引用本文： 詹健峰, 刘徐妹, 于博. 载 BMP-2 多肽 P24 的巯基化壳聚糖水凝胶诱导异位成骨的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(9): 1144-1149. doi: 10.7507/1002-1892.201806086 复制
近来，越来越多的研究开始探讨运用壳聚糖制备水凝胶来进行骨组织修复的可行性[1]。壳聚糖是天然聚阳离子多糖，具有生物降解性、生物相容性、非抗原性等功能，且来源广泛、价格低廉[2]。通过加入含羟基聚合物对壳聚糖进行接枝反应，可得到温敏壳聚糖凝胶[3-4]，该巯基化壳聚糖（chitosan-4-thio-butylamidine，CS-TBA）水凝胶在室温下能够保持溶液状态，而在 37℃ 时成胶[5]。研究表明，在 BMP 家族中，BMP-2 诱导 BMSCs 分化为成骨细胞的能力最强[6]，它是唯一可诱导异位成骨并促进骨缺损愈合的生长因子[7]。P24 多肽来源于 BMP-2 的“指节簇”，含有 3 个主要功能域，分别为：① BMP-2 成骨核心结构域：BMP-2“指节簇”的关键氨基酸序列，可激活 BMP-2 受体相应成骨信号通路；② 磷酸化丝氨酸位点：具有促进和指导矿化的作用；③ 聚天冬氨酸结构域：具有一定亲骨性并可控制羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成核和矿化。其中“指节簇”氨基酸序列是 BMP-2 的成骨核心结构域，可激活 BMP-2 受体的相应成骨信号传导途径[8]。目前，许多研究报道 P24 具有与 BMP-2 相似的骨诱导活性，并且可以在体内诱导成骨[9]。因此，本研究通过制备载 BMP-2 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝胶并植入大鼠皮下，观察其异位成骨效果，为骨组织工程可注射成骨材料的研发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级雌性 SD 大鼠 18 只，体质量约 200 g，由南方医科大学动物实验中心提供。壳聚糖（粘度 50～800 mPa·s、脱乙酰度 85%）、2-亚氨基硫烷盐酸盐、β-甘油磷酸二钠（β-glycerophosphate disodium，β-GP）、透析袋、苏木精、伊红（Sigma 公司，美国）；P24 多肽（上海紫域生物科技有限公司）；冰醋酸、纳米级 HA、4% 多聚甲醛（广州化学试剂厂）。PHS-25 型酸度计（上海医用恒温设备厂）；H01-1B 恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Coolsafe 55-9 冷冻冻干机（Labogene 公司，丹麦）；Medical AG micro-CT（SCANCO 公司，瑞士）。
1.2 CS-TBA 的制备
称取 800 mg 壳聚糖溶于 396 mL 去离子水中，量取 4 mL 冰醋酸加入至 400 mL，搅拌 5 h 后，加入 80 mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐，用 5 mol/L NaOH 调节 pH 值至 6，搅拌 24 h。将混合溶液注入透析袋中，用 5 mmol/L HCl（5 L 去离子水加 2.25 mL HCl）、含 1%NaCl 的 5 mmol/L HCl 透析 2 次，5 mmol/L HCl 透析 1 次，1 mmol/L HCl（5 L 去离子水加 0.45 mL HCl）透析 1 次，每次透析 12 h。冷冻干燥后获得 CS-TBA。由于巯基在空气中不稳定，易被氧化，CS-TBA 均于实验前制备[10]。
1.3 载 BMP 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝胶制备
① 称取 200 mg CS-TBA 置于 9 mL 去离子水中，搅拌至完全溶解，静置待气泡消除后，加入 200 mg HA 粉末，继续搅拌，超声至分散均匀，制备 CS-TBA/HA 混合液。
② 称取 40 mg P24 多肽溶于 800 μL 去离子水中，震荡至完全溶解，制成浓度为 50 mg/mL 的多肽溶液。于 CS-TBA/HA 混合液中分别加入 200、400 μL 多肽溶液（含多肽 10、20 mg），搅拌至均匀，使获得的混合液中 CS-TBA 与多肽比例分别为 20∶1 和 10∶1，制备 CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA 混合液。
③ 将 560 mg β-GP 溶于 1 mL 去离子水中，振荡至完全溶解，再用注射器将其逐滴加入步骤①、② 中制备的 3 种混合液，注意边搅拌边加入[10]，37℃ 水浴 10 min，获得 CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶。
1.4 动物模型制备及分组
