引用本文： 李奇薇, 李超婧, 王富军, 胡思寒, 王璐. 多尺度纤维支架的结构调控与性能. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(4): 479-485. doi: 10.7507/1002-1892.201808128 复制
设计和制造一种有利于引导细胞生长和组织再生的支架，是组织工程的关键内容之一。纤维型支架由于在几何学、形态形貌学方面具有与天然细胞外基质类似的结构[1-2]，在组织工程领域得到广泛研究。其中，静电纺技术是一种常用制备方法，它可以调整直径、密度、取向等方面，以使支架获得优异的机械物理性能[3-4]。
在各种生物材料中，人工合成的可降解聚合物，如聚己内酯［poly（ε-caprolactone），PCL］等，具有可调控的力学性能和降解速率，在组织工程领域具有广泛应用[5]。然而，静电纺制备的聚合物纤维支架通常呈现疏水性且表面光滑，支架表面缺少细胞的结合位点，限制了细胞在支架上的黏附与生长[6]。有文献表明，表面微纳米尺度的拓扑结构可以起到调控细胞行为的作用[6-9]。因此，在静电纺聚合物纤维支架中引入不同纳米尺度表面形貌，可以模拟天然细胞组织的粗糙度，使其适当地促进细胞生长和增殖[10-12]。因而本研究选用 PCL 作为基材，通过与聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）共同静电纺制备表面多孔纤维支架；另外采用溶液诱导结晶方式，在 PCL 纤维表面形成不同尺度的串晶结构（shish-kebab，SK）。对这两种多尺度纤维支架的形貌和结构性能进行表征，比较不同尺度、不同纤维表面形态对细胞增殖行为以及对血液相容性的影响，旨在为更好地模拟天然细胞外基质结构以制备更具应用前景的组织工程支架奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
普通级雄性新西兰大白兔，体质量约 2.5 kg，由上海金山动物实验中心提供；实验动物生产许可证批准号：SCXK（沪）2015 0005。
PCL（Sigma 公司，美国）；PVP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯甲烷、甲醇、冰醋酸、氯化钙（上海凌峰化学试剂有限公司）；RPMI 培养基（GIBCO 公司，美国）；猪髂动脉内皮细胞（pig iliac artery endothelial cell，PIEC；中国科学院细胞库）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翊圣生物科技有限公司）。S-4800 场发射扫描电镜（HITACHI 公司，日本）；DSC4000 差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC；PerkinElmer 公司，美国）；OCA15EC 接触角测角仪（Dataphysics 公司，德国）；酶标仪（Thermo 公司，美国）。
1.2 多尺度纤维支架的制备与表征
1.2.1 PCL 表面多孔纤维支架的制备
将质量比分别为 8∶2 和 5∶5 的 PCL 及 PVP 溶于三氯甲烷和甲醇的混合溶剂（体积比为 3∶1）中，制备质量体积比为 12% 的纺丝液进行静电纺。环境温度 25℃，湿度 30%；纺丝参数：推注速度 1 mL/h，纺丝电压 15 kV，针头至接收装置的距离为 20 cm。将获得的 PCL/PVP 纤维支架放入 1 000 mL 去离子水中，24 h 后取出并用去离子水反复冲洗后放入真空干燥箱中干燥。将制得的 PCL 表面多孔纤维支架根据聚合物质量比分别标记为 PCL-P8、PCL-P5。
1.2.2 PCL-SK 纤维支架的制备
根据文献［13］中的方法进行 SK 纤维支架的制备，主要采用溶液诱导结晶方法获得 SK 结构。① 首先进行 PCL 静电纺纤维支架的制备：配置质量体积比为 15% 的 PCL/三氯甲烷/甲醇纺丝液，纺丝电压选择 12 kV，其余纺丝参数参考 1.2.1 进行静电纺。② PCL-SK 纤维支架的制备：首先在 60℃ 条件下将 PCL 溶解在体积比为 75% 的醋酸溶液中，制备质量体积比为 1% 的 PCL/醋酸/水混合溶液，冷却至室温后，将 PCL 静电纺纤维支架浸没于混合溶液中，分别于诱导结晶 1、5、30、60 min 后取出，并用体积比为 75% 醋酸溶液冲洗 3 次以去除残余 PCL，结束后将支架置于真空干燥箱中干燥 24 h。将制得的 PCL-SK 纤维支架根据诱导结晶时间分别标记为 PCL-SK1、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60。
1.3 多尺度纤维支架的表征
1.3.1 性能表征
① 扫描电镜表征：使用场发射扫描电镜观察制备的两种多尺度纤维支架的表面形态。根据图 1 所示示意图计算片晶尺寸和周期距离。② 接触角测试：通过接触角测角仪检测 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的接触角，评价支架的表面亲水性。③ DSC 检测：使用 DSC 检测 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的热学性能，如熔点（Tm）、熔融焓（ΔHm），绘制其熔融曲线，并根据以下公式计算结晶度 Xc：Xc=ΔHm/ΔHm0，其中 ΔHm 为 DSC 热谱图测得的熔融焓，ΔHm0 为完全结晶 PCL 的熔融焓（具体为 139.5 J/g）。速度为 10℃/min，温度为 0～80℃。
图1
SK 结构示意图
Figure1.
