引用本文： 林剑彪, 黄国锋, 叶文斌, 朱聪, 高建廷, 刘国浚, 江惠祥, 吴本文, 丁真奇. SDF-1α/CXCR4 信号通路在轴向应力刺激促进骨再生中的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(6): 689-697. doi: 10.7507/1002-1892.201811031 复制
力学环境是骨生长与骨重建过程中的重要微环境之一，同样也是 BMSCs 增殖与分化过程中关键的刺激因素[1]。BMSCs 是骨髓内一种具有多向分化潜能的干细胞，机体受损时其能在受伤组织细胞分泌的趋化因子影响下，迁移到骨折区域或骨缺损处，促进骨愈合[2-3]。研究表明，基质细胞衍生因子 1α/趋化因子 CXC 亚族受体 4（stromal cell-derived factor 1α/cysteine X cysteine receptor 4，SDF-1α/CXCR4）信号通路在 MSCs 迁移中发挥重要作用[4]。 而轴向应力刺激可加速骨折愈合[5-8]及支架降解[9]。SDF-1α/CXCR4 信号通路是否在轴向应力刺激促进骨再生中发挥作用，目前尚不明确。
本课题组主要以轴向应力刺激为中心，将脱蛋白松质骨、BMSCs 及 SDF-1α/CXCR4 信号通路相结合，以明确外界应力刺激与内部调节因子间的关系。本研究利用自行研制的骨应力刺激仪进行动物实验，制备兔胫骨缺损修复模型模拟人体骨缺损修复过程，修复期间行轴向叩击治疗，经影像学、免疫组织化学及 Western blot 检测，了解骨愈合情况以及 VEGF、SDF-1α 和 CXCR4 的表达情况，进一步探讨轴向应力刺激促进骨再生的机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3～4 月龄雄性新西兰大白兔 72 只，体质量 2.0～2.5 kg，由上海市松江区松联实验动物场提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0011；由厦门大学附属东南医院/第九〇九医院全军骨科中心实验动物房饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0054。实验经厦门大学附属东南医院/第九〇九医院动物伦理委员会批准，实验过程中对动物的处置严格遵循国家有关动物保护和使用指南。
1.2 主要试剂及仪器
CXCR4 拮抗剂 AMD3100（上海皓元生物医药科技有限公司），使用前用 PBS 溶液配制成浓度为 0.1 mg/mL 的 AMD3100 溶液。一抗兔/小鼠 IgG、二抗聚合 HRP 标记兔/小鼠 IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；羊抗兔 IgG（南京森贝伽生物科技有限公司）。
骨应力刺激仪（专利号：CNl803117；厦门大博颖精医疗器械公司）。该仪器主要由主机、连接于主机一侧的凹槽式托架及遥控器 3 个部分组成。通过小锤伸缩运动，给予动态轴向循环应力刺激，模拟动物活动时负重骨受到的生理性应力。应力范围 1～50 N，频率 0.5～3.0 Hz，叩击时间 5～35 s，间歇时间 3～19 s。LEO-1530 扫描电镜（LEO 公司，德国）；Image Pro Plus 5.0 图像分析软件（MEDIA CYBERNETICS 公司，美国）；ChemiScope 6000 Touch 型电泳指导成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
1.3 脱蛋白松质骨支架制备
按照文献[10]方法制备脱蛋白松质骨支架。取市售小牛长骨干骺端，彻底剔除骨膜及软组织，清除骨髓，玻璃钻钻取直径 8 mm 圆柱状松质骨；37℃ 水浴箱孵育条件下，将松质骨置入 20%H2O2 进行脱蛋白 72 h，乙醚循环脱脂 48 h，制备脱蛋白松质骨支架，冷冻干燥。扫描电镜观察支架内部密集微孔结构，直径约 200 μm（图 1）。选择微孔密度、大小类似的支架样品，环氧乙烷消毒，密封保存备用。
图1
扫描电镜观察脱蛋白松质骨支架（×50）
Figure1.