将 18 只 SD 大鼠随机分成 A、B、C 3 组，每组 6 只。各组大鼠按照 50 mg/kg 剂量腹腔注射 3% 戊巴比妥钠麻醉后，背部剃毛、消毒并铺巾。于背部正中作切口，切开浅筋膜，钝性分离两侧竖脊肌，制造竖脊肌肌袋。于各组大鼠竖脊肌肌袋内分别植入 CS-TBA/HA/β-GP 水凝胶（A 组）、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP 水凝胶（B 组）、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶（C 组）。切口拉拢缝合，肌肉注射 40 万 U 青霉素预防感染。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
术后每日观察各组大鼠存活以及活动、进食、精神状态、切口是否发生感染等情况。
1.5.2 micro-CT 检查
术后 4、8 周各组取 3 只大鼠断颈处死，按照原切口入路，取出植入材料，分离材料周围肌肉及软组织，采用 Medical AG micro-CT 进行 CT 扫描及三维重建，扫描参数为 10 μm、120 kV、150 mA，成像时间 0.5 s。观察各组新生骨形成情况，并采用 Philips Brilliance Workspace 软件测量骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.5.3 组织学观察
micro-CT 检查后，将标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定，脱钙 1 个月后脱水、透明并包埋于石蜡块中，行组织块切片（片厚 8 μm）。常规行 HE 及 Masson 染色，光镜下观察标本局部炎性反应及成骨情况。
1.6 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 检验；组内比较采用 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后各组大鼠均存活至取材时间点，期间活动、进食及精神状态均正常。切口均愈合良好，未出现红肿、渗出等感染情况。
2.2 micro-CT 检查
术后 4 周，A 组异位成骨效应较弱，未见明显新生骨及骨小梁形成；B、C 组相较 A 组有较多新生骨形成。术后 8 周，A 组仅可见边缘少许新生骨形成；B、C 组在植入材料和周围组织的结合部位可见部分骨小梁及新生骨形成，且 C 组新生骨形成及中心成骨较 B 组明显。见图 1。
术后各组 Tb.Th、Tb.N、BMD 逐渐增加，除 A 组 Tb.Th 外，其余各指标组内 4 周与 8 周间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。各时间点，B、C 组 Tb.Th、Tb.N、BMD 明显高于 A 组，C 组高于 B 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
各组 Tb.Th、Tb.N 及 BMD 比较（n=3，
）
Table1.
Comparison of Tb.Th, Tb.N, and BMD between groups (n=3,
)
2.3 组织学观察
2.3.1 HE 染色
术后 4 周，A 组水凝胶材料未见明显分解，周围少量成骨样细胞黏附；B、C 组可见水凝胶材料逐渐分解，内部大量成骨样细胞黏附，且 C 组细胞多于 B 组。术后 8 周，A 组成骨样细胞较 4 周增多，未见明显矿化组织；B、C 组可见大量矿化组织长入，逐渐填满水凝胶材料，且 C 组成骨效果较 B 组更明显。见图 2。
2.3.2 Masson 染色
术后 4 周，A 组未见纤维连接；B、C 组纤维连接逐渐形成，且 C 组多于 B 组，纤维形成边缘逐渐有新骨生成，但是中央区域仅有纤维组织填充连接，可见大量蓝色细胞核，无明显骨组织。术后 8 周，A 组纤维连接逐渐形成，纤维形成边缘有少量新骨形成；B、C 组纤维间隙和材料内部均有新骨长入，C 组更显著，骨形成进一步增强，新骨进一步长入；B、C 组水凝胶材料开始出现分解，逐渐分成多个小部分，各部分出现新生骨小岛的形成。见图 3。
3 讨论
本研究旨在通过异位成骨实验来验证 CS-TBA 水凝胶的成骨诱导效应。水凝胶材料，包括天然生物材料（淀粉、藻酸盐、几丁质/壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝绸等）及合成衍生生物材料（聚羟基酯、聚碳酸酯、聚磷腈等），已经被广泛研究并应用于骨组织工程[11-16]。对比众多的水凝胶材料，CS-TBA 水凝胶具有以下优点：① 自身具有灭菌性，能够减少手术污染的风险；② 原材料便宜，能够大规模合成；③ 可注射性能，常温条件下为液态，在体内温度、体内 pH 值条件下可短时间成胶[17]；④ 水溶性特性能够搭载多种生物因子及复合材料，应用范围广泛[18]。
同时，本研究使用的 P24 多肽用于骨组织工程也比 BMP-2 更具有优势，主要体现在以下方面：① 序列简单，便于大规模合成，成本较低；② 线性结构，活性基团易于暴露，生物反应性好；③ 保留了 BMP-2 活性部分，成骨效果有保证[19]；④ 含有二硫键，易于修饰，形成稳定的共价结合[20]。