Schematic of shish-kebab structure
1.3.2 血液相容性
采用溶血和凝血实验表征 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的血液相容性。① 溶血实验：收集新西兰大白兔静脉血，于离心半径 10 cm、5 000 r/min 离心 5 min 并重复 5 次，取下层沉淀加入 34 mL PBS 液混合均匀后，得到兔红细胞（rabbit red blood cell，RRBC）。将所有支架裁剪成 100 mm×100 mm 大小，加入 4 mL PBS 和 1 mL RRBC 中，于 37℃ 恒温摇床中培养 2 h，以单纯 1 mL RRBC+4 mL PBS 作为阴性对照，以 1 mL RRBC+4 mL 去离子水为阳性对照。培养结束后同上法离心后取上清液，使用酶标仪检测 540 nm 波长下的吸光度（A）值，按以下公式计算溶血率：（实验组 A 值－阴性对照组 A 值）/（阳性对照组 A 值－阴性对照组 A 值）×100%。根据美国材料与试验协会（ASTM）F756-08 标准评价，溶血率<2% 即认为是非溶血材料。每组 3 个样品，取均值。
② 凝血实验：将裁剪后的支架依次加入 25 μL 兔静脉全血和 20 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液中，于 37℃ 恒温摇床中培养；分别于培养 5、10、30、60 min 后取出试样，加入 2 mL 去离子水后继续培养 5 min。并直接以 25 μL 全血加 2 mL 去离子水作为对照组。培养结束后，取上清液，用酶标仪测量 540 nm 波长下的 A 值，按以下公式计算凝血指数（blood clotting index，BCI）：实验组 A 值/对照组 A 值×100%。BCI 越大代表材料凝血性能越差。每组 3 个样品，取均值。
1.3.3 生物相容性
采用 CCK-8 法检测 PIEC 在多尺度纤维支架上的增殖情况，评价支架的生物相容性。取 PIEC 采用完全培养基（含 10%FBS、1% 双抗、1% 丙酮酸钠的 RPMI 培养基）培养，以 2×104 个/mL 密度接种于灭菌的裁剪成直径为 14 mm 的圆形支架上，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，每隔 2 d 换液 1 次。培养 1、7 d 时取出支架，加入含 10%CCK-8 工作液的培养基培养 3 h，用酶标仪于波长 450 nm 下检测 A 值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 多尺度纤维支架的性能表征
2.1.1 扫描电镜表征
扫描电镜观察显示成功制备出了表面多孔纤维支架和 SK 纤维支架，所有支架平均直径保持在 700 nm 左右，保证了纤维直径一致性。在 PCL-P8 和 PCL-P5 纤维表面出现了多孔形貌，随着 PVP 含量的增加，PCL-P5 较 PCL-P8 的孔洞形状更为细长，且粗糙度进一步增加。在 PCL-SK1 纤维表面仅出现少量点状晶体，并且无明显周期性，因而未能形成完整的 SK 结构，后续将不再进行测试；当结晶时间在 5 min 及以上时，形成了较为完整的片晶结构，且周期性地排布于纤维表面。见图 2。进一步计算片晶尺寸与周期距离发现，随着结晶时间的增加，片晶不断生长，片晶尺寸与周期距离均逐渐增加，形成了类似胶原纤维的粗糙表面。见表 1。
表1
PCL-SK 纤维支架的片晶尺寸与周期距离（n=50，nm，
）
Table1.
