引用本文： 张庆宇, 高福强, 程立明, 刘立华, 孙伟, 李子荣. 淫羊藿苷对骨微血管内皮细胞自噬及外泌体产生的影响. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(5): 568-577. doi: 10.7507/1002-1892.201811009 复制
骨微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）构成附着在骨小梁上的单层结构，与血液中的成分直接接触，为骨组织和细胞提供氧气和营养，还具有内分泌功能，这对维持骨内正常微环境具有重要意义[1-2]。而糖皮质激素是一类临床常用的抗炎药和免疫抑制剂，也是引起非创伤性股骨头坏死和继发性骨质疏松症最重要的危险因素[3-4]。我们前期实验表明，淫羊藿苷对高浓度激素导致的股骨头 BMECs 损伤有明显保护作用，而 0.1 mg/mL 浓度以下的激素并不会引起明显的内皮细胞凋亡[5-7]。自噬是目前生命科学研究的热点，指细胞通过降解内部损伤的蛋白质和细胞器等来维持稳态，实现细胞的代谢和更新，然而自噬达到一定水平，又会启动凋亡造成损伤[8]。目前淫羊藿苷对 BMECs 自噬的影响尚未见报道。外泌体则是一种直径 30～100 nm，在细胞间通讯中起重要作用的细胞外囊泡[9-10]。这些作用是通过以自分泌或旁分泌的形式在不同细胞间转运 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA）、蛋白质及其他活性物质实现的[9-10]。Jiang 等[11]报道缺氧能够刺激脐静脉内皮细胞产生外泌体，而后者又能够抑制缺氧造成的神经细胞凋亡，激活自噬过程。本实验中，我们拟观察淫羊藿苷对低浓度激素诱导的股骨头 BMECs 自噬以及外泌体产生的影响，以及后两者之间的相互作用，进一步探索激素相关骨病的发生机制及治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验标本及主要试剂、仪器
股骨头由因股骨颈骨折、原发性髋关节骨关节炎或先天性髋关节发育不良继发骨关节炎，而于中日友好医院接受全髋关节置换术的患者自愿捐献。
DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；MACS 运行缓冲液及 CD31 磁珠（Miltenyi 公司，德国）；内皮细胞培养基（ScienCell 公司，美国）；氢化可的松（辉瑞公司，美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；Matrigel 胶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、淫羊藿苷（Sigma 公司，美国）；CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、微管相关蛋白轻链 3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、死骨片 1（SQSTM1/p62）、β-肌动蛋白（β-actin）一抗及对应二抗（Abcam 公司，美国）；CD9、CD81、VEGFA、TGF-β1 一抗及对应二抗（Santa Cruz 公司，美国）；5×蛋白上样缓冲液、RIPA 裂解液、ECL 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，美国）；外泌体分离试剂盒（和光纯药工业株式会社，日本）。CO2 孵箱（Thermo 公司，美国）；倒置相差显微镜、荧光显微镜及照相系统（Nikon 公司，日本）；透射电镜（Joel 公司，日本）；Nanosight NS300 纳米粒子跟踪分析系统（Malvern 公司，英国）；低温高速离心机（Beckman 公司，美国）。
1.2 股骨头 BMECs 分离培养及相关观测
1.2.1 股骨头 BMECs 分离培养
无菌条件下将股骨头剖开，去掉筋膜、凝血块和其他杂质，将正常松质骨切成细小骨粒，放入 15 mL 离心管，用 DMEM 培养基洗涤 3 次。加入 5 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃ 水浴消化 25 min；再加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 min；最后加入 2 mL 含 10%FBS的 DMEM 培养基终止消化。将上清液通过 100 目细胞筛过滤，并以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min。将含有微血管段和细胞的沉淀物用 80 μL MACS 磁珠缓冲液和 20 μL CD31 磁珠重悬。4℃ 下温育 15 min，将细胞悬浮液与 400 μL MACS 运行缓冲液混合，通过固定在磁场中的 MACS 分选柱，500 µL 运行缓冲液冲洗 3 次。随后移去 MACS 分选柱，用 1 mL PBS 缓冲液将 C31 磁珠结合的细胞冲洗到 Eppendorf 管中，再次以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min。将离心细胞重悬于 5 mL 内皮细胞培养基并接种到培养瓶中，于 37℃、5%CO2、95% 湿度细胞培养箱中培养。24 h 后 PBS 洗涤，除去未附着的细胞。当细胞扩增至培养瓶底部 80% 以上时，进行细胞传代，取第 3 代细胞用于后续实验。
1.2.2 BMECs 形态观察
细胞贴壁后，每日于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。待细胞长满培养瓶底面积 80% 时，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 min，吹打后收集细胞悬液，以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min，4℃、3% 戊二醛固定，1% 锇酸固定，梯度乙醇-丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀染色 30 min，醋酸铅染色 15 min，透射电镜下观察。
1.2.3 免疫荧光染色检测细胞纯度
将分离培养 7 d 的细胞接种至防脱片载玻片上，生长 12 h 后用 PBS 洗涤 3 次，4% 多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 穿透；用 10%FBS 封闭后，将细胞与 CD31（1∶300）和 vWF（1∶300）一抗孵育过夜；然后 PBS 洗涤，并将细胞与标记有 FITC 或 Alexa 488 的二抗以及 DAPI 在室温下孵育 1 h。封片，于荧光显微镜下观察细胞形态，并随机选取 10 个视野，统计免疫荧光染色阳性细胞数量占同一视野下所有细胞数量的比例，计算细胞纯度。
1.3 糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
