引用本文： 谌斯, 杜昶. 具有开放孔结构的左旋聚乳酸/卵磷脂多孔支架的制备及成骨性能研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(9): 1123-1130. doi: 10.7507/1002-1892.201804127 复制
在骨组织工程中，支架作为细胞外基质，为细胞的黏附、生长、增殖和迁移提供适当的环境，同时还需要引导新组织的再生[1-2]。因此，支架除了需有良好的生物相容性、合适的孔径、孔隙率和强度外，还需要有适当的表面性能以便于细胞在支架上黏附、增殖和分化等[3-4]。左旋聚乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］具有良好的生物相容性，已被美国食品与药品监督管理局（FDA）允许用在外科手术缝合线、微胶囊、植入材料中[5]。但是 PLLA 亲水性比较差，分子链段上缺乏与细胞识别因子或其他生物活性分子相键合的官能团，不利于细胞在其表面黏附与生长，同时在生物矿化过程中缺乏成核位点，较难矿化[6-7]。
卵磷脂是由磷脂质和中性脂质构成的天然混合物。其中磷脂质是细胞膜的主要成分[8]，其化学结构中含有亲水的磷酸基极性基团和疏水的脂肪酰基长链，因此具有两亲性质，作为表面活性剂卵磷脂可以有效降低溶液的表面张力[9]。在之前的研究中，已经发现卵磷脂能够作为成核位点促进骨矿物的增长[10-11]。Park 等[12]利用卵磷脂作为表面活性剂，成功制备了表面光滑、一致性好的海藻酸钠/聚氧乙烯复合纳米纤维。除了具有良好的生物相容性外，卵磷脂还可以与 PLLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等聚合物以任意比例混合[13]。在 PLLA/卵磷脂复合材料中，卵磷脂含量的增加可以增加材料的亲水性，同时血管平滑肌细胞在卵磷脂含量 3%～7% 的共混膜材料上黏附和增殖程度有明显提高[14]。Zhu 等[15]最先将卵磷脂与 PLLA 结合制备组织工程膜材料，以提升 PLLA 的亲水性和生物相容性，同时保持 PLLA 的机械性能。Wang 等[16]制备了 PLLA/卵磷脂/纳米羟基磷灰石多孔支架，卵磷脂的加入显著增加了支架的亲水性，细胞在含有卵磷脂的支架上增殖和黏附情况更好。同时卵磷脂含量增加也会导致支架的机械性能降低，但卵磷脂含量为 10% 的支架其机械性能仍然高于松质骨的强度。徐忠华等[8]研究了 PLLA/卵磷脂共混物膜的血液相容性，发现 PLLA 中卵磷脂的含量在 5%～10% 时材料的血液相容性最佳。
本实验制备了具有开放孔和纳米纤维结构的 PLLA/卵磷脂支架，通过广角 X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）等方法研究卵磷脂的加入对 PLLA 相分离过程的影响，通过体外成骨细胞联合培养法观察细胞在支架上的增殖和分化情况，最后使用大鼠颅骨缺损修复模型观察支架在体内的骨修复情况，旨在寻找一种较好的骨组织工程支架，并为其在骨修复的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 24 只，体质量（280±10）g，由广东药科大学实验动物中心提供。
小鼠 BMSCs 购自美国 ATCC 细胞库，细胞编号 CRL-12424。细胞采用完全培养基（含 10%FBS 的 H-DMEM 培养基）于 37℃、5%CO2 环境下培养，每 2 天换液 1 次，待细胞密度达到约 90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，并按 1 ∶ 3 比例传代培养。
PLLA（相对分子质量 1×105，黏度 2.4 dL/g；山东岱罡生物材料有限公司）；卵磷脂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氧六环（分析纯）、醋酸（分析纯）（天津大茂化学试剂厂）；去离子水、Vitamin C（分析纯）、地塞米松（分析纯）［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；甘油磷酸钠（分析纯）（Merck 公司，德国）；培养基、FBS、链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）；PBS（武汉博士德生物工程有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（同仁化学研究所，日本）；ALP 活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；BCA 蛋白定量分析试剂盒［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；RNA 抽提试剂盒（带 DNA 过滤柱；广州美基生物科技有限公司）；反转录试剂盒（带 gDNA Eraser 试剂盒；Takara 公司，日本）；All-in-One qPCR Mix 试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）。JADE 5 软件（MDI 公司，美国）。