Kebab size and periodic distance of PCL-SK fibrous scaffolds (n=50, nm, 
)
图2
场发射扫描电镜观察多尺度纤维支架形貌
a. PCL-P8（×15 k）；b. PCL-P5（×15 k）；c. PCL-SK1（×10 k）；d. PCL-SK5（×10 k）；e. PCL-SK30（×10 k）；f. PCL-SK60（×10 k）
Figure2. Field emission scanning electron microscope observation of fiber surfaces of hierarchically structured fibrous scaffoldsa. PCL-P8 (×15 k); b. PCL-P5 (×15 k); c. PCL-SK1 (×10 k); d. PCL-SK5 (×10 k); e. PCL-SK30 (×10 k); f. PCL-SK60 (×10 k)
2.1.2 接触角测试
所有支架表面接触角均在 130° 以上，呈现较高的疏水性。进一步分析发现，各 PCL-SK 纤维支架接触角均显著高于 PCL 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05），且随片晶尺寸增加而增加；而 PCL-P5、PCL-P8 表面多孔纤维支架的接触角与 PCL 纤维支架的接触角比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
多尺度纤维结构支架的接触角测试
Figure3.
Water contact angles of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.1.3 DSC 检测
通过多尺度纤维结构支架的 DSC 熔融曲线分析发现，各 PCL-SK 纤维支架的 Tm 均高于 PCL 表面多孔纤维支架和 PCL 纤维支架，PCL 表面多孔纤维支架 Tm 高于 PCL 纤维支架，差异均有统计学意义（P<0.05）。各 PCL-SK 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架的 Xc 均显著高于 PCL 纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05）。其中 PCL-P5 的的 Tm 和 Xc 小于 PCL-P8，差异有统计学意义（P<0.05）。随着片晶尺寸的增加，PCL-SK 纤维支架的 Tm 和 Xc 均进一步增大，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2，图 4。
表2
多尺度纤维结构支架 DSC 检测结果（n=3，
）
Table2.
DSC tests of hierarchically structured fibrous scaffolds (n=3, 
)
图4
多尺度纤维结构支架的 DSC 熔融曲线
Figure4.
DSC curve of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.2 多尺度纤维支架的血液相容性
2.2.1 溶血实验
PCL、PCL-P5、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60 的溶血率分别为 0.06%±0.00%、0.95%±0.13%、0.98%±0.02%、1.04%±0.07%、0.64%±0.03%。SK 结构和表面多孔纤维支架的溶血率均高于 PCL 纤维支架。根据 ASTM F756-08 标准评价，所有支架溶血率均<2%，均为非溶血材料，因此制备的多尺度纤维结构支架可适用于血液接触型材料。
2.2.2 凝血实验
各支架的 BCI 随时间增加逐渐减小，在 30 min 后基本维持不变；培养 5、10 min 时，SK 结构和表面多孔支架的 BCI 均高于 PCL 纤维支架，PCL-SK5 和 PCL-SK30 的 BCI 显著高于其他支架，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
多尺度纤维结构支架的 BCI 比较
Figure5.
Comparison of the BCI of hierarchically structured fib rous scaffolds
2.3 多尺度纤维结构支架的生物相容性
CCK-8 法检测示，培养 1 d 时 PCL 表面多孔纤维支架的 A 值显著高于 PCL 纤维支架和各 PCL-SK 纤维支架，而各 PCL-SK 纤维支架显著低于 PCL 纤维支架，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。但 7 d 时除 PCL-SK60 外，其余 PCL-SK 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架 A 值均显著高于 PCL 纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05）。SK 结构纤维支架中，随结晶时间增加，A 值有下降趋势，各支架间比较差异有统计学意义（P<0.05）；而表面多孔纤维支架中，PCL-P5 的 A 值高于 PCL-P8，差异有统计学意义（P<0.05）。 见表 3。
表3
CCK-8 法检测各支架培养 1、7 d 时细胞增殖 A 值（n=3，
）
Table3.
