引用本文： 高超, 李超明, 徐玉龙, 王振勇, 李浩江, 罗旭江, 彭礼庆, 张彬, 沈师, 刘舒云, 眭翔, 郭全义, 杨建华. 静电纺丝聚己内酯/Ⅰ型胶原纳米纤维取向性补片用于肩袖修复. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(5): 628-633. doi: 10.7507/1002-1892.201811034 复制
肩袖损伤是外科临床中最常见的肌腱损伤之一，由于肌腱固有的不良再生能力[1]，其自然愈合过程中常常形成瘢痕组织，降低了肌腱整体机械性能，损伤肌腱往往发生再次撕裂。目前用于损伤肌腱修复的治疗方式包括直接缝合、自体肌腱移植、同种异体肌腱移植和人工肌腱替代物移植。由于缺乏供体肌腱或存在免疫排斥反应等问题，使得自体肌腱移植、同种异体肌腱移植在临床上的应用受到限制。组织工程的飞速发展为肌腱再生修复提供了新的希望。组织工程利用种子细胞、生物支架、细胞因子的一种或不同组合取代或修复受伤组织，其中支架在组织再生过程中起到了至关重要的作用。研究表明，Ⅰ型胶原为天然高分子材料，是肌腱中占比最大的有机物，约占肌腱干质量的 60%，占胶原总质量的 95%[2]。聚己内酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的生物相容性和力学性能，并且该材料在体内的降解产物无毒，是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准通过的已被大量用于组织再生和修复领域的材料，但 PCL 材料存在细胞亲和性较低、降解速度慢等不足[3]。
静电纺丝技术的兴起为组织工程支架的构建提供了新的途径。静电纺丝技术能够简单且可控地将无机分子与高分子材料混合，制作出具有高孔隙率、高比表面积，力学性能可控，模拟人体组织的微纳米级结构，为细胞的黏附提供位点，并有利于细胞与支架材料的相互作用[4-6]。许多研究表明，细胞外基质样纳米纤维具有定制的纳米纤维结构（直径、取向性或非取向性排列、孔隙大小、孔隙率）、可控降解性和固定化可溶性信号，可提供理想的细胞刺激信号，促进细胞黏附、增殖、定向分化和组织形成[7-8]。利用这些优势，静电纺丝纳米纤维被广泛用于骨组织工程[9]、创面敷料[10]、人工血管形成[11]、神经组织再生[12]、药物输送载体[13]和生物分子输送[14]等方面。本实验在预实验基础上，得到 PCL 和Ⅰ型胶原的最优静电纺丝浓度，通过静电纺丝技术制备 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维取向性补片，对其进行理化表征和生物性能评价，探讨其作为肩袖修复人工合成材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康 3 周龄新西兰大白兔 2 只，体质量 0.5 kg，购于解放军总医院实验动物中心，所有动物实验均已获解放军总医院动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0062。
PCL（相对分子质量 80×103）、六氟异丙醇（阿拉丁生化科技股份公司）；0.25% 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、死/活细胞染色试剂盒（Sigma 公司，美国）；牛跟腱Ⅰ型胶原（奥多福尼生物科技有限公司）；FBS（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基（Corning 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）。
静电纺丝机（北京化工大学实验室自制）；85-2 型恒温磁力搅拌器（苏州国华仪器有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；E-1045 型扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；Epoch Take 3 酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）；BOSE 5100 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；傅氏转换红外线光谱分析仪（Ettlingen 公司，德国）；接触角测量仪（上海中晨数字技术设备有限公司）；CO2 恒温培养箱（Heraeus 公司，德国）；A1R-si 型共聚焦激光扫描显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 纳米纤维取向性补片的制备