Quanta 200 扫描电镜（FEI 公司，荷兰）；Genesis G25EL4 冷冻干燥机（Virtis 公司，美国）；D8 ADVANCE XRD 仪（Bruker 公司，德国）；DIAMOND DSC 仪（PerkinElmer 公司，美国）；Thermo3001 酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；ZKKS-MCT-Sharp-Ⅱ Micro-CT 系统（广州中科恺盛医疗科技有限公司）。
1.2 PLLA/卵磷脂多孔支架制备
将 3%w/t PLLA 和不同比例（0、5%、10%、20%、30%、40%、50%）的卵磷脂溶于二氧六环与去离子水混合溶剂（混合比例为 88 ∶ 12）中，60℃ 下搅拌溶解 2 h 以得到均匀透明的溶液，随后将溶液分装并迅速转移至–80℃ 冰箱中相分离 2 h；之后用去离子水在 4℃ 冰箱内进行溶剂置换，每天换水 3 次，持续 2 d；最后经过真空冷冻干燥得到含不同比例卵磷脂（0、5%、10%、20%、30%、40%、50%）的 PLLA/卵磷脂多孔支架（分别对应为 A、B、C、D、E、F、G 组）。
1.3 观测指标
1.3.1 扫描电镜观察
取不同卵磷脂比例的 PLLA/卵磷脂多孔支架，经溅射镀膜机喷金处理 120 s 后，加速电压 5～15 kV 下采用扫描电镜观察支架表面形貌。
1.3.2 广角 XRD 检测
每组各取 6 个样本，Cu 靶，Kα 线（λ=0.154 2 nm），管电压 40 kV，管电流 40 mA；扫描角度 2θ=5～55°，扫描速率 0.2°/min。将得到的谱图数据使用 JADE 5 软件进行分析，并计算各样品的结晶度。
1.3.3 DSC 检测
参照文献[17-18]方法进行 DSC 检测并计算各样品结晶度。每组各取 6 个样本，氮气环境，温度范围为室温至 250℃，温度变化速率为 10℃/min。通过以下公式计算样品结晶度：χc=ΔHm/ΔHm0。其中 ΔHm 是测得的热焓值，ΔHm0 是 100% 结晶的聚合物的热焓值（PLLA 的 ΔHm0 为 135 J/g）。
1.3.4 吸水能力测试
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 10 mm 的圆柱体，测试前称量并记录干燥支架的质量（记为 md）。于 37℃ 环境下将支架置于 10 mL PBS 溶液中分别浸泡 5、15、30、60、120、180 min 后，再次称量支架质量（记为 ms），称量前用滤纸吸去支架表面残留水分。通过以下公式计算吸水率：（ms–md）/md×100%。
1.3.5 细胞增殖能力检测
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆柱形切片，灭菌后置于 48 孔板中，每孔接种 2×104 个第 5 代小鼠 BMSCs。培养 1、4、7 d 后，使用 CCK-8 法检测细胞在各支架表面的增殖情况。
1.3.6 成骨分化能力实验
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆柱形切片，灭菌后置于 48 孔板中，在每个支架上接种 3×104个第 5 代小鼠 BMSCs，采用完全培养基培养 1 d 后，改用成骨细胞诱导培养液（含 10%FBS、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L 甘油磷酸钠、0.05 mmol/L Vitamin C 的 H-DMEM 培养基）培养，每 2 天换液 1 次。参照文献[19]方法，于培养 7、14 d 后检测 ALP 活性。
1.3.7 动物体内骨修复实验
取 24 只 SD 大鼠，用水合氯醛（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，于头部正中作长约 1.5 cm 切口显露颅骨，在左右两侧对称钻孔形成双侧直径均为 5 mm 的颅骨缺损。将大鼠分为 4 个大组，每组 6 只。第 1 大组左右侧骨缺损处分别植入卵磷脂含量为 5%（A1 组）和 10%（B1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 2 大组左右侧分别植入卵磷脂含量为 20%（C1 组）和 30%（D1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 3 大组左右侧分别植入卵磷脂含量为 40%（E1 组）和 50%（F1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 4 大组左侧植入钻头取下的颅骨（G1 组），右侧不植入任何材料作为空白对照组（H1 组）。手术完成后缝合骨膜，逐层关闭切口。术后 3 d 每天注射 10 万 U 青霉素。术后 12 周处死动物，取出颅骨，用 PBS 润洗 3 次后，置于 4% 多聚甲醛溶液 4℃ 下浸泡 48 h。然后用 Micro-CT 对缺损处进行三维模型重建，并对缺损处的新生骨体积和骨矿物密度进行定量分析（G1 组为自体骨，未进行定量分析）。
1.4 统计学方法