将 BMECs 以 5.0×105个/孔密度接种至 6 孔板，分为 8 组，每组设 3 个平行孔。A、B、C、D 组每孔分别加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氢化可的松的 DMEM 培养基；A1、B1、C1、D1 组分别加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氢化可的松的 DMEM 培养基后，再每孔给予 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷干预。培养 24 h 后 4℃ PBS 洗涤，收集细胞，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min，然后以离心半径 55 cm、12 000 r/min 离心 5 min，分离蛋白质，采用 Western blot 法检测各组 LC3B 和 p62 蛋白表达水平。具体操作：将蛋白样品与 5×蛋白凝胶电泳上样缓冲液混合，95℃ 变性 10 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳使染料至分离胶适当位置，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脱脂牛奶封闭 1 h；与特异性一抗 LC3B（1∶2 000）、p62（1∶2 000）和 β-actin（1∶3 000）孵育过夜后，与辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶5 000）孵育 50 min；使用 ECL 试剂盒处理印迹，暗室中曝光、显影并定影；条带灰度值采用 Quantity One v.4.6.2 软件分析。以 β-actin 蛋白作为内参，蛋白相对表达量以目标蛋白与 β-actin 蛋白灰度值的比值表示。其中 LC3B 包括 LC3B -Ⅰ和 LC3B-Ⅱ，自噬过程中，非激活型 LC3B-Ⅰ经过水解和脂质化后会转变为激活的自噬小体膜结合 LC3B-Ⅱ[12]，因此以 LC3B-Ⅱ的蛋白相对表达量来表示 LC3B 的蛋白相对表达量。
1.4 外泌体分离及相关观测
1.4.1 外泌体分离及其直径、浓度检测
将 BMECs 以 5.0×105个/mL 密度接种至 25 cm2培养瓶（5 mL 培养基），分别在含和不含 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷的无外泌体培养基（内皮细胞培养基中的 FBS 预先经 0.22 μm 滤膜过滤，以 100 000×g 离心 18 h，从而去除其中的外泌体）中培养 24 h（分别设为干预组和未干预组），收集上清液，应用外泌体分离试剂盒提取外泌体；将外泌体重悬于 PBS 中，通过纳米颗粒跟踪分析技术分析其直径分布和浓度。
1.4.2 BCA 法检测外泌体总蛋白质含量
将 BSA 作为标准品，按一系列浓度（25、125、250、500、750、1 000、1 500、2 000 μg/ mL）稀释，依次加入 10 μL 96 孔板中；取两组外泌体，加入蛋白上样缓冲液，煮沸，4℃ 下以离心半径 55 cm、12 000 r/min 离心 5 min，分离蛋白，将 10 μL 蛋白质样品加入 96 孔板。每孔加入 200 μL BCA 工作溶液，并在黑暗环境中于 37℃ 孵育 30 min。于 750 nm 波长下测量吸光度（A）值，按照 BSA 浓度绘制标准曲线，并根据标准曲线读取外泌体总蛋白质浓度。
1.4.3 Western blot 检测外泌体携带蛋白表达
取两组外泌体，按照 1.4.2 方法分离蛋白，按 1.3 方法检测 CD9、CD81、TGF-β1 和 VEGFA 蛋白相对表达量。
1.5 外泌体对 BMECs 自噬及功能的影响
1.5.1 Western blot 检测自噬相关蛋白表达
将 BMECs 以 5.0×105个/孔密度接种至 6 孔板，分为 3 组：实验组分离经 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），与 BMECs 共培养；对照组分离未经淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），与 BMECs 共培养；空白对照组为单纯 BMECs。培养 24 h 后，3 组均加入 0.06 mg/mL 氢化可的松处理 24 h 后，按 1.3 方法检测细胞中 LC3BⅡ和 p62 蛋白相对表达量。每组设 3 个平行孔。
1.5.2 划痕实验检测细胞迁移能力
用记号笔在 6 孔板背后均匀划横线，横穿过孔；取处于对数生长期、生长状态良好的第 3 代 BMCEs，以 1×106个/孔密度接种至上述 6 孔板，37℃、5%CO2 培养箱中培养过夜；待细胞铺满 6 孔板底部，用 10 μL 枪头垂至于背后的横线划痕。PBS 洗细胞 3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，实验组加入经 5×10−5 mol/L 淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），对照组加入未经淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），空白对照组不加入外泌体；培养 24 h 后以 0.06 mg/ mL 氢化可的松处理，分别于氢化可的松处理 0、12、 24 h 时进行拍照，按以下公式计算划痕闭合率：（a—b）/a×100%，其中 a 为整张照片宽度，b 为无细胞的空白部位宽度。
1.5.3 血管生成能力检测
向预冷的 24 孔板中按照 150 μL/孔浓度加入 Matrigel 胶，置于 37℃、5%CO2 培养箱中放置 30 min 使其凝固成胶，备用。取 BMECs 按 1.5.1 分组方法分别培养 24 h 后，胰蛋白酶消化，用无血清 DMEM 重悬细胞，以 2.5×105个/孔密度接种于涂有 Matrigel 胶的 24 孔板中；加入 0.06 mg/mL 氢化可的松，于 37℃、5%CO2、95% 湿度细胞培养箱内培养 4、8 h 后倒置相差显微镜 100 倍镜下拍照，随机取 3 个视野，计数管腔数、出芽数和小管分支长度。
1.6 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BMECs 形态观察和纯度检测
培养 2～3 d 可观察到贴壁细胞均匀分布于培养瓶中；分离细胞培养 7 d 倒置相差显微镜观察示，细胞生长趋于融合，呈纺锤形或多边形，镜下呈“铺路石”样（图 1a）。透射电镜观察示，分离细胞培养 14 d 时呈多边形，表面被细胞质凸起形成的微绒毛覆盖，细胞核较大，具有明显核仁；细胞质富含线粒体、粗面内质网、高尔基复合体和其他细胞器（图 1b）。免疫荧光染色示 vWF 和 CD31 阳性率接近 100%（图 1c、d）。
图1
BMECs 形态观察和纯度检测
a. 培养 7 d 倒置相差显微镜观察（×40）；b. 培养 14 d 透射电镜观察（×12 k）；c. 免疫荧光染色观察示 CD31 高表达（荧光显微镜×100）；d. 免疫荧光染色示 vWF 高表达（荧光显微镜×100）
Figure1. Morphology observation and purity identification of BMECsa. Inverted phase contrast microscope observation after 7 days of culture (×40); b. Transmission electron microscope observation after 14 days of culture (×12 k); c. Immunofluorescence staining showed high expression of CD31 (Fluorescence microscope×100); d. Immunofluorescence staining showed high expression of vWF (Fluorescence microscope×100)