1.2.1 静电纺丝溶液的配制
用电子天平称取 2 g PCL，加入 18 g 六氟异丙醇溶液中，在磁力搅拌下使其完全溶解，制备质量比为 10% 的 PCL 静电纺丝溶液；称取 0.8 g 牛跟腱Ⅰ型胶原完全溶解在 9.2 g 六氟异丙醇中，制备质量比为 8% 的Ⅰ型胶原静电纺丝溶液。取 4 g PCL 静电纺丝溶液与 1 g Ⅰ型胶原静电纺丝溶液混合，形成含有 25%Ⅰ型胶原的混合静电纺丝溶液。
1.2.2 两种纳米纤维取向性补片的制备
首先制备 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片，将 6 mL 混合静电纺丝溶液在通风橱中转移至注射器中，并使用型号为 21 G 的钝头针安装在注射器上。将注射器装在静电纺丝机上，以 0.8 mL/h 速率进行推注。针头尖端和接收器之间的距离为 15 cm。针头端连接正高压，接收器端连接负高压，两端电压差为 18 kV。在 3 000 r/min 高速转动的接收装置上，覆盖铝箔用于接受取向性纤维补片。电纺完毕后，将电纺丝膜与锡纸一起取下，在真空干燥箱中处理 6 h，使六氟异丙醇充分挥发，随后用密封袋包装密封保存。制备单纯 PCL 取向性补片时，取 6 mL 10%PCL 静电纺丝溶液，采用相同的方法进行静电纺丝。
1.3 两种补片理化表征观测指标
1.3.1 大体及微观结构观测
取两种补片分别观察其大体形貌，然后各剪取 1 cm×1 cm 的小块，分别黏贴固定于 5 cm 铝架上，并进行喷金处理，在高压 5 000 V、发射电流 10 μA 条件下进行扫描电镜观察。采用 Image-Pro Plus 软件对两种补片内表面 3 张图片中的 50 条纤维直径进行测量，计算纤维的平均直径，并通过密度法检测补片孔隙率。
1.3.2 力学性能检测
通过单轴拉伸试验检测两种补片纤维的力学性能。取两种补片各裁剪 3 个宽 10 mm，有效拉伸长度 20 mm，厚度约 0.15 mm 的样品。每个样品在测试前预加载至 0.1 N 以防止样品松弛，随后以 5 mm/min 速率拉伸至 5% 应变，而后以相同速率卸载至 0 应变，往复循环 10 次；随后样品以 5 mm/min 速率拉伸至断裂。根据绘制的应力-应变曲线分别记录两种补片的拉伸强度，并计算材料的杨氏模量。
1.3.3 红外光谱分析
取两种补片剪切成 1 cm×1 cm 的小块，分别进行压片，使样品表面平整光滑。将压片后的补片放入傅氏转换红外线光谱分析仪的反应仓中，以 1 cm−1的分辨率，在 450～4 000 cm−1的吸收光谱范围内进行分析，根据吸收峰所对应的红外线波长来确定电纺膜中所存在的官能团，从而确定两种补片中的成分。
1.3.4 表面接触角检测
取两种补片，经 75% 乙醇擦拭后剪成 1 cm×1 cm 的小块（n=5）。通过静滴法，将去离子水滴到两种补片平整的表面，从侧面进行拍照。通过显微镜头与相机获得液滴的外形图像，再运用计算机自带的数字图像处理软件，计算图像中液滴的表面接触角。
1.4 两种补片的生物性能评估
1.4.1 兔肌腱干细胞分离培养
取新西兰大白兔，耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，常规备皮，手术暴露跟腱组织，剥离腱外膜组织，切取整段跟腱，PBS 液洗涤 3 次。将肌腱组织转移至无菌玻璃瓶中，用眼科剪将半月板剪碎，加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.1%Ⅰ型胶原酶，并将无菌磁珠置入玻璃瓶中；然后将玻璃瓶密封后置于 37℃、5%CO2 培养箱内，磁力搅拌器消化 60 min，至组织碎块完全消失；加入含 20%FBS 的 DMEM 培养液终止消化，以离心半径 10 cm、2 000 r/min 离心 5 min；去除上清，加入新鲜的含 20%FBS 的 DMEM 培养液，置于 25 cm2 培养瓶内。在原代细胞贴壁生长且融合成单层细胞后，进行传代培养。取第 3 代细胞进行以下实验。
1.4.2 CCK-8法检测细胞活性
根据 ISO10993-12：2009 医疗器械的生物学评定标准，按照浸提比为 1.25 cm2/mL 制备浸提液。分别将 15 cm2 60Co 辐照灭菌后的单纯 PCL 补片和 PCL/Ⅰ型胶原补片浸入 90 mL 含 20%FBS 的 DMEM 培养基中，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 72 h；然后将浸提液以离心半径 10 cm、1 200 r/min 离心 5 min，取上清，制得单纯 PCL 补片和 PCL/Ⅰ型胶原补片的 DMEM 浸提液。取第 3 代兔肌腱干细胞，以 4×103个/孔密度接种至 96 孔板，实验分为 3 组，每组设置 3 个复孔。实验组和对照组每孔分别加入 200 μL 相应补片浸提液培养基，空白对照组用含 20%FBS 的 DMEM 培养基培养细胞。将 3 组细胞于 37℃、5%CO2 培养箱内培养 5 d，每天取出 1 个孔板，分别加入 10 μL CCK-8 试剂，继续培养 4 h，用酶标仪于 450 nm 波长下测定吸光度（A）值。