采用临床医师统计学助手 V4.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 扫描电镜观察
支架内孔径均为 300～500 μm，孔与孔之间具有很好的联通性；支架内部则是孔径为 20～30 μm 的小孔。随着卵磷脂含量增加，PLLA/卵磷脂多孔支架仍然保持开放孔结构，支架孔径略微变小，但仍保持在 300 μm 以上。A 组单纯 PLLA 支架表面是由 100～500 nm 的 PLLA 纳米纤维构成；随着卵磷脂含量增加，PLLA 纳米纤维的排列方式由扇形逐渐变得杂乱无章，同时 PLLA 纤维变粗。当卵磷脂含量为 50%（G 组）时，支架表面出现了少量片状结构。见图 1。
2.2 广角 XRD 检测
A 组单纯 PLLA 支架的 XRD 图谱出现了 2 个特征结晶峰（110）/（200）和（203），分别对应 2θ=16.4° 和 18.8°，是典型的 α’型晶体的结晶峰[20]。随着卵磷脂含量的增加，XRD 谱图中特征峰的位置并未出现明显变化。见图 2。通过 JADE 5 软件计算得出，A、B、C、D、E、F、G 组支架的结晶度分别为 33.02%±1.78%、29.75%±2.92%、29.33%±3.79%、26.90%±2.11%、21.44%±4.62%、20.26%±2.78%、17.37%±1.91%，随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。
2.3 DSC 检测
DSC 测得的 A、B、C、D、E、F、G 组支架的结晶度分别为 45.54%±3.04%、44.83%±3.63%、44.23%±2.02%、43.51%±3.37%、39.98%±1.23%、36.17%±2.05%、35.83%±1.77%，随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。虽然与广角 XRD 测得的结晶度有少量偏差，但总体变化趋势一致。见图 3。
2.4 吸水能力测试
各时间点 A 组单纯 PLLA 支架吸水率均很低；随着卵磷脂含量增加，支架的吸水率呈逐渐增加趋势。见图 4。
2.5 细胞增殖能力检测
随培养时间增加，BMSCs 在各组支架上均有明显增殖。培养 1、4 d 时，各组吸光度（A）值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。培养 7 d 时，随卵磷脂含量增加，BMSCs 在支架上的增殖速率也随之提高，但当卵磷脂含量超过 30% 时，细胞增殖速率出现下降趋势；C、D、E、E 组A 值显著高于 A、B、G 组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
2.6 成骨分化实验
成骨诱导 7 d，各组支架 ALP 活性比较差异无统计学意义（P>0.05）。14 d 时，随卵磷脂含量增加，各组 ALP 活性出现了显著差异，D、E、F、G 组 ALP 活性显著高于 A、B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；D、E、F、G 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组成骨诱导 7、14 d ALP 活性检测（n=6，
）
Table1.
The ALP activity at 7 and 14 days after osteogenic induc tion in each group (n=6,
)
2.7 动物体内骨修复实验
Micro-CT 检测示，在不加入支架或支架中卵磷脂含量较低（A1、B1、C1、H1 组）的情况下，大鼠颅骨缺损仅在边缘处有少量新骨生成；而当卵磷脂含量为 30%（D1 组）时，颅骨缺损内部有显著新骨生成；之后继续提高卵磷脂含量（E1、F1 组），PLLA/卵磷脂多孔支架的骨修复效果反而降低。见图 6。新生骨体积和骨矿物密度结果也显示出了同样的趋势，D1 组两指标显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
术后 12 周各组新生骨体积和骨矿物密度检测（n=6，
）
Table2.
The bone volume and bone mineral density of each group at 12 weeks after operation (n=6,
)
图1
各组支架扫描电镜观察
左：×250 右：×20 k a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组；g. G 组（箭头示片状结构）
Figure1. SEM observation of scaffolds in each groupLeft: ×250 Right: ×20 k a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F; g. Group G (Arrows indicated the platelet-like structures)
图2
各组支架 XRD 图谱
Figure2.
The XRD patterns of scaffolds in each group
图3
各组支架 DSC 图谱
Figure3.