Scanning electron microscopy observation of deprotei nized cancellous bone scaffold (×50)
1.4 动物模型制备
72 只新西兰大白兔术前禁水 2 h、禁食 8 h。将氯胺酮、陆眠宁按 2∶1 比例混合后，按照 0.5 mL/kg 剂量肌肉注射麻醉实验动物。于右后肢胫骨平台内侧下方 0.5 cm 处作长 2 cm 的纵切口，分离周围软组织与筋膜，向外牵开髌韧带，暴露胫骨结节近端斜面，用执笔式电钻制作直径 8 mm 圆形皮质骨缺损[11]。制备过程中，钻头垂直于骨面，钻取深度为 0.5～0.8 mm；注意生理盐水连续冲洗降温，同时清除骨碎屑。生理盐水冲洗术区后，于骨缺损处植入大小合适的脱蛋白松质骨支架，纱布擦拭干净后逐层缝合切口。术后每天注射青霉素 40 万 U，连续 3 d，预防感染。石膏固定术肢于屈髋、屈膝、屈踝位，直至实验结束。见图 2a～c。
图2
兔胫骨缺损修复模型制备及术肢应力刺激示意图
a. 修复前；b. 修复后；c. 术肢石膏固定后；d. 术肢给予应力刺激
Figure2. Repair model of tibial defect in rabbits and stress stimulation sketch of operative limbsa. Before repair; b. After repair; c. After plaster fixation; d. Stress stimulation of the operative limb
1.5 实验分组及方法
将 72 只动物模型随机分为 3 组（n=24），分别为 PBS 组（A 组）、PBS+应力刺激组（B 组）、AMD3100+应力刺激组（C 组）。骨缺损修复模型制备后，C 组立即腹腔注射 AMD3100 溶液（5 mL/kg），隔天 1 次，直至实验结束；A、B 组腹腔注射 PBS 溶液（5 mL/kg）。术后第 8 天开始，B、C 组采用骨应力刺激仪叩击术侧足跟部。叩击前同上法麻醉动物，拆除术肢石膏后将胫骨水平放置于固定架，足跟部与叩击小锤圆心在同一水平面上，小锤通过往返伸缩运动叩击足跟部（图 2d）。每 2 天给予应力刺激 1 次，每次 30 min，直至实验结束。叩击参数：应力 15 N、频率 1 Hz、叩击时间 5 s、间歇时间 3 s。叩击结束后术肢再次石膏固定，分笼饲养，允许自由活动。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况
观察各组术后动物成活及切口愈合情况，有无其他处骨折导致术肢畸形。
1.6.2 影像学观测
术后 2、4、8、12 周，各组取 6 只动物摄 X 线片，观察骨缺损愈合情况。根据 Lane-Sandhu X 线评分标准[12]，从有无新骨形成、骨折线清晰程度和骨重塑情况三方面对骨愈合评分。术后 12 周，各组 X 线片观察后行 Micro-CT 检查，对骨缺损区域扫描并三维重建，计算新生骨体积及新生骨密度。
1.6.3 组织学观察
术后 2、4、8、12 周，各组影像学观测后采用空气栓塞法处死动物，按照原切口入路切取胫骨，剔除胫骨肌肉组织，在骨缺损区域上、下各 0.25 cm 处用线锯锯断，获得长约 1.5 cm 骨组织。取部分标本脱钙、石蜡包埋、切片，片厚约 3 μm，常规 HE 染色后，光镜下观察新生骨组织及支架降解情况。
1.6.4 免疫组织化学染色观察
术后 2、4、8、12 周，取各组 1.6.3 中制备的切片脱蜡和水化，PBS 清洗后抗原修复，甲醛固定。滴加一抗兔/小鼠 IgG，4℃ 过夜，滴加聚合 HRP 标记抗兔/小鼠 IgG 二抗，DAB 显色，苏木素复染，梯度脱水、透明、树脂封片。光镜下观察骨缺损区、支架、外骨痂及内骨痂骨情况。采用 Image Pro Plus 5.0 图像分析软件测定 VEGF、CXCR4 阳性细胞吸光度（A）值，评价其表达水平。
1.6.5 Western blot检测
取 3 组术后 4、8 周部分骨组织样本，制备电泳凝胶，进行 SDS-PAGE 及转移（半干式转移）。一抗为 SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗体（1∶500），二抗为羊抗兔 IgG（1∶5 000）。采用电泳指导成像系统对杂交带进行扫膜分析，测量 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表达水平。
1.7 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中，3 只动物因麻醉原因死亡，作相应补充。各组实验动物麻醉清醒后均正常进食，术后切口均Ⅰ期愈合。术后 12 周标本取材时大体观察，A 组骨缺损区可见大量支架残留，仅有部分新生骨生成；B 组骨缺损区支架被新生骨完全吸收替代，髓腔通畅；C 组骨缺损区骨痂生成，支架大部分吸收，但骨缺损仍未修复。
2.2 影像学观测
2.2.1 X线片观察
A 组：术后 2 周骨缺损区及支架无明显变化；4 周时仅少量骨痂形成，骨缺损边缘仍清晰可见；8 周时骨痂增多，但大部分支架仍存在，无明显吸收；12 周骨痂进一步增多，但骨缺损区仍以高密度阴影为主，髓腔仍被支架堵塞。B 组：术后 2 周骨缺损区边缘骨折线稍模糊；4 周时骨缺损区边缘变模糊，骨痂进一步向支架长入；8 周时新生骨痂明显增多，且支架大部分吸收，出现部分骨髓腔结构；12 周时骨缺损区新生骨组织形态与正常骨基本相同，新骨塑形好，髓腔再通，骨皮质连续。C 组：术后 2 周骨缺损区及支架无明显变化；4 周时骨缺损中央区呈低密度组织阴影，可见少量新生骨痂；8 周时骨缺损边缘模糊，部分骨痂形成；12 周骨缺损区未愈合，支架大部分吸收。见图 3。
图3
术后各组X线片检查
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure3. X-ray films of 3 groups after operationFrom left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
X 线片评分显示，除 2 周外，4、8、12 周时 B 组评分均明显高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
术后各组Lane-Sandhu X线评分
Figure4.