结合 CS-TBA 水凝胶及 P24 多肽的优点，我们成功制备了载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶。本课题组前期研究发现 CS-TBA 具有液态-凝胶态的生物性能，巯基化接枝 P24 多肽后能够缓释达 24 d，扫描电镜下观察包含的 HA 能够均匀分布于水凝胶内[21]。因此，为了探究载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶材料作为骨修复材料的可行性，我们进行了大鼠皮下异位成骨实验。本次研究中，micro-CT 三维重建图像显示 B、C 组成骨作用明显高于 A 组，8 周成骨均比 4 周时明显。此外，根据 micro-CT 数据分析，B、C 组 BMD 和 Tb.Th、Tb.N 均高于 A 组，表明载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶具有明显的骨修复作用，并且随着 P24 浓度的升高，C 组表现出更好的成骨效果。HE 染色及 Masson 染色结果显示载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶材料具有良好的生物降解性，术后随着 P24 浓度的提高，C 组矿化组织及新生骨的形成较 B 组增多，提示材料具有良好的骨诱导及成骨作用。
综上述，载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶是一种具有应用前景的骨组织工程可注射材料。
图1
术后 3 组 CT 三维重建观察
从左至右为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure1. Three-dimensional CT reconstruction images of 3 groups at each time point after operationFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
图2
术后 3 组 HE 染色观察（×200）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure2. HE staining observation of 3 groups at each time point after operation (×200)From left to right for groups A, B, and C, respectivelya. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
图3
术后 3 组 Masson 染色观察（×400）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure3. Masson staining observation of 3 groups at each time point after operation (×400)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
近来，越来越多的研究开始探讨运用壳聚糖制备水凝胶来进行骨组织修复的可行性[1]。壳聚糖是天然聚阳离子多糖，具有生物降解性、生物相容性、非抗原性等功能，且来源广泛、价格低廉[2]。通过加入含羟基聚合物对壳聚糖进行接枝反应，可得到温敏壳聚糖凝胶[3-4]，该巯基化壳聚糖（chitosan-4-thio-butylamidine，CS-TBA）水凝胶在室温下能够保持溶液状态，而在 37℃ 时成胶[5]。研究表明，在 BMP 家族中，BMP-2 诱导 BMSCs 分化为成骨细胞的能力最强[6]，它是唯一可诱导异位成骨并促进骨缺损愈合的生长因子[7]。P24 多肽来源于 BMP-2 的“指节簇”，含有 3 个主要功能域，分别为：① BMP-2 成骨核心结构域：BMP-2“指节簇”的关键氨基酸序列，可激活 BMP-2 受体相应成骨信号通路；② 磷酸化丝氨酸位点：具有促进和指导矿化的作用；③ 聚天冬氨酸结构域：具有一定亲骨性并可控制羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成核和矿化。其中“指节簇”氨基酸序列是 BMP-2 的成骨核心结构域，可激活 BMP-2 受体的相应成骨信号传导途径[8]。目前，许多研究报道 P24 具有与 BMP-2 相似的骨诱导活性，并且可以在体内诱导成骨[9]。因此，本研究通过制备载 BMP-2 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝胶并植入大鼠皮下，观察其异位成骨效果，为骨组织工程可注射成骨材料的研发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级雌性 SD 大鼠 18 只，体质量约 200 g，由南方医科大学动物实验中心提供。壳聚糖（粘度 50～800 mPa·s、脱乙酰度 85%）、2-亚氨基硫烷盐酸盐、β-甘油磷酸二钠（β-glycerophosphate disodium，β-GP）、透析袋、苏木精、伊红（Sigma 公司，美国）；P24 多肽（上海紫域生物科技有限公司）；冰醋酸、纳米级 HA、4% 多聚甲醛（广州化学试剂厂）。PHS-25 型酸度计（上海医用恒温设备厂）；H01-1B 恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Coolsafe 55-9 冷冻冻干机（Labogene 公司，丹麦）；Medical AG micro-CT（SCANCO 公司，瑞士）。