2.2 糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
随着氢化可的松浓度升高，各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量逐渐增加，p62 蛋白相对表达量逐渐减少，A、B、C、D 组间及 A1、B1、C1、D1 组间差异均有统计学意义（P<0.01）。与相同浓度激素组相比，给予淫羊藿苷干预后，LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量减少，p62 蛋白表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 2。
图2
Western blot 检测糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：A1 组 6：B1 组 7：C1 组 8：D1 组；b. 各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量比较；c. 各组 p62 蛋白相对表达量比较
Figure2. Effect of glucocorticoid and icariin on autophagy-related proteins in BMECs detected by Western blot analysisa. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group A1 6: Group B1 7: Group C1 8: Group D1; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.3 外泌体相关观测
2.3.1 外泌体直径和浓度检测
未干预组和干预组外泌体直径分别为（86.68±1.97）、（85.35±1.65）nm，差异无统计学意义（t=0.896，P=0.421）；浓度分别为（9.85±0.47）×106个/mL 和（1.54±0.08）×107个/mL，干预组显著高于未干预组，差异有统计学意义（t=−10.191，P=0.001）。
2.3.2 外泌体总蛋白质含量检测
未干预组和干预组外泌体总蛋白质含量分别为（132.63±3.33）μg/mL 和（138.56±9.58）μg/mL，比较差异无统计学意义（t=−1.102，P=0.369）。
2.3.3 Western blot 法检测外泌体携带蛋白表达
未干预组和干预组细胞中提取的外泌体中 CD9 和 CD81 均高度表达，干预组的 VEGFA/CD9 和 TGF-β1/CD9 蛋白相对表达量比值均显著高于未干预组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 3。
图3
Western blot 法检测外泌体携带蛋白表达
a. 电泳图 1：未干预组 2：干预组；b. 两组 VEGFA/CD9 蛋白相对表达量比较；c. 两组 TGF-β1/CD9 蛋白相对表达量比较
Figure3. Expression of exosome-carried proteins detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Non-intervention group 2: Intervention group; b. Comparison of protein expression ratio of VEGFA/CD9 in two groups; c. Comparison of protein expression ratio of TGF-β1/CD9 in two groups
2.4 外泌体对 BMECs 自噬及功能的影响
2.4.1 Western blot 检测自噬相关蛋白表达
在空白对照组、对照组和实验组中，p62 蛋白相对表达量呈递增趋势，LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量呈递减趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测外泌体对 BMECs 自噬相关蛋白表达的影响
a. 电泳图 1：空白对照组 2：对照组 3：实验组；b. 各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量比较；c. 各组 p62 蛋白相对表达量比较
Figure4. Effect of exosomes on the expression level of autophagy-related protein of BMECs detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.4.2 划痕实验检测细胞迁移能力
氢化可的松处理 0 h 时，镜下各组均显示清晰划痕，各组划痕闭合率比较差异无统计学意义（P>0.05）；12、24 h 时，对照组和实验组细胞迁移能力明显高于空白对照组，实验组明显高于对照组，各组划痕闭合率比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、表 1。
图5
划痕实验检测外泌体对内皮细胞迁移的影响（倒置相差显微镜×100）
从左至右依次为氢化可的松处理 0、12、24 h 时 a. 空白对照组；b. 对照组；c. 实验组
Figure5. Scratch test to detect the effect of exosomes on endothelial cell migration (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for hydrocortisone treatment lasted 0, 12, and 24 hours, respectively a. Blank control group; b. Control group; c. Experimental group
表1
氢化可的松处理后各时间点各组细胞划痕闭合率比较（n=3，%，
）
Table1.
Comparison of scratch closure rates of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, %, 
)
2.4.3 血管生成能力检测
倒置相差显微镜观察可见各组在氢化可的松处理 4 h 后即有内皮细胞形成管状结构，见图 6。氢化可的松处理 4、8 h 时，实验组和对照组管腔数、出芽数和小管分支长度均显著大于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组小管分支长度和管腔数显著大于对照组（P<0.05），但出芽数与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
氢化可的松处理后各时间点各组细胞血管生成能力比较（n=3，
）
Table2.
Comparison of angiogenic ability of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, 