The Lane-Sandhu scores of 3 groups after operation
2.2.2 Micro-CT观测
术后 12 周，A 组胫骨骨缺损仅部分修复，骨痂较少，骨髓腔中仍见大量支架；B 组骨缺损完全修复，髓腔再通且修复部位骨皮质厚度较一致；C 组骨缺损未完全修复，髓腔中仍有少量支架。见图 5。
图5
各组术后12 周骨缺损区域Micro-CT 三维重建
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Micro-CT three-dimensional reconstruction of bone defect at 12 weeks after operation in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
B 组新生骨体积为（192.3±9.9）mm3，明显高于 A 组的（88.6±8.0）mm3 和 C 组的（87.3±103）mm3，差异均有统计学意义（P<0.05）；B 组新生骨密度为（969.2±102.2）mg HA/ccm，明显高于 A 组（627.8±95.3）mg HA/ccm 和 C 组的（605.1±95.4）mg HA/ccm，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3 组织学观察
A 组：术后 2 周，支架无明显吸收且未见新生骨组织；4 周，支架无明显吸收，材料孔隙内充满纤维组织及炎性细胞，极少量新生骨形成；8 周，支架部分吸收，周围仍被纤维组织包裹，缺损区边缘少量新生骨形成；12 周，仍可见大部分支架存在，有部分新骨形成，以缺损区边缘为主，新生骨与宿主部分连接。见图 6a。
图6
术后各组HE染色观察（×40）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure6. HE staining observation of 3 groups after operation (×40)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
B 组：术后 2 周，支架材料孔隙内有部分纤维结缔组织、血管和炎性细胞聚集，支架上可见少量新生骨组织；4 周，支架材料部分吸收，纤维结缔组织、血管及新生骨组织进一步增多；8 周，支架材料大部分吸收，以新生骨组织替代，新生骨与骨端连接紧密；12 周，支架完全吸收，部分新生骨形成板层骨，有典型骨小梁形成，其内可见大量成骨细胞，缺损区骨皮质连续。见图 6b。
C 组：术后 2 周，支架无明显吸收及无新生骨组织；4 周，支架少量吸收且可见少量新生骨组织，纤维结缔组织、血管；8 周，支架进一步吸收，少量骨小梁，周围分布大量纤维结缔组织、炎性细胞及新生血管；12 周，仍可见部分残余支架，骨组织虽呈一定序列排列，且骨小梁数量较少、间隙宽大，未见明显成骨细胞。见图 6c。
2.4 免疫组织化学染色观察
2.4.1 VEGF
术后 2 周，3 组基质中间充质细胞、软骨细胞及成纤维细胞中均有 VEGF 阳性表达。4 周，与 A、C 组相比，B 组支架周边及新生骨组织阳性表达均增强。8 周后，3 组 VEGF 阳性表达较前下降，但 B 组阳性表达仍高于 A、C 组。见图 7。
图7
术后各组免疫组织化学染色观察VEGF表达（×200）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure7. Immunohistochemical staining of VEGF in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4.2 CXCR4
术后 2 周，A 组仅有少量细胞显色，B 组较多，C 组偶有细胞显色。4 周，A、B 组显色细胞进一步增多，B 组显色程度强于 A 组，C 组仍仅有少数细胞显色。8 周后，3 组显色程度较前减弱，但 B 组仍强于 A、C 组。见图 8。
图8
术后各组免疫组织化学染色观察CXCR4表达（×200）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Immunohistochemical staining of CXCR4 in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
术后各时间点 B 组 VEGF、CXCR4 阳性表达量明显高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 9。
图9
各组VEGF及CXCR4表达比较
a. VEGF；b. CXCR4
Figure9. Comparison of VEGF and CXCR4 expressions between groupsa. VEGF; b. CXCR4
2.5 Western blot检测
4、8 周时 B 组 SDF-1α 与 CXCR4 蛋白表达均高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 10、11。
图10
Western blot检测SDF-1α及CXCR4蛋白表达1：A组 2：B组 3：C组 a. 4 周; b. 8 周
Figure10.