1.4.3 细胞黏附及活性观察
将两种补片剪成 1 cm×1 cm 的小块，60Co 灭菌备用。取第 3 代兔肌腱干细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化计数，加入含 20%FBS 的 DMEM 培养基重悬后，制备成浓度为 3×106个/mL 的细胞悬液，分别接种至两种补片上，每个补片 100 μL（即每个补片复合 3×105个细胞）；置于 37℃、5%CO2 培养箱孵育 2 h 后，加入含 20%FBS 的 DMEM 培养基，返回培养箱继续培养。 3 d 后取出细胞-补片复合物，PBS 溶液清洗，按照死/活细胞染色试剂盒说明书进行死/活细胞染色，共聚焦激光扫描显微镜下观察肌腱干细胞在两组补片上的活性和黏附情况。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 两种补片理化表征观测
2.1.1 大体及微观结构观测
大体观察示，两组补片均呈乳白色，表面光滑，无明显粗糙、颗粒感，PCL/Ⅰ型胶原补片略宽于单纯 PCL 补片。见图 1。扫描电镜观察示，两种补片纤维均呈取向性排列，但 PCL/Ⅰ型胶原补片纤维排列取向稍差。对照组补片的纤维直径为（1.376 3±0.290 2）μm，显著高于实验组的（0.247 9±0.061 0）μm，差异有统计学意义（t=26.907，P=0.000）。见图 2。实验组补片纤维孔隙率为 56.44%±12.70%，显著高于对照组的 41.33%±11.41%，差异有统计学意义（t=2.506，P=0.032）。
图1
两种补片大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure1. Gross observation of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
图2
两种补片扫描电镜观察（×800）
a. 对照组；b. 实验组
Figure2. Scanning electron microscope observation of the two patches (×800)a. Control group; b. Experimental group
2.1.2 力学性能检测
对照组和实验组补片的纤维拉伸强度分别为（11.84±2.80）、（23.35±4.59）MPa，杨氏模量分别为（89.90±21.92）、（145.39±12.54）MPa，比较差异均有统计学意义（t=3.705，P=0.029；t=4.064，P=0.034）。
2.1.3 红外光谱分析
对照组补片中存在 1 725 cm−1处的羰基和 1 165 cm−1处的 C−O 键两个特征吸收峰（均为 PCL 的特征性吸收峰），以及一些相对矮小的吸收峰；实验组补片中除发现上述对照组补片的吸收峰外，还存在 1 653 cm−1、1 547 cm−1、3 310 cm−1 3 个特征峰（分别对应−C=C−、−NO2、−C≡C−H 特征基团，均为Ⅰ型胶原的特征性吸收峰）。见图 3。
图3
两种补片红外光谱图
Figure3.
Fourier transform infrared spectroscopy of the two patches
2.1.4 表面接触角检测
实验组补片表面接触角为（73.88±4.97）°，为亲水的；而对照组补片表面接触角为（128.46±5.10）°，为疏水的；两组表面接触角比较差异有统计学意义（t=21.705，P=0.002）。见图 4。
图4
两种补片的表面接触角
a. 对照组；b. 实验组
Figure4. The water contact angle of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
2.2 两种补片的生物性能评估
2.2.1 CCK-8法检测细胞活性
随培养时间延长，各组细胞 A 值均逐渐增加，各时间点实验组和对照组 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）；两组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
CCK-8法检测各组细胞活性
Figure5.