)
图6
氢化可的松处理 4、8 h 各组细胞血管生成能力观察（倒置相差显微镜×100）
从左至右依次为空白对照组、对照组和实验组a. 4 h；b. 8 h
Figure6. Observation of angiogenic ability of cells in each group treated with hydrocortisone for 4 and 8 hours (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for blank control group, control group, and experimental group, respectively a. At 4 hours; b. At 8 hours
3 讨论
通过靶向激活人体组织中的相应受体（NR3C1、GR），糖皮质激素在机体的抗炎和其他生理功能调节中发挥了重要作用[13]。一系列研究表明，大剂量糖皮质激素对血管内皮细胞和心血管会产生有害作用，导致暂时性高血压、血脂异常、血栓形成甚至心肌梗死[14-15]。既往研究表明激素能够引起骨细胞的凋亡和自噬，其效果与激素的剂量有关，即高浓度激素引起细胞凋亡，而低浓度激素则引起细胞自噬[16]。
自噬广泛存在于哺乳动物的各种组织内，是一种对细胞增殖、分化以及状态和活力的维持都至关重要的过程[8]，也在股骨头坏死、骨质疏松等疾病的发病过程中起到重要作用[17-19]。自噬过程中，细胞质中会形成一种被称为“自噬体”的杯状结构，自噬体吞噬细胞质成分并与溶酶体融合，进而通过溶酶体水解酶降解吞噬的蛋白和细胞器[8]。血管内皮细胞损伤是激素性股骨头坏死和骨质疏松发生过程中的重要环节，而在发病早期，细胞可以通过自噬降解有害物质和受损细胞器来避免细胞损伤。然而，一旦自噬超过了细胞正常的防御能力，就会发生凋亡[17-19]。我们在前期实验中证明 0.1 mg/mL 浓度以下的激素并不会明显引起细胞凋亡[20]，本实验拟探究低浓度激素能否影响内皮细胞的自噬水平。由于股骨头是糖皮质激素相关性骨坏死最常见的发生部位，因此本实验中，我们分离了股骨头的 BMECs 进行研究。
目前有多种方法来检测细胞的自噬水平，例如 Western blot 法检测 LC3B 的切割、p62 的降解、Beclin 的表达水平，检测组织蛋白酶 Cathepsin 的活力以及透射电镜下观察自噬体形成等[5, 7, 21]。在自噬过程中，非激活型 LC3B -Ⅰ经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合 LC3B-Ⅱ[21]，而 p62 在自噬清除多泛素化蛋白时会优先被降解[22]。本实验中，随着激素浓度的升高，股骨头 BMECs 内 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量逐渐增高，而 p62 蛋白相对表达量则逐渐下降，表明细胞的自噬水平逐步增高，这是一种细胞的自我保护机制。前期有研究表明，用地塞米松处理内皮祖细胞能够增加其自噬水平，但随着暴露时间的延长，这一效果逐渐减低，同时细胞活性也逐渐减弱[12]。该研究表明自噬能够对抗激素引起的细胞毒作用，但这一效果是有限的。
淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，以“强骨补肾”而闻名[23]。淫羊藿苷可以改善 BMSCs 成脂肪分化和成骨分化之间的平衡，促进成骨细胞的增殖和矿化，并降低破骨细胞的活性[24-26]。Hu 等[27]揭示淫羊藿苷可以通过调节 Caspase-3 和 Bcl2 来预防人脐静脉内皮细胞因氧化低密度脂蛋白引起的损伤和凋亡。我们前期实验表明，淫羊藿苷能够阻止高浓度激素引起的股骨头 BMECs 凋亡[28]。但淫羊藿苷对自噬将产生何种影响仍然存在争议。Mi 等[29]研究表明淫羊藿苷能够通过抑制 NF-κB，从而激活软骨细胞自噬，抑制炎性反应和凋亡的发生。Jiang 等[30]则指出淫羊藿苷可以通过激活卵巢癌细胞 mTOR 信号通路，抑制自噬，促进凋亡，从而抑制肿瘤生成。既往的体外实验中，使用的淫羊藿苷剂量多为 5×10-6～5×10-5 mol/L，且具有剂量依赖性和剂量饱和性[31-32]。我们前期研究表明[29]，淫羊藿苷可以显著增强股骨头 BMECs 的活力。本实验结果表明 5×10-5 mol/L 浓度的淫羊藿苷能够抑制低浓度激素引起的 BMECs 自噬过程，且淫羊藿苷处理不会显著改变源自股骨头 BMECs 的外泌体的直径，但可以增加外泌体的数量。
外泌体是一种直径 30～100 nm，携带各种 mRNA、miRNA 和蛋白质的膜封闭的细胞外囊泡。被其他细胞摄取后，这些外泌体可以实现不同细胞间的通讯，影响受体细胞的信号通路，改变其周围的微环境[9-10]。此外，外泌体的供体细胞也可以重新摄取其分泌的外泌体[33]。受到外界刺激后，内皮细胞可释放外泌体到血液或细胞外液中并发挥多种作用：一方面，它们可以促进内皮细胞的存活；另一方面，它可能导致心血管疾病的发生[10]。有研究指出脂肪干细胞来源的外泌体可以可促进脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及管样结构形成[34]。因此，外泌体在未来可能用于治疗一系列相关疾病。
内皮细胞分泌的外泌体对各种细胞应激的反应明显不同。Zhao 等[35]研究表明，缺氧和脂多糖均增加了肺动脉内皮细胞释放的外泌体蛋白总量。de Jong 等[9]发现缺氧和 TNF-α 不会影响内皮细胞分泌的外泌体浓度和大小，但可能会改变外泌体携带的蛋白和 miRNA 组成。本研究中，我们应用外泌体分离提取试剂盒提取股骨头 BMECs 分泌的外泌体。CD9 和 CD81 是两种外泌体表面的标志蛋白[36]；同时，外泌体内参不同于常用的细胞内参（如 β-actin），外泌体中携带蛋白的相对表达量可用 CD9 含量进行归一化处理[36]。纳米粒子示踪分析技术和 Western blot 结果表明，虽然淫羊藿苷并不会明显改变股骨头 BMECs 分泌的外泌体的大小和所携带的蛋白总量，但可以明显增加外泌体的数量以及 VEGFA 和 TGF-β1 的含量，从而可能对受体细胞的生理功能起到调节作用。VEGF 是一个家族，包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC 和 VEGFD 等，其中 VEGFA 是最常用的一种，可促进新生血管生成[37]。既往研究表明，VEGF 可以抑制慢性脑缺血诱导的过度自噬，从而对认知功能起到保护作用[38]；Domigan 等[39]则表明耗竭内皮细胞自分泌的 VEGF 会导致线粒体断裂、葡萄糖代谢抑制、自噬增强，并最终导致细胞死亡。而 TGF-β1 一般被认为与细胞自噬形成正反馈回路[40-41]。
为了进一步阐明内皮细胞来源的外泌体在自噬发生中的作用，我们分离股骨头 BMECs 分泌的外泌体，与 BMECs 共培养，并使用低浓度激素进行干预。结果显示，与空白对照组和对照组相比，实验组的细胞自噬水平明显降低；进一步研究表明外泌体干预还能够促进内皮细胞的迁移和血管生成过程。这些结果均表明外泌体能够对其起到一定的保护作用。然而，关于淫羊藿苷和外泌体是通过何种通路抑制自噬的发生，外泌体又能否被骨微血管内皮摄取，尚需要进一步研究。
综上述，5×10-5 mol/L 淫羊藿苷能显著抑制低浓度激素诱导的股骨头 BMECs 自噬，从而对内皮细胞起到保护作用。淫羊藿苷干预虽然不能改变内皮细胞分泌的外泌体直径，但能增加外泌体中 VEGFA 和 TGF-β1 等蛋白的表达水平。由淫羊藿苷处理的股骨头 BMECs 产生的外泌体可以通过自分泌途径改善低浓度糖皮质激素诱导的内皮细胞自噬，促进内皮细胞迁移和血管生成。