The SDF-1α and CXCR4 protein expressions detected by Western blot
1: Group A 2: Group B 3: Group C a. Four weeks; b. Eight weeks
图11
各组 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表达量比较
a. 4 周; b. 8 周
Figure11. Comparison of SDF-1α and CXCR4 protein expressions between groupsa. Four weeks; b. Eight weeks
3 讨论
骨折愈合是一个错综复杂的生物学过程，与应力环境密切相关。应力对骨折愈合的影响主要包括 3 个因素。① 应力方向：骨折愈合初期，轴向应力可促进软骨基质矿化及 BMSCs 分化、增殖，并形成不同的组织类型，有利于编织骨改建成板层骨[13-14]。临床研究已经证实轴向应力叩击治疗能明显加速骨再生，促进骨愈合，具有良好的临床应用价值[6]。② 应力方式：与连续性应力刺激相比，间歇性应力刺激更能增强成骨细胞活性。喻鑫罡等[15]对绵羊双侧胫骨中段横行截骨，在单边外固定支架固定后予低频微动刺激，结果显示在骨折愈合早期频率 1.0 Hz 的微动刺激能有效促进骨组织生长及骨痂矿化。③ 应力大小：应力刺激过大、过小均不利于骨折愈合，只有适宜的应力才能促进成骨作用。本课题组前期研究[9]还发现，术后 1 周给予兔自身体质量 1/2 的轴向叩击刺激最有利于骨缺损修复，刺激最佳参数组合为每 2 天刺激 1 次，每次 30 min，应力 15 N，频率 1 Hz，叩击时间 5 s，间歇时间 3 s，有利于成骨的最终形成及支架材料降解。因此，本次研究中我们选择了该应力刺激参数组合，结果显示该种叩击式应力刺激可以促进骨再生。
本次研究一个重要目的是探索叩击式应力刺激促进骨再生的机制。既往研究发现，SDF-1α 在机械应力刺激骨折愈合的过程中起重要作用。人体内 SDF-lα/CXCR4 是 BMSCs 动员、迁移、归巢的关键性因素之一。同时，在骨损伤早期各种炎性介质亦能调节 SDF-lα 表达，相关动物实验发现通过给予间歇性应力刺激，在一定程度上造成细微的二次损伤，可明显延长骨折区域的炎性反应期[16]，使骨膜表达 SDF-1α 明显增强，诱导 BMSCs 迁移至骨损伤部位[17]。BMSCs 进入骨缺损区域后，不但可以分泌促进新生骨组织细胞生长因子，还可以间接促进骨组织血管化，对于加速骨愈合形成起着重要作用[18-19]。另外，BMSCs 增殖与分化过程中离不开机械应力刺激[1]。Simmons 等[20]采用周期性机械牵张力刺激 BMSCs，发现实验组细胞外基质矿化明显优于对照组。而缺乏机械应力刺激时，BMSCs 向脂肪细胞转化的能力增强，向成骨细胞转化的能力受到抑制。
为进一步验证 SDF-lα/CXCR4 信号通路的作用，我们采用了 AMD3100 阻断 SDF-lα/CXCR4 信号通路，观察骨再生是否受影响。本次研究所用的 AMD3100 是人工合成的大环类 CXCR4 的非肽类阻断剂，可有效地与 CXCR4 结合阻断 SDF-1α 与 CXCR4 启动下游信号通路，但不对 CXCR4 产生激动作用。AMD3100 具有阻止 BMSCs 顺 SDF-1α 浓度梯度迁移的作用，大剂量 AMD3100 具备动员干细胞作用，而小剂量 AMD3100 动员干细胞能力明显减弱。有研究发现 SDF-1α 能刺激 VEGF、TGF-β 的表达[21-23]，利用鼠模型研究 VEGF 诱导血管形成，发现新生血管周围聚集着 BMSCs，同时 SDF-1α 大量表达，当给予 AMD3100 阻断信号通路后 BMSCs 和新生血管数量明显减少，提示 VEGF 能够诱导 BMSCs，且 SDF-1α 能协助 VEGF 促血管形成，两者具有相互影响、协同分泌作用。本次研究中，相同应力刺激下连续应用小剂量 AMD3100 使骨折愈合时间明显延长，提示 SDF-lα/CXCR4 信号通路在轴向应力促进骨再生中发挥重要调节作用。另外，本次研究观察了术后 2、4、8、12 周骨缺损区移植支架吸收与骨愈合情况，分析早期应力刺激状态下骨愈合与 SDF-lα 的相关性。研究表明，仅有胞膜表达 CXCR4 的 BMSCs 才会顺 SDF-lα 浓度差迁移至骨折部位，无 CXCR4 的 BMSCs 则不受诱导[24]。本次研究中，CXCR4 免疫组织化学染色观察发现，B 组术后染色程度强于 A、C 组，而 C 组仅微量表达。这提示骨愈合早期，应力刺激可能延长炎症期，骨缺损区组织 SDF-lα 表达得到加强，轴向应力叩击同时促使 BMSCs 不断增殖、分化，成骨细胞和软骨细胞数量剧增，形成放大效应，骨愈合后期骨损伤处逐渐修复，SDF-1α 表达减少，阳性结果表达呈递减趋势。同时，Western blot 检测结果显示，应力刺激下 SDF-1α 及 CXCR4 在骨愈合早期得到充分表达，随着骨缺损区的修复，受损组织局部氧张力趋于正常，SDF-1α 表达量逐渐下降，亦接近于正常[25]，此与免疫组织化学染色结果一致。上述结果表明，给予应力刺激下，骨损伤组织 SDF-1α 蛋白表达明显增多，表达有 CXCR4 受体的 BMSCs 随之增多，反之也提示若缺少应力刺激可能会影响 BMSCs 增殖及分化进程。