The A value of proliferation of PIEC on scaffolds after culturing for 1 day and 7 days determined by CCK-8 method (n=3, 
)
3 讨论
静电纺纤维支架具有高比表面积、高纵横比和高微孔性，从而具有增强细胞黏附、生长和分化的潜能[2, 14-15]，通过引入不同表面结构使得支架更具有模拟细胞外基质中胶原的粗糙纤维结构[16]。因此，构建不同形貌的多尺度纤维支架不仅可以调控支架的表面物理化学性能，同时还将对细胞行为产生重要影响。
本研究利用共混物相分离的原理制备 PCL/PVP 双组分纤维从而制备出 PCL 表面多孔纤维，以及采取 75% 醋酸溶液作为 PCL 的不良溶剂，使用溶液诱导结晶方式制备了不同尺度片晶的 SK 纤维。支架的物理性能测试结果表明，与表面光滑的 PCL 纤维支架相比，PCL-SK 和 PCL 表面多孔结构纤维支架的疏水性和结晶性能均有不同程度增加。PCL-SK 纤维支架由于在表面引入了二级纳米结构使得表面粗糙度增加，能够束缚更多空气分子，因而使得接触角比单纯 PCL 纤维支架显著增大；而 PCL 表面多孔纤维支架虽然粗糙度也有所增大，但其接触角与 PCL 纤维支架无显著性差异，这可能是由于增加的粗糙度不足以改变支架表面的疏水性。但已有文献证明，通过非溶剂相分离原理制备的多孔左旋聚乳酸纤维由于粗糙度的增加，确实提高了纤维表面的疏水性[17]。此外，DSC 测试结果显示 SK 结构的熔融峰形状发生了变化，不仅变宽而且出现了双峰现象，而熔融峰的形状与材料的结晶度和晶型有关，较高的结晶度、更有序的晶型通常具有高而尖锐的熔融峰，因此我们推测 PCL-SK 纤维支架的双峰现象可能是不同完整度的结晶区造成的结果。PCL 纤维在静电纺过程中受到电场的牵伸力，形成高度延伸的 PCL 大分子链，这些高度延伸的大分子链便形成了完善程度更高的结晶，因而具有比 PCL 纤维表面附生的 PCL 片晶更高的 Tm；而随着片晶尺寸的增大，片晶的完整性进一步增强，从而使得支架的 Tm 提高，Xc 也随之增加，其他文献[12]也得出了类似结果。而表面多孔纤维支架中 PCL-P5 的 Xc 小于 PCL-P8，这主要是由于共混体系中，PVP 相处于 PCL 相的非结晶区，当 PVP 去除后 Xc 相对有所增加；但随着 PVP 含量的进一步增加，无定形的 PVP 大分子在 PCL 相中起到了空间位阻的作用，而影响 PCL 大分子链的紧密堆积，使得 PCL 晶体成型和生长减少，从而 Xc 有所下降。
支架的物理性能如粗糙度和疏水性的改变，会对支架的细胞和血液相容性产生影响。有研究表明，红细胞的细胞膜由外部的糖萼以及磷脂双分子层构成，糖萼不仅富含碳水化合物，还为表面提供负电荷，脂质双分子层上含有许多跨膜蛋白且多呈现疏水性，因此静电作用、亲疏水性以及和膜蛋白的相互作用是影响聚合物和红细胞相互作用的因素[18]。多尺度纤维结构支架的疏水性增加，聚合物可能接触到细胞膜而破坏了脂质双分子层的完整性，导致血红蛋白的释放及发生溶血，因此本研究得出其溶血率较 PCL 纤维支架增加。此外，短时间内支架和血液接触时，更高的疏水性使得支架不能完全接触血液，从而会使得凝血指数偏高。而表面粗糙度的增加，可以吸附更多蛋白质从而黏附更多细胞，进一步促进了细胞增殖[19-21]。Zamani 等[22]研究表明，表面具有多孔结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］纤维支架相比于表面光滑的 PLGA 支架，更能提高神经细胞的生长速率。本研究通过在支架上 PIEC 的培养发现，多尺度纤维支架相比于表面光滑的 PCL 纤维支架更有利于细胞的增殖，且细胞对不同表面、不同尺度具有不同的响应。第 1 天时由于细胞培养时间短且存在实验误差，PCL-SK 纤维支架的 A 值较低，且不同片晶尺寸支架间无明显规律性；而表面多孔支架的 A 值显著高于 PCL-SK 纤维支架和 PCL 纤维支架，说明短时间内表面多孔纤维支架有利于细胞生长；随着时间增加，PCL-SK 纤维支架尤其是片晶尺寸为 100 nm 的 PCL-SK5 支架的 A 值高于其他支架。因此，PCL-SK5 支架相比于 PCL 表面多孔纤维支架更有利于 PIEC 的增殖。因而这两种不同表面的多尺度纤维结构支架在组织工程领域具有良好的应用潜能。
设计和制造一种有利于引导细胞生长和组织再生的支架，是组织工程的关键内容之一。纤维型支架由于在几何学、形态形貌学方面具有与天然细胞外基质类似的结构[1-2]，在组织工程领域得到广泛研究。其中，静电纺技术是一种常用制备方法，它可以调整直径、密度、取向等方面，以使支架获得优异的机械物理性能[3-4]。