The cytotoxicity of each group by CCK-8 method
2.2.2 细胞黏附及活性观察
共聚焦激光扫描显微镜观察示，培养 3 d，兔肌腱干细胞在两种补片表面均可黏附、生长，实验组补片表面黏附的细胞数量多于对照组，且活性更好。见图 6。
图6
死/活细胞染色观察兔肌腱干细胞在两种补片表面的黏附及活性（共聚焦激光扫描显微镜×200）
a. 对照组；b. 实验组
Figure6. Adhesion and activity of rabbit tendon stem cells on the surface of the two patches observed by dead/living cell staining (Laser confocal scanning microscopy×200)a. Control group;b. Experimental group
3 讨论
肌腱连接肌肉和骨骼，在应力传递和关节稳定性方面起着至关重要的作用[15]。然而肌腱组织极易受到损伤，由于细胞外基质密度高，胶原组织、血管通透性差，其再生倾向较低。组织工程技术的发展为肌腱再生修复提供了新的途径。通过组织工程理念设计出一种新型肩袖补片，具有强大的机械强度，同时可以促进迁延而来的 BMSCs 以及激活的肌腱干细胞向肌腱细胞分化，为损伤肌腱提供良好微环境，成为临床发展的新方向。静电纺丝技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片为功能性修复损伤的肩袖带来了新的希望。
本研究扫描电镜结果表明，静电纺丝技术可以制备直径为微米级的有序排列的纤维丝，且纤维丝之间孔隙良好。文献报道静电纺丝中，微米纤维和纳米纤维的组合可产生更大的孔隙互连性和更大孔径，从而导致更好的细胞渗透[16]。Orr 等[17]研究发现，与无序的纤维相比，多层有序排列的 PCL 静电纺丝支架可模仿天然肌腱组织的各向异性，显著增加了细胞浸润，促进了间充质细胞的腱系分化，并提高了肌腱细胞外基质生成。Lomas 等[18]发现有序的静电纺丝纤维增加了肌腱样组织生成，虽然新生成的组织与天然组织相比更薄，机械性能更弱，但是支架的机械刺激促进更多有序的胶原纤维生成，大大增加了支架强度。多孔结构的静电纺丝纳米纤维补片有利于组织之间的物质交换，可以更好地促进肌腱愈合。通过力学检测可以发现，PCL/Ⅰ型胶原补片的拉伸强度和杨氏模量均强于单纯 PCL 补片，说明加入Ⅰ型胶原可以显著提高补片的力学性能。这也证实了当纺丝纤维中加入明胶、几丁质、胶原等材料时，静电纺丝材料的力学性能增强[19]。红外光谱分析结果显示，PCL/Ⅰ型胶原补片的吸收峰与单纯 PCL 补片相比发生了变化，说明Ⅰ型胶原和 PCL 成功混合，并未在纺丝过程中丢失，且两者未发生化学反应。Qiu 等[20]发现，Ⅰ型胶原支架与机械刺激共同作用可以促进人 MSCs 向成纤维细胞分化，所以我们认为 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片比单纯 PCL 补片更适合肩袖损伤的再生修复。
由于补片将被用来修复肩袖损伤，材料表面为亲水性更有利于细胞黏附和增殖，所以测定其亲水性十分必要[21]。Ghosal 等[22]研究发现，将胶原和 PCL 混合后材料的亲水性有所提高，表面接触角降低。本研究结果显示，PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片的表面接触角显著小于单纯 PCL 补片，说明Ⅰ型胶原的加入可以增加材料的亲水性，更有利于细胞黏附。Kopf 等[23]提出，亲水性材料表面可增加单位时间内细胞在材料表面的黏附数量，并进一步通过整合素介导细胞外基质等蛋白的黏附。本研究 CCK-8 细胞增殖与毒性实验进一步表明两种补片均无细胞毒性，对细胞的增殖无明显抑制作用。细胞-补片复合物共聚焦激光扫描显微镜观察结果也提示，PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片较单纯 PCL 补片更容易使细胞黏附、生长。
综上述，利用静电纺丝技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片可仿生天然组织的胶原纤维排列，一定程度实现了肌腱生物力学的各向异性；且 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片具有优良的理化性能，可以使细胞更好地黏附同时保持良好活性，未来可能作为肩袖修复理想的组织工程补片。但本实验只检测了在体外环境下 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片的性能，尚需进一步动物实验验证其促进肌腱愈合的能力。