The DSC thermograms of scaffolds in each group
图4
各组支架吸水率检测
Figure4.
The water uptake ability of scaffolds in each group
图5
CCK-8 法检测各组支架上 BMSCs 增殖情况
Figure5.
The proliferation of BMSCs on each scaffold detected by CCK-8 method
图6
各组材料植入大鼠颅骨缺损处后 12 周 Micro-CT 检测
a. A1 组（左）和 B1 组（右）；b. C1 组（左）和 D1 组（右）；c. E1 组（左）和 F1 组（右）；d. G1 组（左）和 H1 组（右）
Figure6. Micro-CT results of rat skull defect in each group after repairing for 12 weeksa. Group A1 (left) and group B1 (right); b. Group C1 (left) and group D1 (right); c. Group E1 (left) and group F1 (right); d. Group G1 (left) and group H1 (right)
3 讨论
骨组织工程支架必须有足够大的孔径以保证骨修复效果，通常认为 200～400 μm 最适宜[21-22]；支架内部孔与孔之间良好的联通性也是组织顺利修复的必要条件[23]。本研究中通过热致相分离法制得的 PLLA/卵磷脂多孔支架具有合适的孔径和开放的孔结构，有利于营养物质和代谢废物的输送。同时在支架的孔壁上具有纳米纤维结构的 PLLA，既往研究中表明纳米纤维结构有利于细胞在支架表面的黏附、增殖与分化[24-25]。在热致相分离过程中，支架中孔的大小与结构主要受体系退火效果的影响[23]。在退火过程中富有机相与富溶剂相会各自相互融合，以降低两相间的界面自由能。而卵磷脂作为一种两亲性的表面活性剂，能够有效降低界面自由能，从而在相分离过程中稳定溶液体系，弱化退火效果的影响。因此随着卵磷脂含量的增加，支架孔径会略微减小。广角 XRD 和 DSC 检测结果显示，卵磷脂的加入并未改变相分离过程中 PLLA 的结晶方式，仍然为 α’型晶体。但是在相分离过程中卵磷脂可能被包裹于 PLLA 链段中，从而起到塑化剂的作用，使 PLLA 链段的流动性增加，因此降低了支架中 PLLA 的结晶度[15]。
对于高分子多孔支架而言，亲水性是一项非常重要的影响因素。亲水性对细胞在支架上的分布以及氧气和营养物质在支架内部的输送都有很大影响[26-27]。本研究中，吸水率测试结果显示，单纯 PLLA 支架的吸水率很低，这是因为 PLLA 具有很强的疏水性，会导致其在组织工程中应用时细胞和血液很难进入到支架内部，限制了修复效果。而随着卵磷脂含量的增加，支架的吸水量和吸水速度得到了大幅增强。卵磷脂的加入显著改善了支架的亲水性。
体外 CCK-8 细胞毒性实验进一步验证了卵磷脂的加入改善了支架的细胞相容性，更有利于细胞黏附。但是当卵磷脂含量超过 30% 时，细胞在支架上的增长速率反而出现了下降趋势。同时在体外成骨分化实验中，加入卵磷脂后，支架上细胞的 ALP 活性和增长速率均大于对照组。而随着卵磷脂含量的增加，PLLA/卵磷脂多孔支架之间的 ALP 活性也出现了显著性差异，说明增加支架中卵磷脂的含量更有利于细胞成骨分化。在本研究的 SD 大鼠颅骨缺损修复实验中，Micro-CT 检测结果与体外细胞实验结果一致，30% 卵磷脂含量制备的 PLLA/卵磷脂多孔支架的新生骨体积和骨矿物密度与其他组比较差异均有统计学意义，说明适当的卵磷脂含量能有效促进缺损处新骨的生成，但是过量的卵磷脂则会抑制缺损处的组织修复。Xu 等[11]制备了 PLLA/卵磷脂膜并进行了细胞毒性研究，发现卵磷脂容易被氧化形成过氧化氢液体，从而对细胞产生毒性。因此，支架制备过程中卵磷脂用量太多反而不利于细胞生长和组织修复。
综上述，本研究结果显示，支架中加入卵磷脂首先可以大幅提升了 PLLA 支架的亲水性，同时使 PLLA 支架孔径减小，支架表面出现少量片状结晶；其次，还可以降低支架中 PLLA 的结晶度；最后，适宜含量的卵磷脂还能促进细胞在 PLLA 支架上的增殖，提升支架的成骨分化性能和骨修复性能。
在骨组织工程中，支架作为细胞外基质，为细胞的黏附、生长、增殖和迁移提供适当的环境，同时还需要引导新组织的再生[1-2]。因此，支架除了需有良好的生物相容性、合适的孔径、孔隙率和强度外，还需要有适当的表面性能以便于细胞在支架上黏附、增殖和分化等[3-4]。左旋聚乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］具有良好的生物相容性，已被美国食品与药品监督管理局（FDA）允许用在外科手术缝合线、微胶囊、植入材料中[5]。但是 PLLA 亲水性比较差，分子链段上缺乏与细胞识别因子或其他生物活性分子相键合的官能团，不利于细胞在其表面黏附与生长，同时在生物矿化过程中缺乏成核位点，较难矿化[6-7]。