1.2 CS-TBA 的制备
称取 800 mg 壳聚糖溶于 396 mL 去离子水中，量取 4 mL 冰醋酸加入至 400 mL，搅拌 5 h 后，加入 80 mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐，用 5 mol/L NaOH 调节 pH 值至 6，搅拌 24 h。将混合溶液注入透析袋中，用 5 mmol/L HCl（5 L 去离子水加 2.25 mL HCl）、含 1%NaCl 的 5 mmol/L HCl 透析 2 次，5 mmol/L HCl 透析 1 次，1 mmol/L HCl（5 L 去离子水加 0.45 mL HCl）透析 1 次，每次透析 12 h。冷冻干燥后获得 CS-TBA。由于巯基在空气中不稳定，易被氧化，CS-TBA 均于实验前制备[10]。
1.3 载 BMP 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝胶制备
① 称取 200 mg CS-TBA 置于 9 mL 去离子水中，搅拌至完全溶解，静置待气泡消除后，加入 200 mg HA 粉末，继续搅拌，超声至分散均匀，制备 CS-TBA/HA 混合液。
② 称取 40 mg P24 多肽溶于 800 μL 去离子水中，震荡至完全溶解，制成浓度为 50 mg/mL 的多肽溶液。于 CS-TBA/HA 混合液中分别加入 200、400 μL 多肽溶液（含多肽 10、20 mg），搅拌至均匀，使获得的混合液中 CS-TBA 与多肽比例分别为 20∶1 和 10∶1，制备 CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA 混合液。
③ 将 560 mg β-GP 溶于 1 mL 去离子水中，振荡至完全溶解，再用注射器将其逐滴加入步骤①、② 中制备的 3 种混合液，注意边搅拌边加入[10]，37℃ 水浴 10 min，获得 CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶。
1.4 动物模型制备及分组
将 18 只 SD 大鼠随机分成 A、B、C 3 组，每组 6 只。各组大鼠按照 50 mg/kg 剂量腹腔注射 3% 戊巴比妥钠麻醉后，背部剃毛、消毒并铺巾。于背部正中作切口，切开浅筋膜，钝性分离两侧竖脊肌，制造竖脊肌肌袋。于各组大鼠竖脊肌肌袋内分别植入 CS-TBA/HA/β-GP 水凝胶（A 组）、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP 水凝胶（B 组）、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶（C 组）。切口拉拢缝合，肌肉注射 40 万 U 青霉素预防感染。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
术后每日观察各组大鼠存活以及活动、进食、精神状态、切口是否发生感染等情况。
1.5.2 micro-CT 检查
术后 4、8 周各组取 3 只大鼠断颈处死，按照原切口入路，取出植入材料，分离材料周围肌肉及软组织，采用 Medical AG micro-CT 进行 CT 扫描及三维重建，扫描参数为 10 μm、120 kV、150 mA，成像时间 0.5 s。观察各组新生骨形成情况，并采用 Philips Brilliance Workspace 软件测量骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.5.3 组织学观察
micro-CT 检查后，将标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定，脱钙 1 个月后脱水、透明并包埋于石蜡块中，行组织块切片（片厚 8 μm）。常规行 HE 及 Masson 染色，光镜下观察标本局部炎性反应及成骨情况。
1.6 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 检验；组内比较采用 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后各组大鼠均存活至取材时间点，期间活动、进食及精神状态均正常。切口均愈合良好，未出现红肿、渗出等感染情况。
2.2 micro-CT 检查
术后 4 周，A 组异位成骨效应较弱，未见明显新生骨及骨小梁形成；B、C 组相较 A 组有较多新生骨形成。术后 8 周，A 组仅可见边缘少许新生骨形成；B、C 组在植入材料和周围组织的结合部位可见部分骨小梁及新生骨形成，且 C 组新生骨形成及中心成骨较 B 组明显。见图 1。
术后各组 Tb.Th、Tb.N、BMD 逐渐增加，除 A 组 Tb.Th 外，其余各指标组内 4 周与 8 周间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。各时间点，B、C 组 Tb.Th、Tb.N、BMD 明显高于 A 组，C 组高于 B 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
各组 Tb.Th、Tb.N 及 BMD 比较（n=3，
）
Table1.