本研究不足包括未阐明应力刺激治疗后，骨缺损 SDF-1α 表达上调的具体分泌组织结构、检测诱导 BMSCs 的 SDF-1α 最佳浓度，未能验证除此因素是否还受其他生长因子的调控。传统观点认为 SDF-1α 仅有唯一受体 CXCR4[26]，但随着研究深入，发现 CXCR7 为 SDF-1α 新受体[27]。虽然 AMD3100 能够同时抑制 BMSCs 膜上 CXCR4 及 CXCR7 蛋白的表达[28]，但对 SDF-1α/CXCR7 信号通路在 BMSCs 中的作用机制有待进一步探索。
力学环境是骨生长与骨重建过程中的重要微环境之一，同样也是 BMSCs 增殖与分化过程中关键的刺激因素[1]。BMSCs 是骨髓内一种具有多向分化潜能的干细胞，机体受损时其能在受伤组织细胞分泌的趋化因子影响下，迁移到骨折区域或骨缺损处，促进骨愈合[2-3]。研究表明，基质细胞衍生因子 1α/趋化因子 CXC 亚族受体 4（stromal cell-derived factor 1α/cysteine X cysteine receptor 4，SDF-1α/CXCR4）信号通路在 MSCs 迁移中发挥重要作用[4]。 而轴向应力刺激可加速骨折愈合[5-8]及支架降解[9]。SDF-1α/CXCR4 信号通路是否在轴向应力刺激促进骨再生中发挥作用，目前尚不明确。
本课题组主要以轴向应力刺激为中心，将脱蛋白松质骨、BMSCs 及 SDF-1α/CXCR4 信号通路相结合，以明确外界应力刺激与内部调节因子间的关系。本研究利用自行研制的骨应力刺激仪进行动物实验，制备兔胫骨缺损修复模型模拟人体骨缺损修复过程，修复期间行轴向叩击治疗，经影像学、免疫组织化学及 Western blot 检测，了解骨愈合情况以及 VEGF、SDF-1α 和 CXCR4 的表达情况，进一步探讨轴向应力刺激促进骨再生的机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3～4 月龄雄性新西兰大白兔 72 只，体质量 2.0～2.5 kg，由上海市松江区松联实验动物场提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0011；由厦门大学附属东南医院/第九〇九医院全军骨科中心实验动物房饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0054。实验经厦门大学附属东南医院/第九〇九医院动物伦理委员会批准，实验过程中对动物的处置严格遵循国家有关动物保护和使用指南。
1.2 主要试剂及仪器
CXCR4 拮抗剂 AMD3100（上海皓元生物医药科技有限公司），使用前用 PBS 溶液配制成浓度为 0.1 mg/mL 的 AMD3100 溶液。一抗兔/小鼠 IgG、二抗聚合 HRP 标记兔/小鼠 IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；羊抗兔 IgG（南京森贝伽生物科技有限公司）。
骨应力刺激仪（专利号：CNl803117；厦门大博颖精医疗器械公司）。该仪器主要由主机、连接于主机一侧的凹槽式托架及遥控器 3 个部分组成。通过小锤伸缩运动，给予动态轴向循环应力刺激，模拟动物活动时负重骨受到的生理性应力。应力范围 1～50 N，频率 0.5～3.0 Hz，叩击时间 5～35 s，间歇时间 3～19 s。LEO-1530 扫描电镜（LEO 公司，德国）；Image Pro Plus 5.0 图像分析软件（MEDIA CYBERNETICS 公司，美国）；ChemiScope 6000 Touch 型电泳指导成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
1.3 脱蛋白松质骨支架制备
按照文献[10]方法制备脱蛋白松质骨支架。取市售小牛长骨干骺端，彻底剔除骨膜及软组织，清除骨髓，玻璃钻钻取直径 8 mm 圆柱状松质骨；37℃ 水浴箱孵育条件下，将松质骨置入 20%H2O2 进行脱蛋白 72 h，乙醚循环脱脂 48 h，制备脱蛋白松质骨支架，冷冻干燥。扫描电镜观察支架内部密集微孔结构，直径约 200 μm（图 1）。选择微孔密度、大小类似的支架样品，环氧乙烷消毒，密封保存备用。
图1
扫描电镜观察脱蛋白松质骨支架（×50）
Figure1.