骨微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）构成附着在骨小梁上的单层结构，与血液中的成分直接接触，为骨组织和细胞提供氧气和营养，还具有内分泌功能，这对维持骨内正常微环境具有重要意义[1-2]。而糖皮质激素是一类临床常用的抗炎药和免疫抑制剂，也是引起非创伤性股骨头坏死和继发性骨质疏松症最重要的危险因素[3-4]。我们前期实验表明，淫羊藿苷对高浓度激素导致的股骨头 BMECs 损伤有明显保护作用，而 0.1 mg/mL 浓度以下的激素并不会引起明显的内皮细胞凋亡[5-7]。自噬是目前生命科学研究的热点，指细胞通过降解内部损伤的蛋白质和细胞器等来维持稳态，实现细胞的代谢和更新，然而自噬达到一定水平，又会启动凋亡造成损伤[8]。目前淫羊藿苷对 BMECs 自噬的影响尚未见报道。外泌体则是一种直径 30～100 nm，在细胞间通讯中起重要作用的细胞外囊泡[9-10]。这些作用是通过以自分泌或旁分泌的形式在不同细胞间转运 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA）、蛋白质及其他活性物质实现的[9-10]。Jiang 等[11]报道缺氧能够刺激脐静脉内皮细胞产生外泌体，而后者又能够抑制缺氧造成的神经细胞凋亡，激活自噬过程。本实验中，我们拟观察淫羊藿苷对低浓度激素诱导的股骨头 BMECs 自噬以及外泌体产生的影响，以及后两者之间的相互作用，进一步探索激素相关骨病的发生机制及治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验标本及主要试剂、仪器
股骨头由因股骨颈骨折、原发性髋关节骨关节炎或先天性髋关节发育不良继发骨关节炎，而于中日友好医院接受全髋关节置换术的患者自愿捐献。
DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；MACS 运行缓冲液及 CD31 磁珠（Miltenyi 公司，德国）；内皮细胞培养基（ScienCell 公司，美国）；氢化可的松（辉瑞公司，美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；Matrigel 胶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、淫羊藿苷（Sigma 公司，美国）；CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、微管相关蛋白轻链 3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、死骨片 1（SQSTM1/p62）、β-肌动蛋白（β-actin）一抗及对应二抗（Abcam 公司，美国）；CD9、CD81、VEGFA、TGF-β1 一抗及对应二抗（Santa Cruz 公司，美国）；5×蛋白上样缓冲液、RIPA 裂解液、ECL 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，美国）；外泌体分离试剂盒（和光纯药工业株式会社，日本）。CO2 孵箱（Thermo 公司，美国）；倒置相差显微镜、荧光显微镜及照相系统（Nikon 公司，日本）；透射电镜（Joel 公司，日本）；Nanosight NS300 纳米粒子跟踪分析系统（Malvern 公司，英国）；低温高速离心机（Beckman 公司，美国）。
1.2 股骨头 BMECs 分离培养及相关观测
1.2.1 股骨头 BMECs 分离培养
无菌条件下将股骨头剖开，去掉筋膜、凝血块和其他杂质，将正常松质骨切成细小骨粒，放入 15 mL 离心管，用 DMEM 培养基洗涤 3 次。加入 5 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃ 水浴消化 25 min；再加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 min；最后加入 2 mL 含 10%FBS的 DMEM 培养基终止消化。将上清液通过 100 目细胞筛过滤，并以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min。将含有微血管段和细胞的沉淀物用 80 μL MACS 磁珠缓冲液和 20 μL CD31 磁珠重悬。4℃ 下温育 15 min，将细胞悬浮液与 400 μL MACS 运行缓冲液混合，通过固定在磁场中的 MACS 分选柱，500 µL 运行缓冲液冲洗 3 次。随后移去 MACS 分选柱，用 1 mL PBS 缓冲液将 C31 磁珠结合的细胞冲洗到 Eppendorf 管中，再次以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min。将离心细胞重悬于 5 mL 内皮细胞培养基并接种到培养瓶中，于 37℃、5%CO2、95% 湿度细胞培养箱中培养。24 h 后 PBS 洗涤，除去未附着的细胞。当细胞扩增至培养瓶底部 80% 以上时，进行细胞传代，取第 3 代细胞用于后续实验。
1.2.2 BMECs 形态观察
细胞贴壁后，每日于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。待细胞长满培养瓶底面积 80% 时，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 min，吹打后收集细胞悬液，以离心半径 10 cm、1 500 r/min 离心 6 min，4℃、3% 戊二醛固定，1% 锇酸固定，梯度乙醇-丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀染色 30 min，醋酸铅染色 15 min，透射电镜下观察。
1.2.3 免疫荧光染色检测细胞纯度
将分离培养 7 d 的细胞接种至防脱片载玻片上，生长 12 h 后用 PBS 洗涤 3 次，4% 多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 穿透；用 10%FBS 封闭后，将细胞与 CD31（1∶300）和 vWF（1∶300）一抗孵育过夜；然后 PBS 洗涤，并将细胞与标记有 FITC 或 Alexa 488 的二抗以及 DAPI 在室温下孵育 1 h。封片，于荧光显微镜下观察细胞形态，并随机选取 10 个视野，统计免疫荧光染色阳性细胞数量占同一视野下所有细胞数量的比例，计算细胞纯度。
1.3 糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