卵磷脂是由磷脂质和中性脂质构成的天然混合物。其中磷脂质是细胞膜的主要成分[8]，其化学结构中含有亲水的磷酸基极性基团和疏水的脂肪酰基长链，因此具有两亲性质，作为表面活性剂卵磷脂可以有效降低溶液的表面张力[9]。在之前的研究中，已经发现卵磷脂能够作为成核位点促进骨矿物的增长[10-11]。Park 等[12]利用卵磷脂作为表面活性剂，成功制备了表面光滑、一致性好的海藻酸钠/聚氧乙烯复合纳米纤维。除了具有良好的生物相容性外，卵磷脂还可以与 PLLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等聚合物以任意比例混合[13]。在 PLLA/卵磷脂复合材料中，卵磷脂含量的增加可以增加材料的亲水性，同时血管平滑肌细胞在卵磷脂含量 3%～7% 的共混膜材料上黏附和增殖程度有明显提高[14]。Zhu 等[15]最先将卵磷脂与 PLLA 结合制备组织工程膜材料，以提升 PLLA 的亲水性和生物相容性，同时保持 PLLA 的机械性能。Wang 等[16]制备了 PLLA/卵磷脂/纳米羟基磷灰石多孔支架，卵磷脂的加入显著增加了支架的亲水性，细胞在含有卵磷脂的支架上增殖和黏附情况更好。同时卵磷脂含量增加也会导致支架的机械性能降低，但卵磷脂含量为 10% 的支架其机械性能仍然高于松质骨的强度。徐忠华等[8]研究了 PLLA/卵磷脂共混物膜的血液相容性，发现 PLLA 中卵磷脂的含量在 5%～10% 时材料的血液相容性最佳。
本实验制备了具有开放孔和纳米纤维结构的 PLLA/卵磷脂支架，通过广角 X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）等方法研究卵磷脂的加入对 PLLA 相分离过程的影响，通过体外成骨细胞联合培养法观察细胞在支架上的增殖和分化情况，最后使用大鼠颅骨缺损修复模型观察支架在体内的骨修复情况，旨在寻找一种较好的骨组织工程支架，并为其在骨修复的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 24 只，体质量（280±10）g，由广东药科大学实验动物中心提供。
小鼠 BMSCs 购自美国 ATCC 细胞库，细胞编号 CRL-12424。细胞采用完全培养基（含 10%FBS 的 H-DMEM 培养基）于 37℃、5%CO2 环境下培养，每 2 天换液 1 次，待细胞密度达到约 90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，并按 1 ∶ 3 比例传代培养。
PLLA（相对分子质量 1×105，黏度 2.4 dL/g；山东岱罡生物材料有限公司）；卵磷脂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氧六环（分析纯）、醋酸（分析纯）（天津大茂化学试剂厂）；去离子水、Vitamin C（分析纯）、地塞米松（分析纯）［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；甘油磷酸钠（分析纯）（Merck 公司，德国）；培养基、FBS、链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）；PBS（武汉博士德生物工程有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（同仁化学研究所，日本）；ALP 活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；BCA 蛋白定量分析试剂盒［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；RNA 抽提试剂盒（带 DNA 过滤柱；广州美基生物科技有限公司）；反转录试剂盒（带 gDNA Eraser 试剂盒；Takara 公司，日本）；All-in-One qPCR Mix 试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）。JADE 5 软件（MDI 公司，美国）。
Quanta 200 扫描电镜（FEI 公司，荷兰）；Genesis G25EL4 冷冻干燥机（Virtis 公司，美国）；D8 ADVANCE XRD 仪（Bruker 公司，德国）；DIAMOND DSC 仪（PerkinElmer 公司，美国）；Thermo3001 酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；ZKKS-MCT-Sharp-Ⅱ Micro-CT 系统（广州中科恺盛医疗科技有限公司）。
1.2 PLLA/卵磷脂多孔支架制备