Comparison of Tb.Th, Tb.N, and BMD between groups (n=3,
)
2.3 组织学观察
2.3.1 HE 染色
术后 4 周，A 组水凝胶材料未见明显分解，周围少量成骨样细胞黏附；B、C 组可见水凝胶材料逐渐分解，内部大量成骨样细胞黏附，且 C 组细胞多于 B 组。术后 8 周，A 组成骨样细胞较 4 周增多，未见明显矿化组织；B、C 组可见大量矿化组织长入，逐渐填满水凝胶材料，且 C 组成骨效果较 B 组更明显。见图 2。
2.3.2 Masson 染色
术后 4 周，A 组未见纤维连接；B、C 组纤维连接逐渐形成，且 C 组多于 B 组，纤维形成边缘逐渐有新骨生成，但是中央区域仅有纤维组织填充连接，可见大量蓝色细胞核，无明显骨组织。术后 8 周，A 组纤维连接逐渐形成，纤维形成边缘有少量新骨形成；B、C 组纤维间隙和材料内部均有新骨长入，C 组更显著，骨形成进一步增强，新骨进一步长入；B、C 组水凝胶材料开始出现分解，逐渐分成多个小部分，各部分出现新生骨小岛的形成。见图 3。
3 讨论
本研究旨在通过异位成骨实验来验证 CS-TBA 水凝胶的成骨诱导效应。水凝胶材料，包括天然生物材料（淀粉、藻酸盐、几丁质/壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝绸等）及合成衍生生物材料（聚羟基酯、聚碳酸酯、聚磷腈等），已经被广泛研究并应用于骨组织工程[11-16]。对比众多的水凝胶材料，CS-TBA 水凝胶具有以下优点：① 自身具有灭菌性，能够减少手术污染的风险；② 原材料便宜，能够大规模合成；③ 可注射性能，常温条件下为液态，在体内温度、体内 pH 值条件下可短时间成胶[17]；④ 水溶性特性能够搭载多种生物因子及复合材料，应用范围广泛[18]。
同时，本研究使用的 P24 多肽用于骨组织工程也比 BMP-2 更具有优势，主要体现在以下方面：① 序列简单，便于大规模合成，成本较低；② 线性结构，活性基团易于暴露，生物反应性好；③ 保留了 BMP-2 活性部分，成骨效果有保证[19]；④ 含有二硫键，易于修饰，形成稳定的共价结合[20]。
结合 CS-TBA 水凝胶及 P24 多肽的优点，我们成功制备了载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶。本课题组前期研究发现 CS-TBA 具有液态-凝胶态的生物性能，巯基化接枝 P24 多肽后能够缓释达 24 d，扫描电镜下观察包含的 HA 能够均匀分布于水凝胶内[21]。因此，为了探究载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶材料作为骨修复材料的可行性，我们进行了大鼠皮下异位成骨实验。本次研究中，micro-CT 三维重建图像显示 B、C 组成骨作用明显高于 A 组，8 周成骨均比 4 周时明显。此外，根据 micro-CT 数据分析，B、C 组 BMD 和 Tb.Th、Tb.N 均高于 A 组，表明载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶具有明显的骨修复作用，并且随着 P24 浓度的升高，C 组表现出更好的成骨效果。HE 染色及 Masson 染色结果显示载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶材料具有良好的生物降解性，术后随着 P24 浓度的提高，C 组矿化组织及新生骨的形成较 B 组增多，提示材料具有良好的骨诱导及成骨作用。
综上述，载 P24 多肽 CS-TBA 水凝胶是一种具有应用前景的骨组织工程可注射材料。
图1
术后 3 组 CT 三维重建观察
从左至右为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure1. Three-dimensional CT reconstruction images of 3 groups at each time point after operationFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
图2
术后 3 组 HE 染色观察（×200）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure2. HE staining observation of 3 groups at each time point after operation (×200)From left to right for groups A, B, and C, respectivelya. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
图3
术后 3 组 Masson 染色观察（×400）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure3. Masson staining observation of 3 groups at each time point after operation (×400)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