将 BMECs 以 5.0×105个/孔密度接种至 6 孔板，分为 8 组，每组设 3 个平行孔。A、B、C、D 组每孔分别加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氢化可的松的 DMEM 培养基；A1、B1、C1、D1 组分别加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氢化可的松的 DMEM 培养基后，再每孔给予 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷干预。培养 24 h 后 4℃ PBS 洗涤，收集细胞，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min，然后以离心半径 55 cm、12 000 r/min 离心 5 min，分离蛋白质，采用 Western blot 法检测各组 LC3B 和 p62 蛋白表达水平。具体操作：将蛋白样品与 5×蛋白凝胶电泳上样缓冲液混合，95℃ 变性 10 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳使染料至分离胶适当位置，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脱脂牛奶封闭 1 h；与特异性一抗 LC3B（1∶2 000）、p62（1∶2 000）和 β-actin（1∶3 000）孵育过夜后，与辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶5 000）孵育 50 min；使用 ECL 试剂盒处理印迹，暗室中曝光、显影并定影；条带灰度值采用 Quantity One v.4.6.2 软件分析。以 β-actin 蛋白作为内参，蛋白相对表达量以目标蛋白与 β-actin 蛋白灰度值的比值表示。其中 LC3B 包括 LC3B -Ⅰ和 LC3B-Ⅱ，自噬过程中，非激活型 LC3B-Ⅰ经过水解和脂质化后会转变为激活的自噬小体膜结合 LC3B-Ⅱ[12]，因此以 LC3B-Ⅱ的蛋白相对表达量来表示 LC3B 的蛋白相对表达量。
1.4 外泌体分离及相关观测
1.4.1 外泌体分离及其直径、浓度检测
将 BMECs 以 5.0×105个/mL 密度接种至 25 cm2培养瓶（5 mL 培养基），分别在含和不含 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷的无外泌体培养基（内皮细胞培养基中的 FBS 预先经 0.22 μm 滤膜过滤，以 100 000×g 离心 18 h，从而去除其中的外泌体）中培养 24 h（分别设为干预组和未干预组），收集上清液，应用外泌体分离试剂盒提取外泌体；将外泌体重悬于 PBS 中，通过纳米颗粒跟踪分析技术分析其直径分布和浓度。
1.4.2 BCA 法检测外泌体总蛋白质含量
将 BSA 作为标准品，按一系列浓度（25、125、250、500、750、1 000、1 500、2 000 μg/ mL）稀释，依次加入 10 μL 96 孔板中；取两组外泌体，加入蛋白上样缓冲液，煮沸，4℃ 下以离心半径 55 cm、12 000 r/min 离心 5 min，分离蛋白，将 10 μL 蛋白质样品加入 96 孔板。每孔加入 200 μL BCA 工作溶液，并在黑暗环境中于 37℃ 孵育 30 min。于 750 nm 波长下测量吸光度（A）值，按照 BSA 浓度绘制标准曲线，并根据标准曲线读取外泌体总蛋白质浓度。
1.4.3 Western blot 检测外泌体携带蛋白表达
取两组外泌体，按照 1.4.2 方法分离蛋白，按 1.3 方法检测 CD9、CD81、TGF-β1 和 VEGFA 蛋白相对表达量。
1.5 外泌体对 BMECs 自噬及功能的影响
1.5.1 Western blot 检测自噬相关蛋白表达
将 BMECs 以 5.0×105个/孔密度接种至 6 孔板，分为 3 组：实验组分离经 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），与 BMECs 共培养；对照组分离未经淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），与 BMECs 共培养；空白对照组为单纯 BMECs。培养 24 h 后，3 组均加入 0.06 mg/mL 氢化可的松处理 24 h 后，按 1.3 方法检测细胞中 LC3BⅡ和 p62 蛋白相对表达量。每组设 3 个平行孔。
1.5.2 划痕实验检测细胞迁移能力
用记号笔在 6 孔板背后均匀划横线，横穿过孔；取处于对数生长期、生长状态良好的第 3 代 BMCEs，以 1×106个/孔密度接种至上述 6 孔板，37℃、5%CO2 培养箱中培养过夜；待细胞铺满 6 孔板底部，用 10 μL 枪头垂至于背后的横线划痕。PBS 洗细胞 3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，实验组加入经 5×10−5 mol/L 淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），对照组加入未经淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体（浓度为 200 ng/μL），空白对照组不加入外泌体；培养 24 h 后以 0.06 mg/ mL 氢化可的松处理，分别于氢化可的松处理 0、12、 24 h 时进行拍照，按以下公式计算划痕闭合率：（a—b）/a×100%，其中 a 为整张照片宽度，b 为无细胞的空白部位宽度。
1.5.3 血管生成能力检测
向预冷的 24 孔板中按照 150 μL/孔浓度加入 Matrigel 胶，置于 37℃、5%CO2 培养箱中放置 30 min 使其凝固成胶，备用。取 BMECs 按 1.5.1 分组方法分别培养 24 h 后，胰蛋白酶消化，用无血清 DMEM 重悬细胞，以 2.5×105个/孔密度接种于涂有 Matrigel 胶的 24 孔板中；加入 0.06 mg/mL 氢化可的松，于 37℃、5%CO2、95% 湿度细胞培养箱内培养 4、8 h 后倒置相差显微镜 100 倍镜下拍照，随机取 3 个视野，计数管腔数、出芽数和小管分支长度。
1.6 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BMECs 形态观察和纯度检测
培养 2～3 d 可观察到贴壁细胞均匀分布于培养瓶中；分离细胞培养 7 d 倒置相差显微镜观察示，细胞生长趋于融合，呈纺锤形或多边形，镜下呈“铺路石”样（图 1a）。透射电镜观察示，分离细胞培养 14 d 时呈多边形，表面被细胞质凸起形成的微绒毛覆盖，细胞核较大，具有明显核仁；细胞质富含线粒体、粗面内质网、高尔基复合体和其他细胞器（图 1b）。免疫荧光染色示 vWF 和 CD31 阳性率接近 100%（图 1c、d）。
图1
BMECs 形态观察和纯度检测
a. 培养 7 d 倒置相差显微镜观察（×40）；b. 培养 14 d 透射电镜观察（×12 k）；c. 免疫荧光染色观察示 CD31 高表达（荧光显微镜×100）；d. 免疫荧光染色示 vWF 高表达（荧光显微镜×100）
Figure1. Morphology observation and purity identification of BMECsa. Inverted phase contrast microscope observation after 7 days of culture (×40); b. Transmission electron microscope observation after 14 days of culture (×12 k); c. Immunofluorescence staining showed high expression of CD31 (Fluorescence microscope×100); d. Immunofluorescence staining showed high expression of vWF (Fluorescence microscope×100)
