引用本文： 卢昌怀, 刘志军, 张宏波, 段扬, 曹延林. p38 丝裂原活化蛋白激酶通路介导 TGF-β1/结缔组织生长因子调控人腰椎黄韧带增生肥厚的机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(6): 730-735. doi: 10.7507/1002-1892.201811140 复制
人腰椎黄韧带肥厚导致的腰椎管狭窄症是临床常见疾病之一[1]，黄韧带增生肥厚是细胞微结构损伤后产生的瘢痕炎性反应[2]。TGF-β1 是损伤修复过程中作用最为显著的因子之一，可以激活黄韧带细胞中胶原蛋白的表达[3]，在黄韧带组织纤维化中，可能在损伤、炎症及纤维化之间起到一定的连接作用。而在腰椎肥厚的黄韧带中，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达增加，同时参与了黄韧带增生肥厚的过程[4]。有研究表明 TGF-β1、CTGF 可促进细胞外基质成分表达增加，TGF-β1 通过 CTGF 协同促进黄韧带细胞增生[5-6]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路是与创伤愈合相关的胞内信号传导通路，许多应急原可以刺激 MAPK 通路使其活化，如机械创伤、活性氧、病原微生物刺激等[7]。近年也有研究发现 MAPK 通路参与了 CTGF 的表达调控[8-9]。目前，在哺乳动物细胞中已鉴定出 4 条 MAPK 信号传导通路：细胞外调节蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1 ）通路、ERK2 通路、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38 通路，其中 p38 和 ERK 是促纤维活性信号，JNK 是抑制纤维活性信号。因此，本研究通过筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路，利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达，初步探讨 MAPK 通路在 TGF-β1 调控 CTGF 表达过程中的作用，为临床治疗黄韧带肥厚导致的腰椎管狭窄症奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 人腰椎黄韧带细胞的分离与培养
黄韧带组织由南方医科大学珠江医院 13 例行腰椎间盘突出髓核摘除术患者自愿捐赠，术前均经影像学检查确定无明显黄韧带增生。采用胶原酶预消化组织块培养法[10-11]分离培养得到黄韧带细胞。经鉴定，所培养的黄韧带细胞具有典型的成纤维细胞样表型，传代细胞增殖良好，不同传代细胞在同一时间点无明显差别。本研究取第 3 代对数生长期细胞进行实验。
1.2 主要试剂及仪器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美国）；JNK 通路阻断剂 SP600125、ERK 通路阻断剂 PD98059、p38 通路阻断剂 SB203580（EMD Biochemicals 公司，美国）；兔抗磷酸化 p38（phosphorylation p38，p-p38）单克隆抗体、兔抗 p38 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒、逆转录试剂盒（DBI 公司，德国）；人 p38 MAPK 特异性 siRNA 序列 355、513、714、空白对照（negative control，NC）（上海吉码制药技术有限公司）；山羊抗兔 IgG 二抗溶液（BOSTER 公司，美国）；DNase Ⅰ、RNasin（Promega 公司，美国）；RNA 提取试剂 Trizol（Takara 公司，日本）。 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 仪（Agilent 公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备公司）；UV-1206 分光光度仪（Shimodzu 公司，日本）；SCR20B 冷冻离心机（Hitachi 公司，日本）；TGL-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；水平式电泳仪（北京东方仪器厂）。
1.3 筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路
黄韧带细胞以 0.2% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化形成细胞悬液，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 3 min，收集细胞，以 1×104个/mL 密度接种于 96 孔板。常规培养 24 h 后更换无血清 DMEM 进一步处理 24 h，将细胞分为 5 组：DMEM 组为无血清 DMEM 组；TGF-β1 组单纯加入 3 ng/mL TGF-β1 刺激；PD98059 组、SP600125 组和 SB203580 组分别加入 10 μmol/L 相应通路阻断剂，1 h 后加入 3 ng/mL TGF-β1 处理 24 h。24 h 后分别收集各组细胞，常规消化细胞后，PBS 洗涤 2 次，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 3 min 后加入 1.5 mL EP 管中，按步骤提取 RNA，使用 RNase-free 的 DNase Ⅰ配置反应液。以 2 μg 总 RNA 为模板，按照逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系，总体系 20 μL，合成 cDNA 第 1 链，并收集备用。配制 qPCR 扩增的反应体系，进行 PCR 检测。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环；融解曲线分析：温度 62～95℃。用 2−ΔΔCt法计算各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次。