肩袖损伤是外科临床中最常见的肌腱损伤之一，由于肌腱固有的不良再生能力[1]，其自然愈合过程中常常形成瘢痕组织，降低了肌腱整体机械性能，损伤肌腱往往发生再次撕裂。目前用于损伤肌腱修复的治疗方式包括直接缝合、自体肌腱移植、同种异体肌腱移植和人工肌腱替代物移植。由于缺乏供体肌腱或存在免疫排斥反应等问题，使得自体肌腱移植、同种异体肌腱移植在临床上的应用受到限制。组织工程的飞速发展为肌腱再生修复提供了新的希望。组织工程利用种子细胞、生物支架、细胞因子的一种或不同组合取代或修复受伤组织，其中支架在组织再生过程中起到了至关重要的作用。研究表明，Ⅰ型胶原为天然高分子材料，是肌腱中占比最大的有机物，约占肌腱干质量的 60%，占胶原总质量的 95%[2]。聚己内酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的生物相容性和力学性能，并且该材料在体内的降解产物无毒，是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准通过的已被大量用于组织再生和修复领域的材料，但 PCL 材料存在细胞亲和性较低、降解速度慢等不足[3]。
静电纺丝技术的兴起为组织工程支架的构建提供了新的途径。静电纺丝技术能够简单且可控地将无机分子与高分子材料混合，制作出具有高孔隙率、高比表面积，力学性能可控，模拟人体组织的微纳米级结构，为细胞的黏附提供位点，并有利于细胞与支架材料的相互作用[4-6]。许多研究表明，细胞外基质样纳米纤维具有定制的纳米纤维结构（直径、取向性或非取向性排列、孔隙大小、孔隙率）、可控降解性和固定化可溶性信号，可提供理想的细胞刺激信号，促进细胞黏附、增殖、定向分化和组织形成[7-8]。利用这些优势，静电纺丝纳米纤维被广泛用于骨组织工程[9]、创面敷料[10]、人工血管形成[11]、神经组织再生[12]、药物输送载体[13]和生物分子输送[14]等方面。本实验在预实验基础上，得到 PCL 和Ⅰ型胶原的最优静电纺丝浓度，通过静电纺丝技术制备 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维取向性补片，对其进行理化表征和生物性能评价，探讨其作为肩袖修复人工合成材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康 3 周龄新西兰大白兔 2 只，体质量 0.5 kg，购于解放军总医院实验动物中心，所有动物实验均已获解放军总医院动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0062。
PCL（相对分子质量 80×103）、六氟异丙醇（阿拉丁生化科技股份公司）；0.25% 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、死/活细胞染色试剂盒（Sigma 公司，美国）；牛跟腱Ⅰ型胶原（奥多福尼生物科技有限公司）；FBS（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基（Corning 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；链霉素-青霉素双抗（GIBCO 公司，美国）。
静电纺丝机（北京化工大学实验室自制）；85-2 型恒温磁力搅拌器（苏州国华仪器有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；E-1045 型扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；Epoch Take 3 酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）；BOSE 5100 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；傅氏转换红外线光谱分析仪（Ettlingen 公司，德国）；接触角测量仪（上海中晨数字技术设备有限公司）；CO2 恒温培养箱（Heraeus 公司，德国）；A1R-si 型共聚焦激光扫描显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 纳米纤维取向性补片的制备
1.2.1 静电纺丝溶液的配制