Scanning electron microscopy observation of deprotei nized cancellous bone scaffold (×50)
1.4 动物模型制备
72 只新西兰大白兔术前禁水 2 h、禁食 8 h。将氯胺酮、陆眠宁按 2∶1 比例混合后，按照 0.5 mL/kg 剂量肌肉注射麻醉实验动物。于右后肢胫骨平台内侧下方 0.5 cm 处作长 2 cm 的纵切口，分离周围软组织与筋膜，向外牵开髌韧带，暴露胫骨结节近端斜面，用执笔式电钻制作直径 8 mm 圆形皮质骨缺损[11]。制备过程中，钻头垂直于骨面，钻取深度为 0.5～0.8 mm；注意生理盐水连续冲洗降温，同时清除骨碎屑。生理盐水冲洗术区后，于骨缺损处植入大小合适的脱蛋白松质骨支架，纱布擦拭干净后逐层缝合切口。术后每天注射青霉素 40 万 U，连续 3 d，预防感染。石膏固定术肢于屈髋、屈膝、屈踝位，直至实验结束。见图 2a～c。
图2
兔胫骨缺损修复模型制备及术肢应力刺激示意图
a. 修复前；b. 修复后；c. 术肢石膏固定后；d. 术肢给予应力刺激
Figure2. Repair model of tibial defect in rabbits and stress stimulation sketch of operative limbsa. Before repair; b. After repair; c. After plaster fixation; d. Stress stimulation of the operative limb
1.5 实验分组及方法
将 72 只动物模型随机分为 3 组（n=24），分别为 PBS 组（A 组）、PBS+应力刺激组（B 组）、AMD3100+应力刺激组（C 组）。骨缺损修复模型制备后，C 组立即腹腔注射 AMD3100 溶液（5 mL/kg），隔天 1 次，直至实验结束；A、B 组腹腔注射 PBS 溶液（5 mL/kg）。术后第 8 天开始，B、C 组采用骨应力刺激仪叩击术侧足跟部。叩击前同上法麻醉动物，拆除术肢石膏后将胫骨水平放置于固定架，足跟部与叩击小锤圆心在同一水平面上，小锤通过往返伸缩运动叩击足跟部（图 2d）。每 2 天给予应力刺激 1 次，每次 30 min，直至实验结束。叩击参数：应力 15 N、频率 1 Hz、叩击时间 5 s、间歇时间 3 s。叩击结束后术肢再次石膏固定，分笼饲养，允许自由活动。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况
观察各组术后动物成活及切口愈合情况，有无其他处骨折导致术肢畸形。
1.6.2 影像学观测
术后 2、4、8、12 周，各组取 6 只动物摄 X 线片，观察骨缺损愈合情况。根据 Lane-Sandhu X 线评分标准[12]，从有无新骨形成、骨折线清晰程度和骨重塑情况三方面对骨愈合评分。术后 12 周，各组 X 线片观察后行 Micro-CT 检查，对骨缺损区域扫描并三维重建，计算新生骨体积及新生骨密度。
1.6.3 组织学观察
术后 2、4、8、12 周，各组影像学观测后采用空气栓塞法处死动物，按照原切口入路切取胫骨，剔除胫骨肌肉组织，在骨缺损区域上、下各 0.25 cm 处用线锯锯断，获得长约 1.5 cm 骨组织。取部分标本脱钙、石蜡包埋、切片，片厚约 3 μm，常规 HE 染色后，光镜下观察新生骨组织及支架降解情况。
1.6.4 免疫组织化学染色观察
术后 2、4、8、12 周，取各组 1.6.3 中制备的切片脱蜡和水化，PBS 清洗后抗原修复，甲醛固定。滴加一抗兔/小鼠 IgG，4℃ 过夜，滴加聚合 HRP 标记抗兔/小鼠 IgG 二抗，DAB 显色，苏木素复染，梯度脱水、透明、树脂封片。光镜下观察骨缺损区、支架、外骨痂及内骨痂骨情况。采用 Image Pro Plus 5.0 图像分析软件测定 VEGF、CXCR4 阳性细胞吸光度（A）值，评价其表达水平。
1.6.5 Western blot检测
取 3 组术后 4、8 周部分骨组织样本，制备电泳凝胶，进行 SDS-PAGE 及转移（半干式转移）。一抗为 SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗体（1∶500），二抗为羊抗兔 IgG（1∶5 000）。采用电泳指导成像系统对杂交带进行扫膜分析，测量 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表达水平。
1.7 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中，3 只动物因麻醉原因死亡，作相应补充。各组实验动物麻醉清醒后均正常进食，术后切口均Ⅰ期愈合。术后 12 周标本取材时大体观察，A 组骨缺损区可见大量支架残留，仅有部分新生骨生成；B 组骨缺损区支架被新生骨完全吸收替代，髓腔通畅；C 组骨缺损区骨痂生成，支架大部分吸收，但骨缺损仍未修复。
2.2 影像学观测
2.2.1 X线片观察
A 组：术后 2 周骨缺损区及支架无明显变化；4 周时仅少量骨痂形成，骨缺损边缘仍清晰可见；8 周时骨痂增多，但大部分支架仍存在，无明显吸收；12 周骨痂进一步增多，但骨缺损区仍以高密度阴影为主，髓腔仍被支架堵塞。B 组：术后 2 周骨缺损区边缘骨折线稍模糊；4 周时骨缺损区边缘变模糊，骨痂进一步向支架长入；8 周时新生骨痂明显增多，且支架大部分吸收，出现部分骨髓腔结构；12 周时骨缺损区新生骨组织形态与正常骨基本相同，新骨塑形好，髓腔再通，骨皮质连续。C 组：术后 2 周骨缺损区及支架无明显变化；4 周时骨缺损中央区呈低密度组织阴影，可见少量新生骨痂；8 周时骨缺损边缘模糊，部分骨痂形成；12 周骨缺损区未愈合，支架大部分吸收。见图 3。
图3
术后各组X线片检查
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure3. X-ray films of 3 groups after operationFrom left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
X 线片评分显示，除 2 周外，4、8、12 周时 B 组评分均明显高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
术后各组Lane-Sandhu X线评分
Figure4.