1.4 siRNA 干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达观测
1.4.1 筛选进行细胞转染的最终 siRNA 序列
黄韧带细胞按 1×104个/mL 密度接种于 96 孔板，24 h 后换无血清 DMEM 培养基继续培养过夜，进行 4 种 p38 MAPK 特异性 siRNA 序列（355、513、714、NC）转染，分别为 355 序列组、513 序列组、714 序列组、对照组。转染方法：细胞转染前 1 d，将黄韧带细胞以 2.5×105个/孔密度接种至含 2 mL 完全培养基（含 10%～20%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的基础培养基）的 6 孔板中，室温培养，使转染时细胞密度达 50%～70%。在 250 μL DMEM 无血清、无抗生素培养基中加入 8 μL siRNA，柔和混匀；在 250 μL DMEM 无血清、无抗生素培养基中加入 10 μL Lipofectamine，柔和混匀，室温放置 5 min；将稀释的 siRNA 和 Lipofectamine 试剂混合，柔和混匀，室温放置 20 min，形成 siRNA/Lipofectamine 复合物；将 100 μL siRNA/Lipofectamine 复合物加入含有细胞和培养基的培养板孔中，来回轻柔摇晃培养板。将细胞培养板放入 37℃、5%CO2 培养箱中温育 4 h 后，除去复合物，更换无血清 DMEM 培养基，放入培养箱中继续培养。24 h 后取转染后的细胞，以 qRT-PCR 检测 p38 mRNA 相对表达量，取表达量最少的 siRNA 序列作为最终序列。实验重复 3 次，取均值。
1.4.2 实验分组
将黄韧带细胞分为 A、B、C、D 组，分别以 siRNA（对照）、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1 转染细胞。按 1.4.1 中筛选的最终 siRNA 序列进行转染。
1.4.3 免疫荧光染色观察
各组转染 24 h 后制作细胞爬片，待细胞生长至 70%～80% 融合时，应用 3 ng/mL TGF-β1 刺激 6 h；终止刺激，冷丙酮固定 20 min。PBS 处理 3 次，每次 5 min；PBS-Triton X-100 通透 20 min，再次 PBS 处理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封闭 30 min，滴加一抗 （以 1∶100 比例稀释的兔抗 p-p38、p38 抗体），4℃ 过夜；PBS 处理 3 次，每次 5 min；37℃ 孵育二抗 30 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常温染色 10 min，晾干，抗荧光淬灭封片剂封片，4℃ 保存，荧光倒置显微镜下观察。
1.4.4 qRT-PCR 检测
转染 24 h 后收集各组细胞，常规消化细胞，按 1.3 方法行 qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次。
1.4.5 Western blot 检测
转染 24 h 后收集各组细胞（每组约 1×107个），加入 0.5 mL 裂解液，按步骤提取样本总蛋白并对蛋白定量，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜分别放入装有 3 mL CTGF（1∶1 000，转膜条件：300 mA 恒流转膜 38 min）溶液的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 1 h；再将 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 40 min；洗涤 PVDF 膜进行化学发光、显影、定影。将胶片进行扫描，用 Image-Pro Plus 6.0 图像处理系统分析条带吸光度（A）值。以 GAPDH 为内参，将 CTGF 与 GAPDH 的 A 值比值作为 CTGF 蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路
TGF-β1 组、PD98059 组和 SP600125 组黄韧带细胞中 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量均显著高于 SB203580 组和 DMEM 组，差异有统计学意义（P<0.05）；TGF-β1 组、PD98059 组、SP600125 组间以及 SB203580 组、DMEM 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量（n=3，
）
Table1.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.2 siRNA 干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达观测
2.2.1 筛选进行细胞转染的最终 siRNA 序列
qRT-PCR 检测示，对照组、355 序列组、513 序列组和 714 序列组的 p38 mRNA 相对表达量分别为 1.00±0.00、0.49±0.04、0.65±0.05、0.26±0.01，其中 714 序列组表达量最小，故选择含 714 序列作为 siRNA 转染的最终序列。
2.2.2 免疫荧光染色观察