用电子天平称取 2 g PCL，加入 18 g 六氟异丙醇溶液中，在磁力搅拌下使其完全溶解，制备质量比为 10% 的 PCL 静电纺丝溶液；称取 0.8 g 牛跟腱Ⅰ型胶原完全溶解在 9.2 g 六氟异丙醇中，制备质量比为 8% 的Ⅰ型胶原静电纺丝溶液。取 4 g PCL 静电纺丝溶液与 1 g Ⅰ型胶原静电纺丝溶液混合，形成含有 25%Ⅰ型胶原的混合静电纺丝溶液。
1.2.2 两种纳米纤维取向性补片的制备
首先制备 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片，将 6 mL 混合静电纺丝溶液在通风橱中转移至注射器中，并使用型号为 21 G 的钝头针安装在注射器上。将注射器装在静电纺丝机上，以 0.8 mL/h 速率进行推注。针头尖端和接收器之间的距离为 15 cm。针头端连接正高压，接收器端连接负高压，两端电压差为 18 kV。在 3 000 r/min 高速转动的接收装置上，覆盖铝箔用于接受取向性纤维补片。电纺完毕后，将电纺丝膜与锡纸一起取下，在真空干燥箱中处理 6 h，使六氟异丙醇充分挥发，随后用密封袋包装密封保存。制备单纯 PCL 取向性补片时，取 6 mL 10%PCL 静电纺丝溶液，采用相同的方法进行静电纺丝。
1.3 两种补片理化表征观测指标
1.3.1 大体及微观结构观测
取两种补片分别观察其大体形貌，然后各剪取 1 cm×1 cm 的小块，分别黏贴固定于 5 cm 铝架上，并进行喷金处理，在高压 5 000 V、发射电流 10 μA 条件下进行扫描电镜观察。采用 Image-Pro Plus 软件对两种补片内表面 3 张图片中的 50 条纤维直径进行测量，计算纤维的平均直径，并通过密度法检测补片孔隙率。
1.3.2 力学性能检测
通过单轴拉伸试验检测两种补片纤维的力学性能。取两种补片各裁剪 3 个宽 10 mm，有效拉伸长度 20 mm，厚度约 0.15 mm 的样品。每个样品在测试前预加载至 0.1 N 以防止样品松弛，随后以 5 mm/min 速率拉伸至 5% 应变，而后以相同速率卸载至 0 应变，往复循环 10 次；随后样品以 5 mm/min 速率拉伸至断裂。根据绘制的应力-应变曲线分别记录两种补片的拉伸强度，并计算材料的杨氏模量。
1.3.3 红外光谱分析
取两种补片剪切成 1 cm×1 cm 的小块，分别进行压片，使样品表面平整光滑。将压片后的补片放入傅氏转换红外线光谱分析仪的反应仓中，以 1 cm−1的分辨率，在 450～4 000 cm−1的吸收光谱范围内进行分析，根据吸收峰所对应的红外线波长来确定电纺膜中所存在的官能团，从而确定两种补片中的成分。
1.3.4 表面接触角检测
取两种补片，经 75% 乙醇擦拭后剪成 1 cm×1 cm 的小块（n=5）。通过静滴法，将去离子水滴到两种补片平整的表面，从侧面进行拍照。通过显微镜头与相机获得液滴的外形图像，再运用计算机自带的数字图像处理软件，计算图像中液滴的表面接触角。
1.4 两种补片的生物性能评估
1.4.1 兔肌腱干细胞分离培养
取新西兰大白兔，耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，常规备皮，手术暴露跟腱组织，剥离腱外膜组织，切取整段跟腱，PBS 液洗涤 3 次。将肌腱组织转移至无菌玻璃瓶中，用眼科剪将半月板剪碎，加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.1%Ⅰ型胶原酶，并将无菌磁珠置入玻璃瓶中；然后将玻璃瓶密封后置于 37℃、5%CO2 培养箱内，磁力搅拌器消化 60 min，至组织碎块完全消失；加入含 20%FBS 的 DMEM 培养液终止消化，以离心半径 10 cm、2 000 r/min 离心 5 min；去除上清，加入新鲜的含 20%FBS 的 DMEM 培养液，置于 25 cm2 培养瓶内。在原代细胞贴壁生长且融合成单层细胞后，进行传代培养。取第 3 代细胞进行以下实验。
1.4.2 CCK-8法检测细胞活性
根据 ISO10993-12：2009 医疗器械的生物学评定标准，按照浸提比为 1.25 cm2/mL 制备浸提液。分别将 15 cm2 60Co 辐照灭菌后的单纯 PCL 补片和 PCL/Ⅰ型胶原补片浸入 90 mL 含 20%FBS 的 DMEM 培养基中，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 72 h；然后将浸提液以离心半径 10 cm、1 200 r/min 离心 5 min，取上清，制得单纯 PCL 补片和 PCL/Ⅰ型胶原补片的 DMEM 浸提液。取第 3 代兔肌腱干细胞，以 4×103个/孔密度接种至 96 孔板，实验分为 3 组，每组设置 3 个复孔。实验组和对照组每孔分别加入 200 μL 相应补片浸提液培养基，空白对照组用含 20%FBS 的 DMEM 培养基培养细胞。将 3 组细胞于 37℃、5%CO2 培养箱内培养 5 d，每天取出 1 个孔板，分别加入 10 μL CCK-8 试剂，继续培养 4 h，用酶标仪于 450 nm 波长下测定吸光度（A）值。