2.2 糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
随着氢化可的松浓度升高，各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量逐渐增加，p62 蛋白相对表达量逐渐减少，A、B、C、D 组间及 A1、B1、C1、D1 组间差异均有统计学意义（P<0.01）。与相同浓度激素组相比，给予淫羊藿苷干预后，LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量减少，p62 蛋白表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 2。
图2
Western blot 检测糖皮质激素和淫羊藿苷对 BMECs 自噬相关蛋白的影响
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：A1 组 6：B1 组 7：C1 组 8：D1 组；b. 各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量比较；c. 各组 p62 蛋白相对表达量比较
Figure2. Effect of glucocorticoid and icariin on autophagy-related proteins in BMECs detected by Western blot analysisa. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group A1 6: Group B1 7: Group C1 8: Group D1; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.3 外泌体相关观测
2.3.1 外泌体直径和浓度检测
未干预组和干预组外泌体直径分别为（86.68±1.97）、（85.35±1.65）nm，差异无统计学意义（t=0.896，P=0.421）；浓度分别为（9.85±0.47）×106个/mL 和（1.54±0.08）×107个/mL，干预组显著高于未干预组，差异有统计学意义（t=−10.191，P=0.001）。
2.3.2 外泌体总蛋白质含量检测
未干预组和干预组外泌体总蛋白质含量分别为（132.63±3.33）μg/mL 和（138.56±9.58）μg/mL，比较差异无统计学意义（t=−1.102，P=0.369）。
2.3.3 Western blot 法检测外泌体携带蛋白表达
未干预组和干预组细胞中提取的外泌体中 CD9 和 CD81 均高度表达，干预组的 VEGFA/CD9 和 TGF-β1/CD9 蛋白相对表达量比值均显著高于未干预组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 3。
图3
Western blot 法检测外泌体携带蛋白表达
a. 电泳图 1：未干预组 2：干预组；b. 两组 VEGFA/CD9 蛋白相对表达量比较；c. 两组 TGF-β1/CD9 蛋白相对表达量比较
Figure3. Expression of exosome-carried proteins detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Non-intervention group 2: Intervention group; b. Comparison of protein expression ratio of VEGFA/CD9 in two groups; c. Comparison of protein expression ratio of TGF-β1/CD9 in two groups
2.4 外泌体对 BMECs 自噬及功能的影响
2.4.1 Western blot 检测自噬相关蛋白表达
在空白对照组、对照组和实验组中，p62 蛋白相对表达量呈递增趋势，LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量呈递减趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测外泌体对 BMECs 自噬相关蛋白表达的影响
a. 电泳图 1：空白对照组 2：对照组 3：实验组；b. 各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量比较；c. 各组 p62 蛋白相对表达量比较
Figure4. Effect of exosomes on the expression level of autophagy-related protein of BMECs detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.4.2 划痕实验检测细胞迁移能力
氢化可的松处理 0 h 时，镜下各组均显示清晰划痕，各组划痕闭合率比较差异无统计学意义（P>0.05）；12、24 h 时，对照组和实验组细胞迁移能力明显高于空白对照组，实验组明显高于对照组，各组划痕闭合率比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、表 1。
图5
划痕实验检测外泌体对内皮细胞迁移的影响（倒置相差显微镜×100）
从左至右依次为氢化可的松处理 0、12、24 h 时 a. 空白对照组；b. 对照组；c. 实验组
Figure5. Scratch test to detect the effect of exosomes on endothelial cell migration (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for hydrocortisone treatment lasted 0, 12, and 24 hours, respectively a. Blank control group; b. Control group; c. Experimental group
表1
氢化可的松处理后各时间点各组细胞划痕闭合率比较（n=3，%，）
Table1.
Comparison of scratch closure rates of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, %, )
2.4.3 血管生成能力检测
倒置相差显微镜观察可见各组在氢化可的松处理 4 h 后即有内皮细胞形成管状结构，见图 6。氢化可的松处理 4、8 h 时，实验组和对照组管腔数、出芽数和小管分支长度均显著大于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组小管分支长度和管腔数显著大于对照组（P<0.05），但出芽数与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
氢化可的松处理后各时间点各组细胞血管生成能力比较（n=3，）
Table2.
Comparison of angiogenic ability of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, )
图6
氢化可的松处理 4、8 h 各组细胞血管生成能力观察（倒置相差显微镜×100）