The Lane-Sandhu scores of 3 groups after operation
2.2.2 Micro-CT观测
术后 12 周，A 组胫骨骨缺损仅部分修复，骨痂较少，骨髓腔中仍见大量支架；B 组骨缺损完全修复，髓腔再通且修复部位骨皮质厚度较一致；C 组骨缺损未完全修复，髓腔中仍有少量支架。见图 5。
图5
各组术后12 周骨缺损区域Micro-CT 三维重建
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Micro-CT three-dimensional reconstruction of bone defect at 12 weeks after operation in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
B 组新生骨体积为（192.3±9.9）mm3，明显高于 A 组的（88.6±8.0）mm3 和 C 组的（87.3±103）mm3，差异均有统计学意义（P<0.05）；B 组新生骨密度为（969.2±102.2）mg HA/ccm，明显高于 A 组（627.8±95.3）mg HA/ccm 和 C 组的（605.1±95.4）mg HA/ccm，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3 组织学观察
A 组：术后 2 周，支架无明显吸收且未见新生骨组织；4 周，支架无明显吸收，材料孔隙内充满纤维组织及炎性细胞，极少量新生骨形成；8 周，支架部分吸收，周围仍被纤维组织包裹，缺损区边缘少量新生骨形成；12 周，仍可见大部分支架存在，有部分新骨形成，以缺损区边缘为主，新生骨与宿主部分连接。见图 6a。
图6
术后各组HE染色观察（×40）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure6. HE staining observation of 3 groups after operation (×40)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
B 组：术后 2 周，支架材料孔隙内有部分纤维结缔组织、血管和炎性细胞聚集，支架上可见少量新生骨组织；4 周，支架材料部分吸收，纤维结缔组织、血管及新生骨组织进一步增多；8 周，支架材料大部分吸收，以新生骨组织替代，新生骨与骨端连接紧密；12 周，支架完全吸收，部分新生骨形成板层骨，有典型骨小梁形成，其内可见大量成骨细胞，缺损区骨皮质连续。见图 6b。
C 组：术后 2 周，支架无明显吸收及无新生骨组织；4 周，支架少量吸收且可见少量新生骨组织，纤维结缔组织、血管；8 周，支架进一步吸收，少量骨小梁，周围分布大量纤维结缔组织、炎性细胞及新生血管；12 周，仍可见部分残余支架，骨组织虽呈一定序列排列，且骨小梁数量较少、间隙宽大，未见明显成骨细胞。见图 6c。
2.4 免疫组织化学染色观察
2.4.1 VEGF
术后 2 周，3 组基质中间充质细胞、软骨细胞及成纤维细胞中均有 VEGF 阳性表达。4 周，与 A、C 组相比，B 组支架周边及新生骨组织阳性表达均增强。8 周后，3 组 VEGF 阳性表达较前下降，但 B 组阳性表达仍高于 A、C 组。见图 7。
图7
术后各组免疫组织化学染色观察VEGF表达（×200）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure7. Immunohistochemical staining of VEGF in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4.2 CXCR4
术后 2 周，A 组仅有少量细胞显色，B 组较多，C 组偶有细胞显色。4 周，A、B 组显色细胞进一步增多，B 组显色程度强于 A 组，C 组仍仅有少数细胞显色。8 周后，3 组显色程度较前减弱，但 B 组仍强于 A、C 组。见图 8。
图8
术后各组免疫组织化学染色观察CXCR4表达（×200）
从左至右分别为 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Immunohistochemical staining of CXCR4 in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
术后各时间点 B 组 VEGF、CXCR4 阳性表达量明显高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 9。
图9
各组VEGF及CXCR4表达比较
a. VEGF；b. CXCR4
Figure9. Comparison of VEGF and CXCR4 expressions between groupsa. VEGF; b. CXCR4
2.5 Western blot检测
4、8 周时 B 组 SDF-1α 与 CXCR4 蛋白表达均高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 10、11。
图10
Western blot检测SDF-1α及CXCR4蛋白表达1：A组 2：B组 3：C组 a. 4 周; b. 8 周
Figure10.