1.4.3 细胞黏附及活性观察
将两种补片剪成 1 cm×1 cm 的小块，60Co 灭菌备用。取第 3 代兔肌腱干细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化计数，加入含 20%FBS 的 DMEM 培养基重悬后，制备成浓度为 3×106个/mL 的细胞悬液，分别接种至两种补片上，每个补片 100 μL（即每个补片复合 3×105个细胞）；置于 37℃、5%CO2 培养箱孵育 2 h 后，加入含 20%FBS 的 DMEM 培养基，返回培养箱继续培养。 3 d 后取出细胞-补片复合物，PBS 溶液清洗，按照死/活细胞染色试剂盒说明书进行死/活细胞染色，共聚焦激光扫描显微镜下观察肌腱干细胞在两组补片上的活性和黏附情况。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 两种补片理化表征观测
2.1.1 大体及微观结构观测
大体观察示，两组补片均呈乳白色，表面光滑，无明显粗糙、颗粒感，PCL/Ⅰ型胶原补片略宽于单纯 PCL 补片。见图 1。扫描电镜观察示，两种补片纤维均呈取向性排列，但 PCL/Ⅰ型胶原补片纤维排列取向稍差。对照组补片的纤维直径为（1.376 3±0.290 2）μm，显著高于实验组的（0.247 9±0.061 0）μm，差异有统计学意义（t=26.907，P=0.000）。见图 2。实验组补片纤维孔隙率为 56.44%±12.70%，显著高于对照组的 41.33%±11.41%，差异有统计学意义（t=2.506，P=0.032）。
图1
两种补片大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure1. Gross observation of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
图2
两种补片扫描电镜观察（×800）
a. 对照组；b. 实验组
Figure2. Scanning electron microscope observation of the two patches (×800)a. Control group; b. Experimental group
2.1.2 力学性能检测
对照组和实验组补片的纤维拉伸强度分别为（11.84±2.80）、（23.35±4.59）MPa，杨氏模量分别为（89.90±21.92）、（145.39±12.54）MPa，比较差异均有统计学意义（t=3.705，P=0.029；t=4.064，P=0.034）。
2.1.3 红外光谱分析
对照组补片中存在 1 725 cm−1处的羰基和 1 165 cm−1处的 C−O 键两个特征吸收峰（均为 PCL 的特征性吸收峰），以及一些相对矮小的吸收峰；实验组补片中除发现上述对照组补片的吸收峰外，还存在 1 653 cm−1、1 547 cm−1、3 310 cm−1 3 个特征峰（分别对应−C=C−、−NO2、−C≡C−H 特征基团，均为Ⅰ型胶原的特征性吸收峰）。见图 3。
图3
两种补片红外光谱图
Figure3.
Fourier transform infrared spectroscopy of the two patches
2.1.4 表面接触角检测
实验组补片表面接触角为（73.88±4.97）°，为亲水的；而对照组补片表面接触角为（128.46±5.10）°，为疏水的；两组表面接触角比较差异有统计学意义（t=21.705，P=0.002）。见图 4。
图4
两种补片的表面接触角
a. 对照组；b. 实验组
Figure4. The water contact angle of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
2.2 两种补片的生物性能评估
2.2.1 CCK-8法检测细胞活性
随培养时间延长，各组细胞 A 值均逐渐增加，各时间点实验组和对照组 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）；两组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
CCK-8法检测各组细胞活性
Figure5.