在各种生物材料中，人工合成的可降解聚合物，如聚己内酯［poly（ε-caprolactone），PCL］等，具有可调控的力学性能和降解速率，在组织工程领域具有广泛应用[5]。然而，静电纺制备的聚合物纤维支架通常呈现疏水性且表面光滑，支架表面缺少细胞的结合位点，限制了细胞在支架上的黏附与生长[6]。有文献表明，表面微纳米尺度的拓扑结构可以起到调控细胞行为的作用[6-9]。因此，在静电纺聚合物纤维支架中引入不同纳米尺度表面形貌，可以模拟天然细胞组织的粗糙度，使其适当地促进细胞生长和增殖[10-12]。因而本研究选用 PCL 作为基材，通过与聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）共同静电纺制备表面多孔纤维支架；另外采用溶液诱导结晶方式，在 PCL 纤维表面形成不同尺度的串晶结构（shish-kebab，SK）。对这两种多尺度纤维支架的形貌和结构性能进行表征，比较不同尺度、不同纤维表面形态对细胞增殖行为以及对血液相容性的影响，旨在为更好地模拟天然细胞外基质结构以制备更具应用前景的组织工程支架奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
普通级雄性新西兰大白兔，体质量约 2.5 kg，由上海金山动物实验中心提供；实验动物生产许可证批准号：SCXK（沪）2015 0005。
PCL（Sigma 公司，美国）；PVP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯甲烷、甲醇、冰醋酸、氯化钙（上海凌峰化学试剂有限公司）；RPMI 培养基（GIBCO 公司，美国）；猪髂动脉内皮细胞（pig iliac artery endothelial cell，PIEC；中国科学院细胞库）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翊圣生物科技有限公司）。S-4800 场发射扫描电镜（HITACHI 公司，日本）；DSC4000 差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC；PerkinElmer 公司，美国）；OCA15EC 接触角测角仪（Dataphysics 公司，德国）；酶标仪（Thermo 公司，美国）。
1.2 多尺度纤维支架的制备与表征
1.2.1 PCL 表面多孔纤维支架的制备
将质量比分别为 8∶2 和 5∶5 的 PCL 及 PVP 溶于三氯甲烷和甲醇的混合溶剂（体积比为 3∶1）中，制备质量体积比为 12% 的纺丝液进行静电纺。环境温度 25℃，湿度 30%；纺丝参数：推注速度 1 mL/h，纺丝电压 15 kV，针头至接收装置的距离为 20 cm。将获得的 PCL/PVP 纤维支架放入 1 000 mL 去离子水中，24 h 后取出并用去离子水反复冲洗后放入真空干燥箱中干燥。将制得的 PCL 表面多孔纤维支架根据聚合物质量比分别标记为 PCL-P8、PCL-P5。
1.2.2 PCL-SK 纤维支架的制备
根据文献［13］中的方法进行 SK 纤维支架的制备，主要采用溶液诱导结晶方法获得 SK 结构。① 首先进行 PCL 静电纺纤维支架的制备：配置质量体积比为 15% 的 PCL/三氯甲烷/甲醇纺丝液，纺丝电压选择 12 kV，其余纺丝参数参考 1.2.1 进行静电纺。② PCL-SK 纤维支架的制备：首先在 60℃ 条件下将 PCL 溶解在体积比为 75% 的醋酸溶液中，制备质量体积比为 1% 的 PCL/醋酸/水混合溶液，冷却至室温后，将 PCL 静电纺纤维支架浸没于混合溶液中，分别于诱导结晶 1、5、30、60 min 后取出，并用体积比为 75% 醋酸溶液冲洗 3 次以去除残余 PCL，结束后将支架置于真空干燥箱中干燥 24 h。将制得的 PCL-SK 纤维支架根据诱导结晶时间分别标记为 PCL-SK1、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60。
1.3 多尺度纤维支架的表征
1.3.1 性能表征
① 扫描电镜表征：使用场发射扫描电镜观察制备的两种多尺度纤维支架的表面形态。根据图 1 所示示意图计算片晶尺寸和周期距离。② 接触角测试：通过接触角测角仪检测 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的接触角，评价支架的表面亲水性。③ DSC 检测：使用 DSC 检测 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的热学性能，如熔点（Tm）、熔融焓（ΔHm），绘制其熔融曲线，并根据以下公式计算结晶度 Xc：Xc=ΔHm/ΔHm0，其中 ΔHm 为 DSC 热谱图测得的熔融焓，ΔHm0 为完全结晶 PCL 的熔融焓（具体为 139.5 J/g）。速度为 10℃/min，温度为 0～80℃。
图1
SK 结构示意图
Figure1.