The SDF-1α and CXCR4 protein expressions detected by Western blot
1: Group A 2: Group B 3: Group C a. Four weeks; b. Eight weeks
图11
各组 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表达量比较
a. 4 周; b. 8 周
Figure11. Comparison of SDF-1α and CXCR4 protein expressions between groupsa. Four weeks; b. Eight weeks
3 讨论
骨折愈合是一个错综复杂的生物学过程，与应力环境密切相关。应力对骨折愈合的影响主要包括 3 个因素。① 应力方向：骨折愈合初期，轴向应力可促进软骨基质矿化及 BMSCs 分化、增殖，并形成不同的组织类型，有利于编织骨改建成板层骨[13-14]。临床研究已经证实轴向应力叩击治疗能明显加速骨再生，促进骨愈合，具有良好的临床应用价值[6]。② 应力方式：与连续性应力刺激相比，间歇性应力刺激更能增强成骨细胞活性。喻鑫罡等[15]对绵羊双侧胫骨中段横行截骨，在单边外固定支架固定后予低频微动刺激，结果显示在骨折愈合早期频率 1.0 Hz 的微动刺激能有效促进骨组织生长及骨痂矿化。③ 应力大小：应力刺激过大、过小均不利于骨折愈合，只有适宜的应力才能促进成骨作用。本课题组前期研究[9]还发现，术后 1 周给予兔自身体质量 1/2 的轴向叩击刺激最有利于骨缺损修复，刺激最佳参数组合为每 2 天刺激 1 次，每次 30 min，应力 15 N，频率 1 Hz，叩击时间 5 s，间歇时间 3 s，有利于成骨的最终形成及支架材料降解。因此，本次研究中我们选择了该应力刺激参数组合，结果显示该种叩击式应力刺激可以促进骨再生。
本次研究一个重要目的是探索叩击式应力刺激促进骨再生的机制。既往研究发现，SDF-1α 在机械应力刺激骨折愈合的过程中起重要作用。人体内 SDF-lα/CXCR4 是 BMSCs 动员、迁移、归巢的关键性因素之一。同时，在骨损伤早期各种炎性介质亦能调节 SDF-lα 表达，相关动物实验发现通过给予间歇性应力刺激，在一定程度上造成细微的二次损伤，可明显延长骨折区域的炎性反应期[16]，使骨膜表达 SDF-1α 明显增强，诱导 BMSCs 迁移至骨损伤部位[17]。BMSCs 进入骨缺损区域后，不但可以分泌促进新生骨组织细胞生长因子，还可以间接促进骨组织血管化，对于加速骨愈合形成起着重要作用[18-19]。另外，BMSCs 增殖与分化过程中离不开机械应力刺激[1]。Simmons 等[20]采用周期性机械牵张力刺激 BMSCs，发现实验组细胞外基质矿化明显优于对照组。而缺乏机械应力刺激时，BMSCs 向脂肪细胞转化的能力增强，向成骨细胞转化的能力受到抑制。
为进一步验证 SDF-lα/CXCR4 信号通路的作用，我们采用了 AMD3100 阻断 SDF-lα/CXCR4 信号通路，观察骨再生是否受影响。本次研究所用的 AMD3100 是人工合成的大环类 CXCR4 的非肽类阻断剂，可有效地与 CXCR4 结合阻断 SDF-1α 与 CXCR4 启动下游信号通路，但不对 CXCR4 产生激动作用。AMD3100 具有阻止 BMSCs 顺 SDF-1α 浓度梯度迁移的作用，大剂量 AMD3100 具备动员干细胞作用，而小剂量 AMD3100 动员干细胞能力明显减弱。有研究发现 SDF-1α 能刺激 VEGF、TGF-β 的表达[21-23]，利用鼠模型研究 VEGF 诱导血管形成，发现新生血管周围聚集着 BMSCs，同时 SDF-1α 大量表达，当给予 AMD3100 阻断信号通路后 BMSCs 和新生血管数量明显减少，提示 VEGF 能够诱导 BMSCs，且 SDF-1α 能协助 VEGF 促血管形成，两者具有相互影响、协同分泌作用。本次研究中，相同应力刺激下连续应用小剂量 AMD3100 使骨折愈合时间明显延长，提示 SDF-lα/CXCR4 信号通路在轴向应力促进骨再生中发挥重要调节作用。另外，本次研究观察了术后 2、4、8、12 周骨缺损区移植支架吸收与骨愈合情况，分析早期应力刺激状态下骨愈合与 SDF-lα 的相关性。研究表明，仅有胞膜表达 CXCR4 的 BMSCs 才会顺 SDF-lα 浓度差迁移至骨折部位，无 CXCR4 的 BMSCs 则不受诱导[24]。本次研究中，CXCR4 免疫组织化学染色观察发现，B 组术后染色程度强于 A、C 组，而 C 组仅微量表达。这提示骨愈合早期，应力刺激可能延长炎症期，骨缺损区组织 SDF-lα 表达得到加强，轴向应力叩击同时促使 BMSCs 不断增殖、分化，成骨细胞和软骨细胞数量剧增，形成放大效应，骨愈合后期骨损伤处逐渐修复，SDF-1α 表达减少，阳性结果表达呈递减趋势。同时，Western blot 检测结果显示，应力刺激下 SDF-1α 及 CXCR4 在骨愈合早期得到充分表达，随着骨缺损区的修复，受损组织局部氧张力趋于正常，SDF-1α 表达量逐渐下降，亦接近于正常[25]，此与免疫组织化学染色结果一致。上述结果表明，给予应力刺激下，骨损伤组织 SDF-1α 蛋白表达明显增多，表达有 CXCR4 受体的 BMSCs 随之增多，反之也提示若缺少应力刺激可能会影响 BMSCs 增殖及分化进程。
本研究不足包括未阐明应力刺激治疗后，骨缺损 SDF-1α 表达上调的具体分泌组织结构、检测诱导 BMSCs 的 SDF-1α 最佳浓度，未能验证除此因素是否还受其他生长因子的调控。传统观点认为 SDF-1α 仅有唯一受体 CXCR4[26]，但随着研究深入，发现 CXCR7 为 SDF-1α 新受体[27]。虽然 AMD3100 能够同时抑制 BMSCs 膜上 CXCR4 及 CXCR7 蛋白的表达[28]，但对 SDF-1α/CXCR7 信号通路在 BMSCs 中的作用机制有待进一步探索。