荧光倒置显微镜观察示，A 组细胞染色呈阳性，但细胞质染色弱，有 p38、p-p38 表达；B 组细胞染色呈阴性，无 p38、p-p38 表达；而 C、D 组细胞染色均呈阳性，其中C 组染色为强阳性；两组均强于 A 组。见图 1。
图1
免疫荧光染色观察各组 p38 和 p-p38 表达（荧光倒置显微镜×100）
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. p38；b. p-p38
Figure1. The expressions of p38 and p-p38 on cells detected by immunofluorescence staining (Fluorescence inverted microscope×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. p38; b. p-p38
2.2.3 qRT-PCR 检测
与 A 组相比，B 组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量显著减少，C、D 组显著增加；D 组较 C 组减少；组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量（n=3，
）
Table2.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.2.4 Western blot 检测
A、B、C、D 组 CTGF 蛋白相对表达量分别为 0.33±0.02、0.05±0.01、0.64±0.01、0.29±0.02，B 组显著低于 A 组，C 组显著高于 A、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测各组 CTGF 蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure2. Protein expression of CTGF detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
Smads 通路和 MAPK 通路在组织损伤愈合及瘢痕形成中起重要作用。Smads 通路是公认的 TGF-β1 胞内传导途径[12]，Smads 是近年来发现的新的细胞内传导蛋白，它是目前唯一已被证实的 TGF-β1 受体作用的底物。研究显示[13]，Smads 通路在 TGF-β1 的作用下表达并活化，表明 Smads 通路参与 CTGF 表达上调的过程，CTGF 基因启动子中也有 Smads 结合元件，位于启动序列 167～174 之间，该元件出现突变体时，也能完全消除 CTGF 的表达及 TGF-β1 诱导的 CTGF 表达。但有研究显示，并不是所有组织细胞中 CTGF 的上调表达都依赖 Smads 通路[14]。由于 MAPK 通路并不影响 Smads 通路的磷酸化，因此可能是 MAPK 通路和 Smads 通路共同参与了 TGF-β1 调节 CTGF 表达的过程[15]。近年也有研究发现 MAPK 通路参与 CTGF 的表达调控[8]。p38 MAPK 通路是生物信号引起核反应的重要通路，是 MAPK 家系亚家族中的重要成员；它由 360 个氨基酸组成，可以应激活化蛋白激酶，是经典的 MAPK 通路。p38 MAPK 通路在细胞生长、死亡、细胞周期、炎症及其应激反应的调控中起着至关重要的作用[16]，可被紫外线、促炎细胞因子激活[17-18]。p38 MAPK 存在 6 种不同异构体，不同的 p38 MAPK 异构体在体内分布、上游激酶调节、下游作用底物以及对细胞外不同刺激的反应各有不同。而不同异构体之间对底物作用的特异性和选择性，可能影响着细胞信号传导的特异性。在同一细胞内，也存在着不同的 p38 MAPK 异构体，这些异构体在细胞内定位的差异，可能是 p38 MAPK 在不同细胞中介导不同生物学效应的机制之一[19-20]。因此我们设想 MAPK 通路是否参与了腰椎黄韧带增生肥厚过程中 TGF-β1 调节 CTGF 表达的过程，阻断通路能否抑制腰椎黄韧带增生肥厚。
本研究结果显示，加入 TGF-β1 可增加 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达，加入 ERK 通路阻断剂 PD98059 或 JNK 通路阻断剂 SP600125 再加入 TGF-β1 后，仍表达较高的 mRNA 水平；而加入 p38 通路阻断剂 SB203580 再加入 TGF-β1 后，CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达明显降低，与 DMEM 组水平近似，说明在 MAPK 通路中，p38 是 TGF-β1 调控 CTGF 表达的特异性信号通路。本研究进一步采用 siRNA 干扰技术进行 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 检测，结果显示 siRNA 可沉默黄韧带细胞内的 p38 MAPK 信号通路，使其无法发挥调控功能，导致 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达明显减少，CTGF 蛋白的表达也同样受限；再次说明 p38 MAPK 通路与 CTGF 蛋白的表达相关。而加入外源性 TGF-β1 后，受到抑制的 CTGF 表达再次上调，说明 TGF-β1 可以增加 p38、p-p38 生成，并通过 p38 MAPK 通路的作用进一步调节 CTGF 表达。
综上述，本研究结果表明在人腰椎黄韧带细胞中，TGF-β1/CTGF 共同参与了细胞增生肥厚的过程，而且是通过 p38 MAPK 通路途径完成的。剔除 p38 MAPK 基因，可以抑制 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的产生，从而减少黄韧带细胞增生肥厚的发生，为药物治疗黄韧带肥厚引起的腰椎管狭窄提供了新的选择。但本研究仅对黄韧带增生肥厚机制进行了初步探讨，需进一步开展调控机制的相关研究。