从左至右依次为空白对照组、对照组和实验组a. 4 h；b. 8 h
Figure6. Observation of angiogenic ability of cells in each group treated with hydrocortisone for 4 and 8 hours (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for blank control group, control group, and experimental group, respectively a. At 4 hours; b. At 8 hours
3 讨论
通过靶向激活人体组织中的相应受体（NR3C1、GR），糖皮质激素在机体的抗炎和其他生理功能调节中发挥了重要作用[13]。一系列研究表明，大剂量糖皮质激素对血管内皮细胞和心血管会产生有害作用，导致暂时性高血压、血脂异常、血栓形成甚至心肌梗死[14-15]。既往研究表明激素能够引起骨细胞的凋亡和自噬，其效果与激素的剂量有关，即高浓度激素引起细胞凋亡，而低浓度激素则引起细胞自噬[16]。
自噬广泛存在于哺乳动物的各种组织内，是一种对细胞增殖、分化以及状态和活力的维持都至关重要的过程[8]，也在股骨头坏死、骨质疏松等疾病的发病过程中起到重要作用[17-19]。自噬过程中，细胞质中会形成一种被称为“自噬体”的杯状结构，自噬体吞噬细胞质成分并与溶酶体融合，进而通过溶酶体水解酶降解吞噬的蛋白和细胞器[8]。血管内皮细胞损伤是激素性股骨头坏死和骨质疏松发生过程中的重要环节，而在发病早期，细胞可以通过自噬降解有害物质和受损细胞器来避免细胞损伤。然而，一旦自噬超过了细胞正常的防御能力，就会发生凋亡[17-19]。我们在前期实验中证明 0.1 mg/mL 浓度以下的激素并不会明显引起细胞凋亡[20]，本实验拟探究低浓度激素能否影响内皮细胞的自噬水平。由于股骨头是糖皮质激素相关性骨坏死最常见的发生部位，因此本实验中，我们分离了股骨头的 BMECs 进行研究。
目前有多种方法来检测细胞的自噬水平，例如 Western blot 法检测 LC3B 的切割、p62 的降解、Beclin 的表达水平，检测组织蛋白酶 Cathepsin 的活力以及透射电镜下观察自噬体形成等[5, 7, 21]。在自噬过程中，非激活型 LC3B -Ⅰ经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合 LC3B-Ⅱ[21]，而 p62 在自噬清除多泛素化蛋白时会优先被降解[22]。本实验中，随着激素浓度的升高，股骨头 BMECs 内 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量逐渐增高，而 p62 蛋白相对表达量则逐渐下降，表明细胞的自噬水平逐步增高，这是一种细胞的自我保护机制。前期有研究表明，用地塞米松处理内皮祖细胞能够增加其自噬水平，但随着暴露时间的延长，这一效果逐渐减低，同时细胞活性也逐渐减弱[12]。该研究表明自噬能够对抗激素引起的细胞毒作用，但这一效果是有限的。
淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，以“强骨补肾”而闻名[23]。淫羊藿苷可以改善 BMSCs 成脂肪分化和成骨分化之间的平衡，促进成骨细胞的增殖和矿化，并降低破骨细胞的活性[24-26]。Hu 等[27]揭示淫羊藿苷可以通过调节 Caspase-3 和 Bcl2 来预防人脐静脉内皮细胞因氧化低密度脂蛋白引起的损伤和凋亡。我们前期实验表明，淫羊藿苷能够阻止高浓度激素引起的股骨头 BMECs 凋亡[28]。但淫羊藿苷对自噬将产生何种影响仍然存在争议。Mi 等[29]研究表明淫羊藿苷能够通过抑制 NF-κB，从而激活软骨细胞自噬，抑制炎性反应和凋亡的发生。Jiang 等[30]则指出淫羊藿苷可以通过激活卵巢癌细胞 mTOR 信号通路，抑制自噬，促进凋亡，从而抑制肿瘤生成。既往的体外实验中，使用的淫羊藿苷剂量多为 5×10-6～5×10-5 mol/L，且具有剂量依赖性和剂量饱和性[31-32]。我们前期研究表明[29]，淫羊藿苷可以显著增强股骨头 BMECs 的活力。本实验结果表明 5×10-5 mol/L 浓度的淫羊藿苷能够抑制低浓度激素引起的 BMECs 自噬过程，且淫羊藿苷处理不会显著改变源自股骨头 BMECs 的外泌体的直径，但可以增加外泌体的数量。
外泌体是一种直径 30～100 nm，携带各种 mRNA、miRNA 和蛋白质的膜封闭的细胞外囊泡。被其他细胞摄取后，这些外泌体可以实现不同细胞间的通讯，影响受体细胞的信号通路，改变其周围的微环境[9-10]。此外，外泌体的供体细胞也可以重新摄取其分泌的外泌体[33]。受到外界刺激后，内皮细胞可释放外泌体到血液或细胞外液中并发挥多种作用：一方面，它们可以促进内皮细胞的存活；另一方面，它可能导致心血管疾病的发生[10]。有研究指出脂肪干细胞来源的外泌体可以可促进脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及管样结构形成[34]。因此，外泌体在未来可能用于治疗一系列相关疾病。
内皮细胞分泌的外泌体对各种细胞应激的反应明显不同。Zhao 等[35]研究表明，缺氧和脂多糖均增加了肺动脉内皮细胞释放的外泌体蛋白总量。de Jong 等[9]发现缺氧和 TNF-α 不会影响内皮细胞分泌的外泌体浓度和大小，但可能会改变外泌体携带的蛋白和 miRNA 组成。本研究中，我们应用外泌体分离提取试剂盒提取股骨头 BMECs 分泌的外泌体。CD9 和 CD81 是两种外泌体表面的标志蛋白[36]；同时，外泌体内参不同于常用的细胞内参（如 β-actin），外泌体中携带蛋白的相对表达量可用 CD9 含量进行归一化处理[36]。纳米粒子示踪分析技术和 Western blot 结果表明，虽然淫羊藿苷并不会明显改变股骨头 BMECs 分泌的外泌体的大小和所携带的蛋白总量，但可以明显增加外泌体的数量以及 VEGFA 和 TGF-β1 的含量，从而可能对受体细胞的生理功能起到调节作用。VEGF 是一个家族，包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC 和 VEGFD 等，其中 VEGFA 是最常用的一种，可促进新生血管生成[37]。既往研究表明，VEGF 可以抑制慢性脑缺血诱导的过度自噬，从而对认知功能起到保护作用[38]；Domigan 等[39]则表明耗竭内皮细胞自分泌的 VEGF 会导致线粒体断裂、葡萄糖代谢抑制、自噬增强，并最终导致细胞死亡。而 TGF-β1 一般被认为与细胞自噬形成正反馈回路[40-41]。
为了进一步阐明内皮细胞来源的外泌体在自噬发生中的作用，我们分离股骨头 BMECs 分泌的外泌体，与 BMECs 共培养，并使用低浓度激素进行干预。结果显示，与空白对照组和对照组相比，实验组的细胞自噬水平明显降低；进一步研究表明外泌体干预还能够促进内皮细胞的迁移和血管生成过程。这些结果均表明外泌体能够对其起到一定的保护作用。然而，关于淫羊藿苷和外泌体是通过何种通路抑制自噬的发生，外泌体又能否被骨微血管内皮摄取，尚需要进一步研究。
综上述，5×10-5 mol/L 淫羊藿苷能显著抑制低浓度激素诱导的股骨头 BMECs 自噬，从而对内皮细胞起到保护作用。淫羊藿苷干预虽然不能改变内皮细胞分泌的外泌体直径，但能增加外泌体中 VEGFA 和 TGF-β1 等蛋白的表达水平。由淫羊藿苷处理的股骨头 BMECs 产生的外泌体可以通过自分泌途径改善低浓度糖皮质激素诱导的内皮细胞自噬，促进内皮细胞迁移和血管生成。