Schematic of shish-kebab structure
1.3.2 血液相容性
采用溶血和凝血实验表征 PCL 纤维支架（对照组）及两种多尺度纤维支架的血液相容性。① 溶血实验：收集新西兰大白兔静脉血，于离心半径 10 cm、5 000 r/min 离心 5 min 并重复 5 次，取下层沉淀加入 34 mL PBS 液混合均匀后，得到兔红细胞（rabbit red blood cell，RRBC）。将所有支架裁剪成 100 mm×100 mm 大小，加入 4 mL PBS 和 1 mL RRBC 中，于 37℃ 恒温摇床中培养 2 h，以单纯 1 mL RRBC+4 mL PBS 作为阴性对照，以 1 mL RRBC+4 mL 去离子水为阳性对照。培养结束后同上法离心后取上清液，使用酶标仪检测 540 nm 波长下的吸光度（A）值，按以下公式计算溶血率：（实验组 A 值－阴性对照组 A 值）/（阳性对照组 A 值－阴性对照组 A 值）×100%。根据美国材料与试验协会（ASTM）F756-08 标准评价，溶血率<2% 即认为是非溶血材料。每组 3 个样品，取均值。
② 凝血实验：将裁剪后的支架依次加入 25 μL 兔静脉全血和 20 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液中，于 37℃ 恒温摇床中培养；分别于培养 5、10、30、60 min 后取出试样，加入 2 mL 去离子水后继续培养 5 min。并直接以 25 μL 全血加 2 mL 去离子水作为对照组。培养结束后，取上清液，用酶标仪测量 540 nm 波长下的 A 值，按以下公式计算凝血指数（blood clotting index，BCI）：实验组 A 值/对照组 A 值×100%。BCI 越大代表材料凝血性能越差。每组 3 个样品，取均值。
1.3.3 生物相容性
采用 CCK-8 法检测 PIEC 在多尺度纤维支架上的增殖情况，评价支架的生物相容性。取 PIEC 采用完全培养基（含 10%FBS、1% 双抗、1% 丙酮酸钠的 RPMI 培养基）培养，以 2×104 个/mL 密度接种于灭菌的裁剪成直径为 14 mm 的圆形支架上，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，每隔 2 d 换液 1 次。培养 1、7 d 时取出支架，加入含 10%CCK-8 工作液的培养基培养 3 h，用酶标仪于波长 450 nm 下检测 A 值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 多尺度纤维支架的性能表征
2.1.1 扫描电镜表征
扫描电镜观察显示成功制备出了表面多孔纤维支架和 SK 纤维支架，所有支架平均直径保持在 700 nm 左右，保证了纤维直径一致性。在 PCL-P8 和 PCL-P5 纤维表面出现了多孔形貌，随着 PVP 含量的增加，PCL-P5 较 PCL-P8 的孔洞形状更为细长，且粗糙度进一步增加。在 PCL-SK1 纤维表面仅出现少量点状晶体，并且无明显周期性，因而未能形成完整的 SK 结构，后续将不再进行测试；当结晶时间在 5 min 及以上时，形成了较为完整的片晶结构，且周期性地排布于纤维表面。见图 2。进一步计算片晶尺寸与周期距离发现，随着结晶时间的增加，片晶不断生长，片晶尺寸与周期距离均逐渐增加，形成了类似胶原纤维的粗糙表面。见表 1。
表1
PCL-SK 纤维支架的片晶尺寸与周期距离（n=50，nm，）
Table1.