将 3%w/t PLLA 和不同比例（0、5%、10%、20%、30%、40%、50%）的卵磷脂溶于二氧六环与去离子水混合溶剂（混合比例为 88 ∶ 12）中，60℃ 下搅拌溶解 2 h 以得到均匀透明的溶液，随后将溶液分装并迅速转移至–80℃ 冰箱中相分离 2 h；之后用去离子水在 4℃ 冰箱内进行溶剂置换，每天换水 3 次，持续 2 d；最后经过真空冷冻干燥得到含不同比例卵磷脂（0、5%、10%、20%、30%、40%、50%）的 PLLA/卵磷脂多孔支架（分别对应为 A、B、C、D、E、F、G 组）。
1.3 观测指标
1.3.1 扫描电镜观察
取不同卵磷脂比例的 PLLA/卵磷脂多孔支架，经溅射镀膜机喷金处理 120 s 后，加速电压 5～15 kV 下采用扫描电镜观察支架表面形貌。
1.3.2 广角 XRD 检测
每组各取 6 个样本，Cu 靶，Kα 线（λ=0.154 2 nm），管电压 40 kV，管电流 40 mA；扫描角度 2θ=5～55°，扫描速率 0.2°/min。将得到的谱图数据使用 JADE 5 软件进行分析，并计算各样品的结晶度。
1.3.3 DSC 检测
参照文献[17-18]方法进行 DSC 检测并计算各样品结晶度。每组各取 6 个样本，氮气环境，温度范围为室温至 250℃，温度变化速率为 10℃/min。通过以下公式计算样品结晶度：χc=ΔHm/ΔHm0。其中 ΔHm 是测得的热焓值，ΔHm0 是 100% 结晶的聚合物的热焓值（PLLA 的 ΔHm0 为 135 J/g）。
1.3.4 吸水能力测试
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 10 mm 的圆柱体，测试前称量并记录干燥支架的质量（记为 md）。于 37℃ 环境下将支架置于 10 mL PBS 溶液中分别浸泡 5、15、30、60、120、180 min 后，再次称量支架质量（记为 ms），称量前用滤纸吸去支架表面残留水分。通过以下公式计算吸水率：（ms–md）/md×100%。
1.3.5 细胞增殖能力检测
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆柱形切片，灭菌后置于 48 孔板中，每孔接种 2×104 个第 5 代小鼠 BMSCs。培养 1、4、7 d 后，使用 CCK-8 法检测细胞在各支架表面的增殖情况。
1.3.6 成骨分化能力实验
每组各取 6 个样本，制成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆柱形切片，灭菌后置于 48 孔板中，在每个支架上接种 3×104个第 5 代小鼠 BMSCs，采用完全培养基培养 1 d 后，改用成骨细胞诱导培养液（含 10%FBS、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L 甘油磷酸钠、0.05 mmol/L Vitamin C 的 H-DMEM 培养基）培养，每 2 天换液 1 次。参照文献[19]方法，于培养 7、14 d 后检测 ALP 活性。
1.3.7 动物体内骨修复实验
取 24 只 SD 大鼠，用水合氯醛（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，于头部正中作长约 1.5 cm 切口显露颅骨，在左右两侧对称钻孔形成双侧直径均为 5 mm 的颅骨缺损。将大鼠分为 4 个大组，每组 6 只。第 1 大组左右侧骨缺损处分别植入卵磷脂含量为 5%（A1 组）和 10%（B1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 2 大组左右侧分别植入卵磷脂含量为 20%（C1 组）和 30%（D1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 3 大组左右侧分别植入卵磷脂含量为 40%（E1 组）和 50%（F1 组）的 PLLA/卵磷脂多孔支架材料；第 4 大组左侧植入钻头取下的颅骨（G1 组），右侧不植入任何材料作为空白对照组（H1 组）。手术完成后缝合骨膜，逐层关闭切口。术后 3 d 每天注射 10 万 U 青霉素。术后 12 周处死动物，取出颅骨，用 PBS 润洗 3 次后，置于 4% 多聚甲醛溶液 4℃ 下浸泡 48 h。然后用 Micro-CT 对缺损处进行三维模型重建，并对缺损处的新生骨体积和骨矿物密度进行定量分析（G1 组为自体骨，未进行定量分析）。
1.4 统计学方法
采用临床医师统计学助手 V4.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 扫描电镜观察
支架内孔径均为 300～500 μm，孔与孔之间具有很好的联通性；支架内部则是孔径为 20～30 μm 的小孔。随着卵磷脂含量增加，PLLA/卵磷脂多孔支架仍然保持开放孔结构，支架孔径略微变小，但仍保持在 300 μm 以上。A 组单纯 PLLA 支架表面是由 100～500 nm 的 PLLA 纳米纤维构成；随着卵磷脂含量增加，PLLA 纳米纤维的排列方式由扇形逐渐变得杂乱无章，同时 PLLA 纤维变粗。当卵磷脂含量为 50%（G 组）时，支架表面出现了少量片状结构。见图 1。