人腰椎黄韧带肥厚导致的腰椎管狭窄症是临床常见疾病之一[1]，黄韧带增生肥厚是细胞微结构损伤后产生的瘢痕炎性反应[2]。TGF-β1 是损伤修复过程中作用最为显著的因子之一，可以激活黄韧带细胞中胶原蛋白的表达[3]，在黄韧带组织纤维化中，可能在损伤、炎症及纤维化之间起到一定的连接作用。而在腰椎肥厚的黄韧带中，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达增加，同时参与了黄韧带增生肥厚的过程[4]。有研究表明 TGF-β1、CTGF 可促进细胞外基质成分表达增加，TGF-β1 通过 CTGF 协同促进黄韧带细胞增生[5-6]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路是与创伤愈合相关的胞内信号传导通路，许多应急原可以刺激 MAPK 通路使其活化，如机械创伤、活性氧、病原微生物刺激等[7]。近年也有研究发现 MAPK 通路参与了 CTGF 的表达调控[8-9]。目前，在哺乳动物细胞中已鉴定出 4 条 MAPK 信号传导通路：细胞外调节蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1 ）通路、ERK2 通路、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38 通路，其中 p38 和 ERK 是促纤维活性信号，JNK 是抑制纤维活性信号。因此，本研究通过筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路，利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达，初步探讨 MAPK 通路在 TGF-β1 调控 CTGF 表达过程中的作用，为临床治疗黄韧带肥厚导致的腰椎管狭窄症奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 人腰椎黄韧带细胞的分离与培养
黄韧带组织由南方医科大学珠江医院 13 例行腰椎间盘突出髓核摘除术患者自愿捐赠，术前均经影像学检查确定无明显黄韧带增生。采用胶原酶预消化组织块培养法[10-11]分离培养得到黄韧带细胞。经鉴定，所培养的黄韧带细胞具有典型的成纤维细胞样表型，传代细胞增殖良好，不同传代细胞在同一时间点无明显差别。本研究取第 3 代对数生长期细胞进行实验。
1.2 主要试剂及仪器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美国）；JNK 通路阻断剂 SP600125、ERK 通路阻断剂 PD98059、p38 通路阻断剂 SB203580（EMD Biochemicals 公司，美国）；兔抗磷酸化 p38（phosphorylation p38，p-p38）单克隆抗体、兔抗 p38 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒、逆转录试剂盒（DBI 公司，德国）；人 p38 MAPK 特异性 siRNA 序列 355、513、714、空白对照（negative control，NC）（上海吉码制药技术有限公司）；山羊抗兔 IgG 二抗溶液（BOSTER 公司，美国）；DNase Ⅰ、RNasin（Promega 公司，美国）；RNA 提取试剂 Trizol（Takara 公司，日本）。 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 仪（Agilent 公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备公司）；UV-1206 分光光度仪（Shimodzu 公司，日本）；SCR20B 冷冻离心机（Hitachi 公司，日本）；TGL-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；水平式电泳仪（北京东方仪器厂）。
1.3 筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路
黄韧带细胞以 0.2% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化形成细胞悬液，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 3 min，收集细胞，以 1×104个/mL 密度接种于 96 孔板。常规培养 24 h 后更换无血清 DMEM 进一步处理 24 h，将细胞分为 5 组：DMEM 组为无血清 DMEM 组；TGF-β1 组单纯加入 3 ng/mL TGF-β1 刺激；PD98059 组、SP600125 组和 SB203580 组分别加入 10 μmol/L 相应通路阻断剂，1 h 后加入 3 ng/mL TGF-β1 处理 24 h。24 h 后分别收集各组细胞，常规消化细胞后，PBS 洗涤 2 次，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 3 min 后加入 1.5 mL EP 管中，按步骤提取 RNA，使用 RNase-free 的 DNase Ⅰ配置反应液。以 2 μg 总 RNA 为模板，按照逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系，总体系 20 μL，合成 cDNA 第 1 链，并收集备用。配制 qPCR 扩增的反应体系，进行 PCR 检测。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环；融解曲线分析：温度 62～95℃。用 2−ΔΔCt法计算各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次。
