCL 半月板支架表面较光滑； PCL 半月板支架棱径上的微孔中无纤维连接，而 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架棱径的微孔中有一些纤维连接。见图 2。
2.2 支架力学性能检测
PCL 半月板支架、PCL/Ⅰ型胶原半月板支架压缩模量分别为（2 830.04±734.83）、（2 531.61±497.88）kPa，拉伸模量分别为（2 057.17±250.30）、（1 937.27±200.45）kPa，比较差异无统计学意义（t=0.752，P=0.474；t=0.836，P=0.427）。
2.3 红外光谱分析
PCL 半月板支架光谱图示，在约 1 722 cm–1处存在羰基特征峰，在约 1 165 cm –1处特征峰对应于 PCL 中的 C-O 键。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架光谱图示，约 1 165 cm –1处特征峰对应的 C-O 键较 PCL 半月板支架减少；而约 1 722 cm–1处特征峰增加。提示 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架中 PCL 和Ⅰ型胶原成功混合。见图 3。
2.4 表面接触角检测
PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角为（83.19±7.49）°，较 PCL 半月板支架的（111.13±5.70）° 显著减小，差异有统计学意义（t=6.638，P=0.000）；而且，水滴可以被 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架吸收。
2.5 支架体外细胞毒性评估
CCK-8 检测显示，随时间推移，两种支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势；各时间点与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示两种支架均无细胞毒性。见图 4。
支架-细胞复合物扫描电镜观察半月板细胞均可在两种支架表面黏附、生长，其中 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面黏附的细胞多于 PCL 半月板支架。见图 5。
图1
半月板支架大体观察
a、b. PCL 半月板支架；c、d. PCL/Ⅰ型胶原半月板支架
Figure1. Gross observation of the meniscus scaffoldsa, b. PCL meniscus scaffolds; c, d. PCL/COLⅠmeniscus scaffolds
图2
半月板支架扫描电镜观察
从左至右分别为放大 100、2 000、5 000 倍 a. PCL 半月板支架；b. PCL/Ⅰ型胶原半月板支架
Figure2. Scanning electron microscope observation of the meniscus scaffoldsFrom left to right for the magnifications of 100, 2 000, and 5 000 times, respectively a. PCL meniscus scaffold; b. PCL/COLⅠ meniscus scaffold
图3
半月板支架红外光谱图
Figure3.
FTIR of the meniscus scaffolds
图4
CCK-8 检测半月支架细胞毒性
Figure4.
The cytotoxicity of the meniscus scaffolds by CCK-8
图5
支架-细胞复合物扫描电镜观察
a、b. 放大 150、300 倍下 PCL 半月板支架-细胞复合物；c、d. 放大 150、300 倍下 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架-细胞复合物
Figure5. Scanning electron microscope observation of scaffold-cell complexa, b. PCL meniscus scaffold-cell complex at the magnifications of 150 and 300 times; c, d. PCL/COL Ⅰ meniscus scaffold-cell complex at the magnifications of 150 and 300 times
3 讨论
研究发现，半月板大多数胶原纤维束呈环周形排列，少量胶原纤维呈放射状排列[12]。本研究以成年新西兰大白兔半月板为支架模型，采用低温沉积 3D 打印技术成功制备了具有环向与径向交叉的楔形形态的半月板支架，与天然半月板的微观结构一致。多孔径孔隙支架有利于细胞增殖、分化[13-14]，而且粗糙度高的材料比表面积大，可以增大细胞与材料的接触面积，从而利于细胞黏附、生长[15-16]。本研究扫描电镜结果显示，两种半月板支架均具有大孔及微孔，有利于营养的供给和代谢废物的排出，而且 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面比 PCL 半月板支架更粗糙，提示前者更有利于细胞黏附、生长。生物力学测试提示，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架拉伸模量及压缩模量与 PCL 半月板支架相比，差异均无统计学意义，但前者两指标实际测量值小于后者，分析可能与单位体积内 PCL 含量降低有关。红外光谱分析结果显示，PCL/Ⅰ型胶原支架材料特征峰与 PCL 支架材料相比发生了变化，证明Ⅰ型胶原蛋白和 PCL 成功混合。因为Ⅰ型胶原蛋白有益于软骨细胞的黏附、增殖和分化，且有利于软骨细胞最终形成纤维软骨[8, 17]，所以我们认为 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架比单纯 PCL 半月板支架更适合半月板损伤的再生修复。
Ghosal 等[18]研究发现 PCL 和胶原蛋白结合后，其表面接触角减小。本研究表面接触角检测结果示，当水滴滴向支架时，PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角显著小于单纯 PCL 半月板支架表面接触角，提示Ⅰ型胶原的加入明显增加了半月板支架的亲水性，这与Ⅰ型胶原蛋白中存在亲水基团密切相关。Kirchhof 等[19]提出通常情况下，亲水性材料表面更益于细胞的黏附、生长。亲水性分析结果也从一方面提示了 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架的生物相容性优于 PCL 半月板支架。体外 CCK-8 细胞毒性实验进一步表明，低温沉积技术 3D 打印制备的 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及 PCL 半月板支架均无细胞毒性。体外支架-细胞复合物扫描电镜观察结果也验证了 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架材料较单纯 PCL 半月板支架材料有利于细胞黏附、生长。
由于半月板整体及微观结构和细胞外基质成分呈区域性变化，所以半月板是各向异性及不均一的组织，导致其生物力学也呈各向异性。本实验利用低温沉积 3D 打印技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原半月板支架呈环向与径向交叉的楔形形态，基本实现了半月板整体及微观结构的仿生，一定程度实现了半月板生物力学的各向异性。但是构建结构和成分双仿生的组织工程半月板，达到完全生物力学各向异性还需要进一步研究。此外，本研究结果提示该支架具有优良的理化学性能及细胞黏性能，无细胞毒性，下一步我们将继续完善该支架材料的生物相容性评估及动物体内修复半月板的评价。