2.2 广角 XRD 检测
A 组单纯 PLLA 支架的 XRD 图谱出现了 2 个特征结晶峰（110）/（200）和（203），分别对应 2θ=16.4° 和 18.8°，是典型的 α’型晶体的结晶峰[20]。随着卵磷脂含量的增加，XRD 谱图中特征峰的位置并未出现明显变化。见图 2。通过 JADE 5 软件计算得出，A、B、C、D、E、F、G 组支架的结晶度分别为 33.02%±1.78%、29.75%±2.92%、29.33%±3.79%、26.90%±2.11%、21.44%±4.62%、20.26%±2.78%、17.37%±1.91%，随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。
2.3 DSC 检测
DSC 测得的 A、B、C、D、E、F、G 组支架的结晶度分别为 45.54%±3.04%、44.83%±3.63%、44.23%±2.02%、43.51%±3.37%、39.98%±1.23%、36.17%±2.05%、35.83%±1.77%，随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。虽然与广角 XRD 测得的结晶度有少量偏差，但总体变化趋势一致。见图 3。
2.4 吸水能力测试
各时间点 A 组单纯 PLLA 支架吸水率均很低；随着卵磷脂含量增加，支架的吸水率呈逐渐增加趋势。见图 4。
2.5 细胞增殖能力检测
随培养时间增加，BMSCs 在各组支架上均有明显增殖。培养 1、4 d 时，各组吸光度（A）值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。培养 7 d 时，随卵磷脂含量增加，BMSCs 在支架上的增殖速率也随之提高，但当卵磷脂含量超过 30% 时，细胞增殖速率出现下降趋势；C、D、E、E 组A 值显著高于 A、B、G 组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、F 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
2.6 成骨分化实验
成骨诱导 7 d，各组支架 ALP 活性比较差异无统计学意义（P>0.05）。14 d 时，随卵磷脂含量增加，各组 ALP 活性出现了显著差异，D、E、F、G 组 ALP 活性显著高于 A、B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；D、E、F、G 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组成骨诱导 7、14 d ALP 活性检测（n=6，
）
Table1.
The ALP activity at 7 and 14 days after osteogenic induc tion in each group (n=6,
)
2.7 动物体内骨修复实验
Micro-CT 检测示，在不加入支架或支架中卵磷脂含量较低（A1、B1、C1、H1 组）的情况下，大鼠颅骨缺损仅在边缘处有少量新骨生成；而当卵磷脂含量为 30%（D1 组）时，颅骨缺损内部有显著新骨生成；之后继续提高卵磷脂含量（E1、F1 组），PLLA/卵磷脂多孔支架的骨修复效果反而降低。见图 6。新生骨体积和骨矿物密度结果也显示出了同样的趋势，D1 组两指标显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
术后 12 周各组新生骨体积和骨矿物密度检测（n=6，
）
Table2.
The bone volume and bone mineral density of each group at 12 weeks after operation (n=6,
)
图1
各组支架扫描电镜观察
左：×250 右：×20 k a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组；f. F 组；g. G 组（箭头示片状结构）
Figure1. SEM observation of scaffolds in each groupLeft: ×250 Right: ×20 k a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F; g. Group G (Arrows indicated the platelet-like structures)
图2
各组支架 XRD 图谱
Figure2.
The XRD patterns of scaffolds in each group
图3
各组支架 DSC 图谱
Figure3.
The DSC thermograms of scaffolds in each group
图4
各组支架吸水率检测
Figure4.