Kebab size and periodic distance of PCL-SK fibrous scaffolds (n=50, nm, )
图2
场发射扫描电镜观察多尺度纤维支架形貌
a. PCL-P8（×15 k）；b. PCL-P5（×15 k）；c. PCL-SK1（×10 k）；d. PCL-SK5（×10 k）；e. PCL-SK30（×10 k）；f. PCL-SK60（×10 k）
Figure2. Field emission scanning electron microscope observation of fiber surfaces of hierarchically structured fibrous scaffoldsa. PCL-P8 (×15 k); b. PCL-P5 (×15 k); c. PCL-SK1 (×10 k); d. PCL-SK5 (×10 k); e. PCL-SK30 (×10 k); f. PCL-SK60 (×10 k)
2.1.2 接触角测试
所有支架表面接触角均在 130° 以上，呈现较高的疏水性。进一步分析发现，各 PCL-SK 纤维支架接触角均显著高于 PCL 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05），且随片晶尺寸增加而增加；而 PCL-P5、PCL-P8 表面多孔纤维支架的接触角与 PCL 纤维支架的接触角比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
多尺度纤维结构支架的接触角测试
Figure3.
Water contact angles of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.1.3 DSC 检测
通过多尺度纤维结构支架的 DSC 熔融曲线分析发现，各 PCL-SK 纤维支架的 Tm 均高于 PCL 表面多孔纤维支架和 PCL 纤维支架，PCL 表面多孔纤维支架 Tm 高于 PCL 纤维支架，差异均有统计学意义（P<0.05）。各 PCL-SK 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架的 Xc 均显著高于 PCL 纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05）。其中 PCL-P5 的的 Tm 和 Xc 小于 PCL-P8，差异有统计学意义（P<0.05）。随着片晶尺寸的增加，PCL-SK 纤维支架的 Tm 和 Xc 均进一步增大，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2，图 4。
表2
多尺度纤维结构支架 DSC 检测结果（n=3，）
Table2.
DSC tests of hierarchically structured fibrous scaffolds (n=3, )
图4
多尺度纤维结构支架的 DSC 熔融曲线
Figure4.
DSC curve of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.2 多尺度纤维支架的血液相容性
2.2.1 溶血实验
PCL、PCL-P5、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60 的溶血率分别为 0.06%±0.00%、0.95%±0.13%、0.98%±0.02%、1.04%±0.07%、0.64%±0.03%。SK 结构和表面多孔纤维支架的溶血率均高于 PCL 纤维支架。根据 ASTM F756-08 标准评价，所有支架溶血率均<2%，均为非溶血材料，因此制备的多尺度纤维结构支架可适用于血液接触型材料。
2.2.2 凝血实验
各支架的 BCI 随时间增加逐渐减小，在 30 min 后基本维持不变；培养 5、10 min 时，SK 结构和表面多孔支架的 BCI 均高于 PCL 纤维支架，PCL-SK5 和 PCL-SK30 的 BCI 显著高于其他支架，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
多尺度纤维结构支架的 BCI 比较
Figure5.
Comparison of the BCI of hierarchically structured fib rous scaffolds
2.3 多尺度纤维结构支架的生物相容性
CCK-8 法检测示，培养 1 d 时 PCL 表面多孔纤维支架的 A 值显著高于 PCL 纤维支架和各 PCL-SK 纤维支架，而各 PCL-SK 纤维支架显著低于 PCL 纤维支架，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。但 7 d 时除 PCL-SK60 外，其余 PCL-SK 纤维支架和 PCL 表面多孔纤维支架 A 值均显著高于 PCL 纤维支架，差异有统计学意义（P<0.05）。SK 结构纤维支架中，随结晶时间增加，A 值有下降趋势，各支架间比较差异有统计学意义（P<0.05）；而表面多孔纤维支架中，PCL-P5 的 A 值高于 PCL-P8，差异有统计学意义（P<0.05）。 见表 3。
表3
CCK-8 法检测各支架培养 1、7 d 时细胞增殖 A 值（n=3，）
Table3.