1.4 siRNA 干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达观测
1.4.1 筛选进行细胞转染的最终 siRNA 序列
黄韧带细胞按 1×104个/mL 密度接种于 96 孔板，24 h 后换无血清 DMEM 培养基继续培养过夜，进行 4 种 p38 MAPK 特异性 siRNA 序列（355、513、714、NC）转染，分别为 355 序列组、513 序列组、714 序列组、对照组。转染方法：细胞转染前 1 d，将黄韧带细胞以 2.5×105个/孔密度接种至含 2 mL 完全培养基（含 10%～20%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的基础培养基）的 6 孔板中，室温培养，使转染时细胞密度达 50%～70%。在 250 μL DMEM 无血清、无抗生素培养基中加入 8 μL siRNA，柔和混匀；在 250 μL DMEM 无血清、无抗生素培养基中加入 10 μL Lipofectamine，柔和混匀，室温放置 5 min；将稀释的 siRNA 和 Lipofectamine 试剂混合，柔和混匀，室温放置 20 min，形成 siRNA/Lipofectamine 复合物；将 100 μL siRNA/Lipofectamine 复合物加入含有细胞和培养基的培养板孔中，来回轻柔摇晃培养板。将细胞培养板放入 37℃、5%CO2 培养箱中温育 4 h 后，除去复合物，更换无血清 DMEM 培养基，放入培养箱中继续培养。24 h 后取转染后的细胞，以 qRT-PCR 检测 p38 mRNA 相对表达量，取表达量最少的 siRNA 序列作为最终序列。实验重复 3 次，取均值。
1.4.2 实验分组
将黄韧带细胞分为 A、B、C、D 组，分别以 siRNA（对照）、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1 转染细胞。按 1.4.1 中筛选的最终 siRNA 序列进行转染。
1.4.3 免疫荧光染色观察
各组转染 24 h 后制作细胞爬片，待细胞生长至 70%～80% 融合时，应用 3 ng/mL TGF-β1 刺激 6 h；终止刺激，冷丙酮固定 20 min。PBS 处理 3 次，每次 5 min；PBS-Triton X-100 通透 20 min，再次 PBS 处理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封闭 30 min，滴加一抗 （以 1∶100 比例稀释的兔抗 p-p38、p38 抗体），4℃ 过夜；PBS 处理 3 次，每次 5 min；37℃ 孵育二抗 30 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常温染色 10 min，晾干，抗荧光淬灭封片剂封片，4℃ 保存，荧光倒置显微镜下观察。
1.4.4 qRT-PCR 检测
转染 24 h 后收集各组细胞，常规消化细胞，按 1.3 方法行 qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次。
1.4.5 Western blot 检测
转染 24 h 后收集各组细胞（每组约 1×107个），加入 0.5 mL 裂解液，按步骤提取样本总蛋白并对蛋白定量，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜分别放入装有 3 mL CTGF（1∶1 000，转膜条件：300 mA 恒流转膜 38 min）溶液的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 1 h；再将 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 40 min；洗涤 PVDF 膜进行化学发光、显影、定影。将胶片进行扫描，用 Image-Pro Plus 6.0 图像处理系统分析条带吸光度（A）值。以 GAPDH 为内参，将 CTGF 与 GAPDH 的 A 值比值作为 CTGF 蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 筛选参与 TGF-β1/CTGF 调控黄韧带肥厚的 MAPK 通路
TGF-β1 组、PD98059 组和 SP600125 组黄韧带细胞中 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量均显著高于 SB203580 组和 DMEM 组，差异有统计学意义（P<0.05）；TGF-β1 组、PD98059 组、SP600125 组间以及 SB203580 组、DMEM 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量（n=3，）
Table1.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.2 siRNA 干扰 p38 MAPK 通路调控黄韧带细胞中 TGF-β1/CTGF 表达观测
2.2.1 筛选进行细胞转染的最终 siRNA 序列
qRT-PCR 检测示，对照组、355 序列组、513 序列组和 714 序列组的 p38 mRNA 相对表达量分别为 1.00±0.00、0.49±0.04、0.65±0.05、0.26±0.01，其中 714 序列组表达量最小，故选择含 714 序列作为 siRNA 转染的最终序列。
2.2.2 免疫荧光染色观察
荧光倒置显微镜观察示，A 组细胞染色呈阳性，但细胞质染色弱，有 p38、p-p38 表达；B 组细胞染色呈阴性，无 p38、p-p38 表达；而 C、D 组细胞染色均呈阳性，其中C 组染色为强阳性；两组均强于 A 组。见图 1。
图1
免疫荧光染色观察各组 p38 和 p-p38 表达（荧光倒置显微镜×100）