The water uptake ability of scaffolds in each group
图5
CCK-8 法检测各组支架上 BMSCs 增殖情况
Figure5.
The proliferation of BMSCs on each scaffold detected by CCK-8 method
图6
各组材料植入大鼠颅骨缺损处后 12 周 Micro-CT 检测
a. A1 组（左）和 B1 组（右）；b. C1 组（左）和 D1 组（右）；c. E1 组（左）和 F1 组（右）；d. G1 组（左）和 H1 组（右）
Figure6. Micro-CT results of rat skull defect in each group after repairing for 12 weeksa. Group A1 (left) and group B1 (right); b. Group C1 (left) and group D1 (right); c. Group E1 (left) and group F1 (right); d. Group G1 (left) and group H1 (right)
3 讨论
骨组织工程支架必须有足够大的孔径以保证骨修复效果，通常认为 200～400 μm 最适宜[21-22]；支架内部孔与孔之间良好的联通性也是组织顺利修复的必要条件[23]。本研究中通过热致相分离法制得的 PLLA/卵磷脂多孔支架具有合适的孔径和开放的孔结构，有利于营养物质和代谢废物的输送。同时在支架的孔壁上具有纳米纤维结构的 PLLA，既往研究中表明纳米纤维结构有利于细胞在支架表面的黏附、增殖与分化[24-25]。在热致相分离过程中，支架中孔的大小与结构主要受体系退火效果的影响[23]。在退火过程中富有机相与富溶剂相会各自相互融合，以降低两相间的界面自由能。而卵磷脂作为一种两亲性的表面活性剂，能够有效降低界面自由能，从而在相分离过程中稳定溶液体系，弱化退火效果的影响。因此随着卵磷脂含量的增加，支架孔径会略微减小。广角 XRD 和 DSC 检测结果显示，卵磷脂的加入并未改变相分离过程中 PLLA 的结晶方式，仍然为 α’型晶体。但是在相分离过程中卵磷脂可能被包裹于 PLLA 链段中，从而起到塑化剂的作用，使 PLLA 链段的流动性增加，因此降低了支架中 PLLA 的结晶度[15]。
对于高分子多孔支架而言，亲水性是一项非常重要的影响因素。亲水性对细胞在支架上的分布以及氧气和营养物质在支架内部的输送都有很大影响[26-27]。本研究中，吸水率测试结果显示，单纯 PLLA 支架的吸水率很低，这是因为 PLLA 具有很强的疏水性，会导致其在组织工程中应用时细胞和血液很难进入到支架内部，限制了修复效果。而随着卵磷脂含量的增加，支架的吸水量和吸水速度得到了大幅增强。卵磷脂的加入显著改善了支架的亲水性。
体外 CCK-8 细胞毒性实验进一步验证了卵磷脂的加入改善了支架的细胞相容性，更有利于细胞黏附。但是当卵磷脂含量超过 30% 时，细胞在支架上的增长速率反而出现了下降趋势。同时在体外成骨分化实验中，加入卵磷脂后，支架上细胞的 ALP 活性和增长速率均大于对照组。而随着卵磷脂含量的增加，PLLA/卵磷脂多孔支架之间的 ALP 活性也出现了显著性差异，说明增加支架中卵磷脂的含量更有利于细胞成骨分化。在本研究的 SD 大鼠颅骨缺损修复实验中，Micro-CT 检测结果与体外细胞实验结果一致，30% 卵磷脂含量制备的 PLLA/卵磷脂多孔支架的新生骨体积和骨矿物密度与其他组比较差异均有统计学意义，说明适当的卵磷脂含量能有效促进缺损处新骨的生成，但是过量的卵磷脂则会抑制缺损处的组织修复。Xu 等[11]制备了 PLLA/卵磷脂膜并进行了细胞毒性研究，发现卵磷脂容易被氧化形成过氧化氢液体，从而对细胞产生毒性。因此，支架制备过程中卵磷脂用量太多反而不利于细胞生长和组织修复。
综上述，本研究结果显示，支架中加入卵磷脂首先可以大幅提升了 PLLA 支架的亲水性，同时使 PLLA 支架孔径减小，支架表面出现少量片状结晶；其次，还可以降低支架中 PLLA 的结晶度；最后，适宜含量的卵磷脂还能促进细胞在 PLLA 支架上的增殖，提升支架的成骨分化性能和骨修复性能。