The cytotoxicity of each group by CCK-8 method
2.2.2 细胞黏附及活性观察
共聚焦激光扫描显微镜观察示，培养 3 d，兔肌腱干细胞在两种补片表面均可黏附、生长，实验组补片表面黏附的细胞数量多于对照组，且活性更好。见图 6。
图6
死/活细胞染色观察兔肌腱干细胞在两种补片表面的黏附及活性（共聚焦激光扫描显微镜×200）
a. 对照组；b. 实验组
Figure6. Adhesion and activity of rabbit tendon stem cells on the surface of the two patches observed by dead/living cell staining (Laser confocal scanning microscopy×200)a. Control group;b. Experimental group
3 讨论
肌腱连接肌肉和骨骼，在应力传递和关节稳定性方面起着至关重要的作用[15]。然而肌腱组织极易受到损伤，由于细胞外基质密度高，胶原组织、血管通透性差，其再生倾向较低。组织工程技术的发展为肌腱再生修复提供了新的途径。通过组织工程理念设计出一种新型肩袖补片，具有强大的机械强度，同时可以促进迁延而来的 BMSCs 以及激活的肌腱干细胞向肌腱细胞分化，为损伤肌腱提供良好微环境，成为临床发展的新方向。静电纺丝技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片为功能性修复损伤的肩袖带来了新的希望。
本研究扫描电镜结果表明，静电纺丝技术可以制备直径为微米级的有序排列的纤维丝，且纤维丝之间孔隙良好。文献报道静电纺丝中，微米纤维和纳米纤维的组合可产生更大的孔隙互连性和更大孔径，从而导致更好的细胞渗透[16]。Orr 等[17]研究发现，与无序的纤维相比，多层有序排列的 PCL 静电纺丝支架可模仿天然肌腱组织的各向异性，显著增加了细胞浸润，促进了间充质细胞的腱系分化，并提高了肌腱细胞外基质生成。Lomas 等[18]发现有序的静电纺丝纤维增加了肌腱样组织生成，虽然新生成的组织与天然组织相比更薄，机械性能更弱，但是支架的机械刺激促进更多有序的胶原纤维生成，大大增加了支架强度。多孔结构的静电纺丝纳米纤维补片有利于组织之间的物质交换，可以更好地促进肌腱愈合。通过力学检测可以发现，PCL/Ⅰ型胶原补片的拉伸强度和杨氏模量均强于单纯 PCL 补片，说明加入Ⅰ型胶原可以显著提高补片的力学性能。这也证实了当纺丝纤维中加入明胶、几丁质、胶原等材料时，静电纺丝材料的力学性能增强[19]。红外光谱分析结果显示，PCL/Ⅰ型胶原补片的吸收峰与单纯 PCL 补片相比发生了变化，说明Ⅰ型胶原和 PCL 成功混合，并未在纺丝过程中丢失，且两者未发生化学反应。Qiu 等[20]发现，Ⅰ型胶原支架与机械刺激共同作用可以促进人 MSCs 向成纤维细胞分化，所以我们认为 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片比单纯 PCL 补片更适合肩袖损伤的再生修复。
由于补片将被用来修复肩袖损伤，材料表面为亲水性更有利于细胞黏附和增殖，所以测定其亲水性十分必要[21]。Ghosal 等[22]研究发现，将胶原和 PCL 混合后材料的亲水性有所提高，表面接触角降低。本研究结果显示，PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片的表面接触角显著小于单纯 PCL 补片，说明Ⅰ型胶原的加入可以增加材料的亲水性，更有利于细胞黏附。Kopf 等[23]提出，亲水性材料表面可增加单位时间内细胞在材料表面的黏附数量，并进一步通过整合素介导细胞外基质等蛋白的黏附。本研究 CCK-8 细胞增殖与毒性实验进一步表明两种补片均无细胞毒性，对细胞的增殖无明显抑制作用。细胞-补片复合物共聚焦激光扫描显微镜观察结果也提示，PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片较单纯 PCL 补片更容易使细胞黏附、生长。
综上述，利用静电纺丝技术制备的 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片可仿生天然组织的胶原纤维排列，一定程度实现了肌腱生物力学的各向异性；且 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片具有优良的理化性能，可以使细胞更好地黏附同时保持良好活性，未来可能作为肩袖修复理想的组织工程补片。但本实验只检测了在体外环境下 PCL/Ⅰ型胶原纳米纤维补片的性能，尚需进一步动物实验验证其促进肌腱愈合的能力。