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. p38；b. p-p38
Figure1. The expressions of p38 and p-p38 on cells detected by immunofluorescence staining (Fluorescence inverted microscope×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. p38; b. p-p38
2.2.3 qRT-PCR 检测
与 A 组相比，B 组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量显著减少，C、D 组显著增加；D 组较 C 组减少；组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
qRT-PCR 检测各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量（n=3，）
Table2.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.2.4 Western blot 检测
A、B、C、D 组 CTGF 蛋白相对表达量分别为 0.33±0.02、0.05±0.01、0.64±0.01、0.29±0.02，B 组显著低于 A 组，C 组显著高于 A、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测各组 CTGF 蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure2. Protein expression of CTGF detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
Smads 通路和 MAPK 通路在组织损伤愈合及瘢痕形成中起重要作用。Smads 通路是公认的 TGF-β1 胞内传导途径[12]，Smads 是近年来发现的新的细胞内传导蛋白，它是目前唯一已被证实的 TGF-β1 受体作用的底物。研究显示[13]，Smads 通路在 TGF-β1 的作用下表达并活化，表明 Smads 通路参与 CTGF 表达上调的过程，CTGF 基因启动子中也有 Smads 结合元件，位于启动序列 167～174 之间，该元件出现突变体时，也能完全消除 CTGF 的表达及 TGF-β1 诱导的 CTGF 表达。但有研究显示，并不是所有组织细胞中 CTGF 的上调表达都依赖 Smads 通路[14]。由于 MAPK 通路并不影响 Smads 通路的磷酸化，因此可能是 MAPK 通路和 Smads 通路共同参与了 TGF-β1 调节 CTGF 表达的过程[15]。近年也有研究发现 MAPK 通路参与 CTGF 的表达调控[8]。p38 MAPK 通路是生物信号引起核反应的重要通路，是 MAPK 家系亚家族中的重要成员；它由 360 个氨基酸组成，可以应激活化蛋白激酶，是经典的 MAPK 通路。p38 MAPK 通路在细胞生长、死亡、细胞周期、炎症及其应激反应的调控中起着至关重要的作用[16]，可被紫外线、促炎细胞因子激活[17-18]。p38 MAPK 存在 6 种不同异构体，不同的 p38 MAPK 异构体在体内分布、上游激酶调节、下游作用底物以及对细胞外不同刺激的反应各有不同。而不同异构体之间对底物作用的特异性和选择性，可能影响着细胞信号传导的特异性。在同一细胞内，也存在着不同的 p38 MAPK 异构体，这些异构体在细胞内定位的差异，可能是 p38 MAPK 在不同细胞中介导不同生物学效应的机制之一[19-20]。因此我们设想 MAPK 通路是否参与了腰椎黄韧带增生肥厚过程中 TGF-β1 调节 CTGF 表达的过程，阻断通路能否抑制腰椎黄韧带增生肥厚。
本研究结果显示，加入 TGF-β1 可增加 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达，加入 ERK 通路阻断剂 PD98059 或 JNK 通路阻断剂 SP600125 再加入 TGF-β1 后，仍表达较高的 mRNA 水平；而加入 p38 通路阻断剂 SB203580 再加入 TGF-β1 后，CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达明显降低，与 DMEM 组水平近似，说明在 MAPK 通路中，p38 是 TGF-β1 调控 CTGF 表达的特异性信号通路。本研究进一步采用 siRNA 干扰技术进行 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 检测，结果显示 siRNA 可沉默黄韧带细胞内的 p38 MAPK 信号通路，使其无法发挥调控功能，导致 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 表达明显减少，CTGF 蛋白的表达也同样受限；再次说明 p38 MAPK 通路与 CTGF 蛋白的表达相关。而加入外源性 TGF-β1 后，受到抑制的 CTGF 表达再次上调，说明 TGF-β1 可以增加 p38、p-p38 生成，并通过 p38 MAPK 通路的作用进一步调节 CTGF 表达。
综上述，本研究结果表明在人腰椎黄韧带细胞中，TGF-β1/CTGF 共同参与了细胞增生肥厚的过程，而且是通过 p38 MAPK 通路途径完成的。剔除 p38 MAPK 基因，可以抑制 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的产生，从而减少黄韧带细胞增生肥厚的发生，为药物治疗黄韧带肥厚引起的腰椎管狭窄提供了新的选择。但本研究仅对黄韧带增生肥厚机制进行了初步探讨，需进一步开展调控机制的相关研究。