The A value of proliferation of PIEC on scaffolds after culturing for 1 day and 7 days determined by CCK-8 method (n=3, )
3 讨论
静电纺纤维支架具有高比表面积、高纵横比和高微孔性，从而具有增强细胞黏附、生长和分化的潜能[2, 14-15]，通过引入不同表面结构使得支架更具有模拟细胞外基质中胶原的粗糙纤维结构[16]。因此，构建不同形貌的多尺度纤维支架不仅可以调控支架的表面物理化学性能，同时还将对细胞行为产生重要影响。
本研究利用共混物相分离的原理制备 PCL/PVP 双组分纤维从而制备出 PCL 表面多孔纤维，以及采取 75% 醋酸溶液作为 PCL 的不良溶剂，使用溶液诱导结晶方式制备了不同尺度片晶的 SK 纤维。支架的物理性能测试结果表明，与表面光滑的 PCL 纤维支架相比，PCL-SK 和 PCL 表面多孔结构纤维支架的疏水性和结晶性能均有不同程度增加。PCL-SK 纤维支架由于在表面引入了二级纳米结构使得表面粗糙度增加，能够束缚更多空气分子，因而使得接触角比单纯 PCL 纤维支架显著增大；而 PCL 表面多孔纤维支架虽然粗糙度也有所增大，但其接触角与 PCL 纤维支架无显著性差异，这可能是由于增加的粗糙度不足以改变支架表面的疏水性。但已有文献证明，通过非溶剂相分离原理制备的多孔左旋聚乳酸纤维由于粗糙度的增加，确实提高了纤维表面的疏水性[17]。此外，DSC 测试结果显示 SK 结构的熔融峰形状发生了变化，不仅变宽而且出现了双峰现象，而熔融峰的形状与材料的结晶度和晶型有关，较高的结晶度、更有序的晶型通常具有高而尖锐的熔融峰，因此我们推测 PCL-SK 纤维支架的双峰现象可能是不同完整度的结晶区造成的结果。PCL 纤维在静电纺过程中受到电场的牵伸力，形成高度延伸的 PCL 大分子链，这些高度延伸的大分子链便形成了完善程度更高的结晶，因而具有比 PCL 纤维表面附生的 PCL 片晶更高的 Tm；而随着片晶尺寸的增大，片晶的完整性进一步增强，从而使得支架的 Tm 提高，Xc 也随之增加，其他文献[12]也得出了类似结果。而表面多孔纤维支架中 PCL-P5 的 Xc 小于 PCL-P8，这主要是由于共混体系中，PVP 相处于 PCL 相的非结晶区，当 PVP 去除后 Xc 相对有所增加；但随着 PVP 含量的进一步增加，无定形的 PVP 大分子在 PCL 相中起到了空间位阻的作用，而影响 PCL 大分子链的紧密堆积，使得 PCL 晶体成型和生长减少，从而 Xc 有所下降。
支架的物理性能如粗糙度和疏水性的改变，会对支架的细胞和血液相容性产生影响。有研究表明，红细胞的细胞膜由外部的糖萼以及磷脂双分子层构成，糖萼不仅富含碳水化合物，还为表面提供负电荷，脂质双分子层上含有许多跨膜蛋白且多呈现疏水性，因此静电作用、亲疏水性以及和膜蛋白的相互作用是影响聚合物和红细胞相互作用的因素[18]。多尺度纤维结构支架的疏水性增加，聚合物可能接触到细胞膜而破坏了脂质双分子层的完整性，导致血红蛋白的释放及发生溶血，因此本研究得出其溶血率较 PCL 纤维支架增加。此外，短时间内支架和血液接触时，更高的疏水性使得支架不能完全接触血液，从而会使得凝血指数偏高。而表面粗糙度的增加，可以吸附更多蛋白质从而黏附更多细胞，进一步促进了细胞增殖[19-21]。Zamani 等[22]研究表明，表面具有多孔结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］纤维支架相比于表面光滑的 PLGA 支架，更能提高神经细胞的生长速率。本研究通过在支架上 PIEC 的培养发现，多尺度纤维支架相比于表面光滑的 PCL 纤维支架更有利于细胞的增殖，且细胞对不同表面、不同尺度具有不同的响应。第 1 天时由于细胞培养时间短且存在实验误差，PCL-SK 纤维支架的 A 值较低，且不同片晶尺寸支架间无明显规律性；而表面多孔支架的 A 值显著高于 PCL-SK 纤维支架和 PCL 纤维支架，说明短时间内表面多孔纤维支架有利于细胞生长；随着时间增加，PCL-SK 纤维支架尤其是片晶尺寸为 100 nm 的 PCL-SK5 支架的 A 值高于其他支架。因此，PCL-SK5 支架相比于 PCL 表面多孔纤维支架更有利于 PIEC 的增殖。因而这两种不同表面的多尺度纤维结构支架在组织工程领域具有良好的应用潜能。
